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Developing culture conditions to study keratocyte phenotypes in vitro

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Material Information

Title:
Developing culture conditions to study keratocyte phenotypes in vitro
Physical Description:
Book
Language:
English
Creator:
Musselmann, Kurt
Publisher:
University of South Florida
Place of Publication:
Tampa, Fla
Publication Date:

Subjects

Subjects / Keywords:
Stroma
Cornea
Insulin
Collagen
Keratocan
Chromatography
Dissertations, Academic -- Molecular Medicine -- Doctoral -- USF   ( lcsh )
Genre:
bibliography   ( marcgt )
theses   ( marcgt )
non-fiction   ( marcgt )

Notes

Abstract:
ABSTRACT: The corneal wound healing response involves the activation of keratocytes to proliferate from a quiescent phenotype. The mitogens that cause the initial transformation of the quiescent keratocytes to the active phenotype have not been identified. Even though serum is commonly used to replicate this in vitro, the cornea is avascular and therefore likely not exposed to serum. In the first part of this dissertation, a DMEM/F12 extract of corneal stromas was made and shown to stimulate keratocyte proliferation in both a dose-dependent and cell-density dependent manner. This extract contains mitogens that differ from the mitogens present in serum based on their effect on keratocytes and their biochemical characteristics. Culture in extract replicates in vitro the changes observed during the activation of keratocytes in the wound-healing phase.The corneal stroma contains an extensive extracellular matrix that consists primarily of collagens and proteolgycans.^ ^This matrix is maintained and secreted by the keratocytes, cells with unique characteristics lost during the activation observed at wound healing. The second part of this dissertation aims to develop a defined culture medium that maintains the keratocyte phenotype during proliferation. Keratocytes were cultured in serum-free medium and the effect of the growth factors on the markers for the keratocyte phenotype determined. Only insulin was shown to stimulate cell proliferation in a consistent manner, while maintaining commonly accepted keratocyte markers. When this defined culture medium was supplemented with ascorbic acid to study collagen synthesis, a marked increase in both collagen synthesis and keratan sulfate proteoglycan accumulation was measured.^ ^This newly developed culture medium, containing insulin and ascorbate, allows for cell growth, maintains the keratocyte markers, and could be used to study the native, non-activated keratocyte phenotype in culture.This dissertation shows that the culture media described herein replicate in vitro all the phenotypes observed during the corneal wound healing response in vivo. These culture media, in turn, could be used to obtain more knowledge about the different keratocyte phenotypes, and how they could be manipulated in culture. (329 words)
Thesis:
Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2006.
Bibliography:
Includes bibliographical references.
System Details:
System requirements: World Wide Web browser and PDF reader.
System Details:
Mode of access: World Wide Web.
Statement of Responsibility:
by Kurt Musselmann.
General Note:
Title from PDF of title page.
General Note:
Document formatted into pages; contains 182 pages.
General Note:
Includes vita.

Record Information

Source Institution:
University of South Florida Library
Holding Location:
University of South Florida
Rights Management:
All applicable rights reserved by the source institution and holding location.
Resource Identifier:
aleph - 001930907
oclc - 213468345
usfldc doi - E14-SFE0001726
usfldc handle - e14.1726
System ID:
SFS0026044:00001


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Full Text

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D e v e l o p i n g C u l t u r e C o n d i t i o n s t o S t u d y K e r a t o c y t e P h e n o t y p e s i n V i t r o b y K u r t M u sse l m a n n A d i sse r t a t i o n su b m i t t e d i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D o ct o r o f P h i l o so p h y D e p a r t m e n t o f M o l e cu l a r M e d i ci n e C o l l e g e o f M e d i ci n e U n i ve r si t y o f S o u t h F l o r i d a M a j o r P r o f e sso r : Jo h n R H a ss e l l P h D G e o r g e B l a n ck, P h D C r a i g D o u p n i k, P h D G l o r i a F e r r e i r a P h D D a t e o f A p p r o va l : A u g u st 1 1 2 0 0 6 K e yw o r d s: st r o m a co r n e a i n su l i n co l l a g e n ke r a t o ca n ch r o m a t o g r a p h y C o p yr i g h t 2 0 0 6 K u r t M u ss e l m a n n

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D E D I C A T I O N P a p i D u w e i sst w i e i ch D i ch ve r m i sse a b e r D u b i st j a i m m e r b e i m e i n e r S e i t e A n m e i n e F a m i l i e e n d l i ch i s e s so w e i t

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A C K N O W L E D G E M E N T S I w o u l d l i ke t o t h a n k se ve r a l p e o p l e f o r t h e i r s u p p o r t a n d f r i e n d sh i p t h r o u g h o u t m y e d u ca t i o n I w o u l d f i r st l i ke t o t h a n k m y f a m i l y, m o st n o t a b l y m y f a t h e r a n d m y m o t h e r f o r t h e i r u n w a ve r i n g su p p o r t t h r o u g h o u t t h i s i m p o r t a n t p e r i o d i n m y l i f e I w o u l d l i ke t o t h a n k D r Jo h n R H a sse l l H e h a s b e e n a g r e a t m e n t o r o f f e r i n g s u p p o r t a n d s h a r i n g h i s kn o w l e d g e w i t h o u t h e si t a t i o n I a l so a p p r e ci a t e t h e f a ct t h a t h e st o o d u p f o r m e a n d d e f e n d e d m e e ve n t h o u g h a t t i m e s I m a d e l i f e d i f f i cu l t f o r h i m I a l so w a n t t o t h a n k D r P e t e r J N e a m e H e b e ca m e m o r e t h a n a m e n t o r t o m e I w i l l h o n e st l y sa y t h a t w e r e i t n o t f o r h i m I l i ke l y w o u l d n o t h a ve b e e n a b l e t o co m e b a ck a f t e r m y f a t h e r s p a ssi n g T h a n k yo u f o r y o u r f r i e n d sh i p yo u r g u i d a n ce a n d yo u r b r u t a l h o n e st y w h i ch a t t i m e s w a s h a r d t o d e a l w i t h b u t h e l p e d m e t o m o ve a l o n g I w a n t t o t h a n k B r i d g e t t e B e r r yh i l l ( n o w A l e xa n d r o u ) a n d B r a d l e y K a n e f o r t h e i r h e l p a n d su p p o r t d o i n g e xp e r i m e n t s a n d a l so t h e o t h e r m e m b e r s o f t h e l a b t h a t m a d e l i f e a t t i m e s e a si e r I w a n t t o t h a n k m a n y p e o p l e t h a t h e l p e d m e t h r o u g h o u t t h e se d i f f i cu l t y e a r s i n m y l i f e I d o n o t kn o w w h e r e I w o u l d b e h a d i t n o t b e e n f o r t h e m

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i T A B L E O F C O N T E N T S L I S T O F F I G U R E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i v L I S T O F A B B R E V I A T I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vi i i A B S T R A C T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 T H E C O R N E A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 T H E K E R A T O C Y T E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 C O R N E A L W O U N D H E A L I N G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 S P E C I F I C A I M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 P A P E R 1 : I S O L A T I O N O F A P U T A T I V E K E R A T O C Y T E A C T I V A T I N G F A C T O R F R O M T H E C O R N E A L S T R O M A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 S t r o m a l e xt r a ct p r e p a r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 K e r a t o cyt e i so l a t i o n a n d cu l t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 M e a su r e m e n t o f D N A syn t h e si s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 M o l e cu l a r si e v e ch r o m a t o g r a p h y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 H e a t i n a ct i va t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 D N A co n t e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 M i cr o m a ss c u l t u r e a n d B r d U l a b e l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 S t a t i st i ca l a n a l ysi s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 R E S U L T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6

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i i D I S C U S S I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 S U P P L E M E N T T O P A P E R 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 L I S T O F E X P E R I M E N T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 4 P A P E R 2 : M A I N T E N A N C E O F T H E K E R A T O C Y T E P H E N O T Y P E D U R I N G C E L L P R O L I F E R A T I O N S T I M U L A T E D B Y I N S U L I N . . . . . . . . . 7 9 S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 0 I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4 C h e m i ca l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4 C e l l cu l t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4 3 5 S O 4 i n co r p o r a t i o n i n t o p r o t e o g l yca n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 5 D N A q u a n t i t a t i o n a n d 3 H t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n . . . . . . . . . . . . 8 6 I m m u n o b l o t t i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 6 C e l l m o r p h o l o g y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 S t a t i st i ca l a n a l ysi s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8 R E S U L T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8 D I S C U S S I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1 P A P E R 3 : S T I M U L A T I O N O F C O L L A G E N S Y N T H E S I S B Y I N S U L I N A N D P R O T E O G L Y C A N A C C U M U L A T I O N B Y A S C O R B A T E I N B O V I N E K E R A T O C Y T E S I N V I T R O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 3 I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 4 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 C h e m i ca l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 C e l l cu l t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 D N A q u a n t i t a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 8 C e l l p r o l i f e r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 8 C o l l a g e n syn t h e si s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 8 C o l l a g e n h e l i x st a b i l i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 9

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i i i P r o t e o g l yca n syn t h e si s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 W e st e r n b l o t a n a l ysi s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 S t a t i st i ca l a n a l ysi s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 R E S U L T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 D I S C U S S I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 6 D I S C U S S I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 7 I D E N T I F I C A T I O N O F O N E O F T H E M I T O G E N S I N E X T R A C T . . . . . 1 4 4 C O N C L U D I N G R E M A R K S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 9 F U T U R E D I R E C T I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 1 R E F E R E N C E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 6 A P P E N D I X A M e t h o d t o p r e p a r e st r o m a l e xt r a ct . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 6 A B O U T T H E A U T H O R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E n d P a g e

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i v L I S T O F F I G U R E S I N T R O D U C T I O N F i g u r e 1 T h e C o r n e a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 F i g u r e 2 S t r o m a l o r g a n i za t i o n o f co l l a g e n s a n d p r o t e o g l yca n s . . . . . . . . . . . . . 6 F i g u r e 3 K e r a t o cyt e m o r p h o l o g y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 F i g u r e 4 A K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n 1 % P P H S f o r 6 d a y s B K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n 1 % P P H S p l u s 1 n g / m l T G F B . . . . . . . . . 1 7 F i g u r e 5 S cr a p e I n j u r y w o u n d h e a l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 P A P E R 1 F i g u r e 1 D o se r e sp o n se cu r v e o f st r o m a l e xt r a ct c o m p a r e d t o s e r u m . . . . . . 4 3 F i g u r e 2 E f f e ct o f f r e e zi n g o n e xt r a ct p o t e n cy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 F i g u r e 3 A n a l ysi s o f e n t r y i n t o S p h a s e b y ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n s e r u m a n d i n e xt r a ct . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 F i g u r e 4 G r o w t h r a t e s o f k e r a t o cy t e s cu l t u r e d f o r 1 2 d a ys . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 F i g u r e 5 E f f e ct o f p l a t i n g d e n si t y o n ke r a t o cyt e r e sp o n s e t o st r o m a l e xt r a ct a n d t o 1 0 % se r u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7 F i g u r e 6 M i cr o m a ss c u l t u r e w i t h B r d U l a b e l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 F i g u r e 7 P h a se c o n t r a s t i m a g e s o f ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n se r u m ( F B S ) a n d st r o m a l e xt r a ct ( S E ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9

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v F i g u r e 8 E f f e ct o f h e a t o n st r o m a l e x t r a ct a n d se r u m a c t i vi t y . . . . . . . . . . . . . 5 0 F i g u r e 9 C h r o m a t o g r a p h y o f se r u m a n d e xt r a ct o n S 3 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 S U P P L E M E N T T O P A P E R 1 F i g u r e 1 E f f e ct o f se r u m o n m i t o g e n i c p o t e n cy o f g r o w t h f a ct o r s . . . . . . . . . . 5 8 F i g u r e 2 S t i m u l a t i o n o f su l f a t e i n co r p o r a t i o n b y B S A A E f f e ct o f B S A o n su l f a t e i n co r p o r a t i o n b y ke r a t o cyt e s a t l o w a n d h i g h p l a t i n g d e n si t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1 B a n d C C h r o m a t o g r a m o f m e d i u m o f ce l l s cu l t u r e d i n e x t r a ct B S A o r S F M a t l o w ( B ) a n d h i g h ( C ) p l a t i n g d e n si t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 F i g u r e 3 M i t o g e n i c a ct i vi t y o f e xt r a ct s m a d e f r o m l e n s, vi t r e o u s a n d r e t i n a . . . 6 4 F i g u r e 4 S u l f a t e i n co r p o r a t i o n st i m u l a t e d b y e xt r a ct co m p a r e d t o se r u m . . . . 6 6 F i g u r e 5 E f f e ct o f T G F o n ke r a t o cyt e cu l t u r e s A C e l l m o r p h o l o g y o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a ct o r i n e xt r a ct w i t h T G F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 B W e st e r n b l o t s o f t h e m e d i u m o f d a y 1 d a y 4 a n d d a y 8 cu l t u r e s f o r S P A R C f i b r o n e ct i n a n d t h e ce l l l a ye r f o r a S M A . . . . . . . . . . . . 7 0 F i g u r e 6 G e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y A S 3 0 0 ch r o m a t o g r a p h y o f e xt r a ct i n l o w o r h i g h N a C l . . . . . . . . . . 7 3 B S 3 0 0 ch r o m a t o g r a p h y o f e xt r a ct u n d e r d i s so ci a t i n g co n d i t i o n s . . 7 4 F i g u r e 7 H e p a r i n a f f i n i t y ch r o m a t o g r a p h y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 F i g u r e 8 A n t i b o d y n e u t r a l i za t i o n o f st r o m a l e xt r a ct . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 8

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vi P A P E R 2 F i g u r e 1 T h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n b y ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e . . . . . . . . . . . . . . . 9 5 F i g u r e 2 M e a su r e m e n t o f D N A co n t e n t o f ke r a t o cyt e c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . 9 6 F i g u r e 3 R e p r e se n t a t i ve W e st e r n b l o t s o f ke r a t o cyt e s f o r A L D H a n d m e d i u m f o r ke r a t o ca n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 7 F i g u r e 4 A P i xe l d e n si t y o f A L D H co n t e n t o f t h e ce l l l a ye r s . . . . . . . . . . . . . . 9 9 B P i xe l d e n si t y o f ke r a t o ca n a cc u m u l a t i o n i n t h e m e d i u m . . . . . . . . 9 9 F i g u r e 5 S u p e r o se 6 g e l f i l t r a t i o n ch r o m a t o g r a p h y o f a c cu m u l a t e d p r o t e o g l yca n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 0 F i g u r e 6 M o r p h o l o g y o f ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 1 P A P E R 3 F i g u r e 1 K e r a t o cyt e p o p u l a t i o n g r o w t h i n cu l t u r e u si n g d e f i n e d m e d i a . . . . . 1 2 0 F i g u r e 2 C o l l a g e n syn t h e si s a n d se c r e t i o n i n d e f i n e d m e d i a . . . . . . . . . . . . . 1 2 1 F i g u r e 3 S D S P A G E a n a l ysi s o f m e d i u m d i g e s t e d w i t h p e p si n . . . . . . . . . . . 1 2 2 F i g u r e 4 A ccu m u l a t i o n o f k e r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n s i n t h e m e d i u m . . . . 1 2 3 F i g u r e 5 A ccu m u l a t i o n o f ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n s i n cu l t u r e m e d i u m o f ce l l s t r e a t e d w i t h e t h yl 3 4 d i h y d r o xyb e n zo a t e . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 F i g u r e 6 I n co r p o r a t i o n o f 3 5 S O 4 i n t o g l yco sa m i n o g l yca n s d u r i n g 7 2 h i n cu l t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 5 F i g u r e 7 C h r o m a t o g r a p h y o f 3 5 S O 4 r a d i o l a b e l e d p r o t e o g l yca n s o n S u p e r o se 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 6

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vi i D I S C U S S I O N F i g u r e 1 P r o p o se d m o d e l o f a ct i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 7 F i g u r e 2 P r o p o se d m o d e l o f a ct i o n w i t h b a se m e n t m e m b r a n e d a m a g e . . . . 1 4 0 F i g u r e 3 A W e st e r n b l o t o f e xt r a ct u si n g I G F I I a n t i b o d y . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 5 B T h ym i d i n e i n c o r p o r a t i o n s t i m u l a t e d b y I G F I I co m p a r e d t o e xt r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 5 F i g u r e 4 F r a ct i o n a t i o n o f st r o m a l e xt r a ct u si n g S 3 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 6

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vi i i L I S T O F A B B R E V I A T I O N S A b a n t i b o d y A L D H a l d e h yd e d e h yd r o g e n a se a S M A a l p h a sm o o t h m u scl e a ct i n B r d U b r o m o d e o xyu r i d i n e B S A b o vi n e se r u m a l b u m i n C B cu p e r i o n i c b l u e C S ch o n d r o i t i n su l f a t e C S P G ch o n d r o i t i n su l f a t e p r o t e o g l yca n D M E M D u l b e cco s m o d i f i e d E a g l e s m e d i u m D N A d e o xyr i b o n u cl e i c a ci d E B G e n d o b e t a g a l a ct o si d a se E C M e xt r a ce l l u l a r m a t r i x E D B e t h yl 3 4 d i h yd r o xyb e n zo a t e E H S E n g e l b r e t h H o l m S w a r m F B S f e t a l b o vi n e s e r u m F C E co r n e a l e xt r a ct m a d e f r o m f r o z e n co r n e a s ( i n i t i a l l y, a f t e r w a r d s o n l y S E ) F G F f i b r o b l a st g r o w t h f a ct o r G A G g l yco sa m i n o g l yca n

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i x G u H C l g u a n i d i n e h y d r o ch l o r i d e h d h i g h d e n si t y h s h i g h sa l t I G F i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r I T S i n su l i n t r a n sf e r r i n a n d se l e n i u m co n t a i n i n g m e d i u m su p p l e m e n t K C ke r a t o cyt e kD a ki l o d a l t o n K S ke r a t a n s u l f a t e K S P G ke r a t a n s u l f a t e p r o t e o g l yca n L A S I K l a se r i n si t u ke r a t o m i l i e u si s l d l o w d e n si t y L R R l e u ci n e r i ch r e p e a t l s l o w sa l t M C D m a cu l a r co r n e a l d yst r o p h y P B S p h o sp h a t e b u f f e r e d sa l i n e P G D S p r o st a g l a n d i n D syn t h a se P D G F B B p l a t e l e t d e r i ve d g r o w t h f a c t o r B B P P H S p l a t e l e t p o o r h o r se se r u m P R K p h o t o r e f r a ct i ve k e r a t e c t o m y p t p a ss t h r o u g h S D S so d i u m d o d e cyl su l f a t e S D S P A G E p o l ya cr yl a m i d e g e l e l e ct r o p h o r e si s S E / C E st r o m a l / co r n e a l e xt r a ct

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x S F M se r u m f r e e m e d i u m S L R P sm a l l l e u ci n e r i ch p r o t e i n S P A R C se cr e t e d p r o t e i n a ci d i c a n d r i ch i n ci s t e i n e U V u l t r a vi o l e t

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xi D E V E L O P I N G C U L T U R E M E D I A T O S T U D Y K E R A T O C Y T E P H E N O T Y P E S I N V I T R O K u r t M u sse l m a n n A B S T R A C T T h e co r n e a l w o u n d h e a l i n g r e s p o n se i n v o l ve s t h e a ct i va t i o n o f ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e f r o m a q u i e sce n t p h e n o t yp e T h e m i t o g e n s t h a t ca u se t h e i n i t i a l t r a n sf o r m a t i o n o f t h e q u i e sce n t ke r a t o cyt e s t o t h e a ct i ve p h e n o t yp e h a ve n o t b e e n i d e n t i f i e d E ve n t h o u g h s e r u m i s co m m o n l y u se d t o r e p l i ca t e t h i s i n vi t r o t h e co r n e a i s a va scu l a r a n d t h e r e f o r e l i ke l y n o t e xp o se d t o se r u m I n t h e f i r st p a r t o f t h i s d i sse r t a t i o n a D M E M / F 1 2 e xt r a ct o f co r n e a l st r o m a s w a s m a d e a n d sh o w n t o st i m u l a t e ke r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n i n b o t h a d o se d e p e n d e n t a n d ce l l d e n si t y d e p e n d e n t m a n n e r T h i s e xt r a ct co n t a i n s m i t o g e n s t h a t d i f f e r f r o m t h e m i t o g e n s p r e se n t i n se r u m b a s e d o n t h e i r e f f e ct o n ke r a t o c yt e s a n d t h e i r b i o ch e m i ca l ch a r a ct e r i st i cs. C u l t u r e i n e xt r a ct r e p l i ca t e s i n vi t r o t h e ch a n g e s o b se r ve d d u r i n g t h e a ct i v a t i o n o f k e r a t o cyt e s i n t h e w o u n d h e a l i n g p h a s e T h e co r n e a l st r o m a c o n t a i n s a n e xt e n si ve e xt r a ce l l u l a r m a t r i x t h a t co n si st s p r i m a r i l y o f co l l a g e n s a n d p r o t e o l g yc a n s. T h i s m a t r i x i s m a i n t a i n e d a n d se cr e t e d b y t h e ke r a t o cyt e s, ce l l s w i t h u n i q u e ch a r a ct e r i st i cs l o st d u r i n g t h e a ct i va t i o n o b se r ve d a t w o u n d h e a l i n g T h e se co n d p a r t o f t h i s d i sse r t a t i o n a i m s

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xi i t o d e ve l o p a d e f i n e d cu l t u r e m e d i u m t h a t m a i n t a i n s t h e k e r a t o cyt e p h e n o t yp e d u r i n g p r o l i f e r a t i o n K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n se r u m f r e e m e d i u m a n d t h e e f f e ct o f t h e g r o w t h f a ct o r s o n t h e m a r ke r s f o r t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e d e t e r m i n e d O n l y i n su l i n w a s sh o w n t o st i m u l a t e ce l l p r o l i f e r a t i o n i n a co n si st e n t m a n n e r w h i l e m a i n t a i n i n g co m m o n l y a cce p t e d ke r a t o cyt e m a r ke r s. W h e n t h i s d e f i n e d cu l t u r e m e d i u m w a s su p p l e m e n t e d w i t h a sco r b i c a ci d t o st u d y co l l a g e n syn t h e si s, a m a r ke d i n cr e a s e i n b o t h co l l a g e n syn t h e si s a n d ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yc a n a ccu m u l a t i o n w a s m e a su r e d T h i s n e w l y d e ve l o p e d cu l t u r e m e d i u m c o n t a i n i n g i n su l i n a n d a sco r b a t e a l l o w s f o r ce l l g r o w t h m a i n t a i n s t h e ke r a t o cyt e m a r k e r s, a n d co u l d b e u se d t o st u d y t h e n a t i ve n o n a ct i va t e d ke r a t o cyt e p h e n o t yp e i n cu l t u r e T h i s d i sse r t a t i o n sh o w s t h a t t h e cu l t u r e m e d i a d e scr i b e d h e r e i n r e p l i ca t e i n vi t r o a l l t h e p h e n o t yp e s o b se r ve d d u r i n g t h e co r n e a l w o u n d h e a l i n g r e s p o n se i n vi vo T h e s e cu l t u r e m e d i a i n t u r n co u l d b e u se d t o o b t a i n m o r e k n o w l e d g e a b o u t t h e d i f f e r e n t ke r a t o cyt e p h e n o t yp e s, a n d h o w t h e y c o u l d b e m a n i p u l a t e d i n cu l t u r e ( 3 2 9 w o r d s)

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1 I N T R O D U C T I O N T H E C O R N E A T h e co r n e a i s t h e o u t e r m o st r e f r a ct i ve l a y e r o f t h e o p t i c syst e m a n d i n i t i a l l y f o r m s vi a t h e se p a r a t i o n o f e ct o d e r m a l t i ssu e f r o m t h e l e n s ( 1 ) T h i s e ct o d e r m a l t i ssu e g i ve s r i se t o t h e co r n e a l e p i t h e l i u m w h i ch se c r e t e s a n i n i t i a l co l l a g e n o u s m a t r i x t h a t s e r ve s a s a su b st r a t u m f o r t h e m i g r a t i o n o f ce l l s o f n e u r a l c r e st o r i g i n T h e m i g r a t i o n o f t h e se c e l l s ca n o ccu r i n o n e o r t w o w a ve s d e p e n d i n g o n t h e sp e ci e s ( 2 ) A s a n e xa m p l e i n m i ce t h e f i r st w a ve o f n e u r a l cr e st d e r i ve d ce l l s f o r m s t h e co r n e a l e n d o t h e l i u m T h e s e ce l l s m o d i f y t h e co l l a g e n o u s m a t r i x b y se c r e t i n g h y a l u r o n a n U p o n t h e cl o su r e o f t h e e n d o t h e l i a l ce l l sh e e t t h e co l l a g e n o u s m a t r i x t h i cke n s a n d t h e n t h e se co n d w a ve o f n e u r a l cr e st d e r i ve d ce l l s, t h e p r e cu r so r s f o r t h e ke r a t o cyt e s, m i g r a t e a n d p o p u l a t e t h e m a t r i x ( 2 ) A t t h i s d e ve l o p m e n t a l st a g e t h e c o r n e a l s t r o m a i s r i ch i n h ya l u r o n a n d e co r i n a n d co n t a i n s co l l a g e n ( 3 ) W h e n t h e st r o m a h a s b e e n co m p l e t e l y p o p u l a t e d b y m e se n ch y m a l ce l l s, t h e l e ve l o f st r o m a l h y a l u r o n a n g r a d u a l l y d e cr e a se s. T h e se ce l l s r e m o d e l t h e c o l l a g e n o u s m a t r i x a n d se cr e t e u n s u l f a t e d l u m i ca n a s w e l l a s u n su l f a t e d ke r a t o ca n d u r i n g t h e i n i t i a l p h a se o f co r n e a l g r o w t h ( 4 ) ; t h e se p r o t e i n s a r e i m p o r t a n t f o r t h e m o d u l a t i o n o f co l l a g e n f i b r i l d i a m e t e r ( 5 ) D u r i n g t h e m a t u r a t i o n p r o ce ss t h e c o r n e a t h i cke n s a n d t h e g l yco sa m i n o g l yca n co m p o si t i o n o f t h e e xt r a c e l l u l a r m a t r i x ch a n g e s. A t b i r t h t h e

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2 m o u se co r n e a i s a r o u n d 6 0 m t h i n ( 2 ) a n d co n t a i n s u n su l f a t e d l u m i ca n o r u n d e r su l f a t e d l u m i ca n i n t h e st r o m a ( 6 ) T h e e p i t h e l i u m i s co m p o se d o f o n l y o n e t o t w o st a cke d ce l l l a ye r s. I t s t h i ckn e ss i n cr e a se s f r o m b i r t h t o a f t e r e ye l i d o p e n i n g a cc e l e r a t i n g a f t e r l i d o p e n i n g a n d b e co m i n g 5 7 ce l l l a ye r s d e e p ( 2 ) S t r o m a l t h i ckn e ss i n cr e a s e s b y a l m o st 6 0 % t o a r o u n d 1 0 0 m b e t w e e n b i r t h a n d e ye l i d o p e n i n g t i m e T h i s i s d u e t o i n cr e a se d m a t r i x syn t h e si s a n d m o d i f i ca t i o n b y t h e ce l l s p r e se n t i n t h e s t r o m a a n d o cc u r s e ve n t h o u g h t h e n u m b e r o f ce l l s d e cr e a s e s ( 6 7 ) T h e t h i cke n i n g o f t h e st r o m a co r r e l a t e s w i t h a n i n cr e a se i n t h e su l f a t i o n a n d i n t h e l e v e l s o f t h e m a i n K S P G s ( 8 9 ) : l u m i ca n a n d ke r a t o ca n a n d t h i s i n cr e a se d n e g a t i ve ch a r g e ca u se s i n f l o w o f w a t e r i n t o t h e st r o m a ( 6 ) I n t h e d e v e l o p i n g m o u se t h i s t h i cke n i n g r e a c h e s i t s m a xi m u m sh o r t l y a f t e r e ye l i d o p e n i n g a n d t h e n d e cr e a se s sl i g h t l y t o t h e a d u l t l e ve l a n d t h e n r e m a i n s co n st a n t ( 6 ) T h i s d e c r e a se i n s t r o m a l t h i ckn e ss p r o vi d e s e vi d e n ce t h a t t h e p u m p i n g f u n ct i o n o f t h e co r n e a l e n d o t h e l i u m i n i t i a t e s a f t e r e ye l i d o p e n i n g a n d st r o m a l t h i cke n i n g a n d se r ve s t o co m p a c t t h e st r o m a a s t h e co r n e a g a i n s i t s t r a n sp a r e n cy. I n co n t r a st t o t h e e xp r e ssi o n o f ke r a t o c a n w h i ch d e c r e a se s t h r o u g h a d u l t h o o d t h e e xp r e ssi o n o f l u m i ca n i s h i g h a n d r e m a i n s co n st a n t T h e r e su l t i n g co r n e a i s a t h i n ( 5 0 0 m i n h u m a n s, 3 0 0 m i n r a t s) a va scu l a r a n d u n i q u e l y t r a n sp a r e n t o r g a n r e s p o n si b l e f o r m o st o f t h e r e f r a ct i ve a c t i o n o f t h e e ye ( 1 0 1 1 ) I t co n t a i n s t h e t h r e e t i ss u e l a ye r s ( F i g u r e 1 ) e a ch se p a r a t e d f r o m t h e o t h e r b y b a se m e n t m e m b r a n e s.

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3 F i g u r e 1 C r o s s s e c t i o n t h r o u g h a r a t s t r o m a T h e t h r e e t i ssu e l a ye r s a n d t h e ce l l s co m p r i si n g t h e m a r e vi si b l e L e g e n d : y e l l o w ( d a sh e d a r r o w ) i n d i ca t e s p r o l i f e r a t i o n ( K i 6 7 a ce l l cycl e m a r k e r ) ; r e d f l u o r e sc e n ce ( sh o r t a r r o w s) st a i n i n g f o r D N A i n t h e st r o m a ( p r o p i d i u m i o d i d e ) A r r o w sh o w s t h e e n d o t h e l i a l ce l l l a ye r M o d i f i e d f r o m Z i e ske e t a l 2 0 0 1 ( 6 4 ) U se d w i t h p e r m i ssi o n f r o m t h e o r g i n a l a u t h o r a n d f r o m E l se vi e r R e p r i n t e d f r o m E xp e r i m e n t a l E ye R e se a r ch 7 2 ( 1 ) : 3 3

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4 B o w m a n s m e m b r a n e se p a r a t e s t h e e p i t h e l i u m f r o m t h e st r o m a a n d D e sce m e t s m e m b r a n e se p a r a t e s t h e st r o m a f r o m t h e e n d o t h e l i u m ( 1 0 ) T h e st r a t i f i e d co r n e a l e p i t h e l i u m p r e v e n t s l e a ka g e o f e xt e r n a l f l u i d s i n t o t h e co r n e a l st r o m a a n d se r ve s a s a b a r r i e r t o e n vi r o n m e n t a l a g e n t s l i ke b a ct e r i a f u n g i a n d vi r u se s ( 1 2 1 5 ) d u e t o t h e t i g h t j u n ct i o n s f o r m e d b e t w e e n t h e ce l l s ( 1 0 1 4 1 7 ) I n co m b i n a t i o n w i t h t h e t e a r f i l m t h e e p i t h e l i u m f o r m s a sm o o t h su r f a ce o f t h e co r n e a ( 1 1 ) T h e e p i t h e l i u m i s r e g e n e r a t e d o n a co n t i n u o u s b a si s ( 1 0 ) f r o m t h e st e m ce l l s l o ca t e d i n t h e l i m b a l e p i t h e l i u m ( 1 8 ) B e t w e e n t h e b a sa l l a m i n a o f t h e co r n e a l e p i t h e l i u m a n d t h e st r o m a i s B o w m a n s m e m b r a n e a 4 m t h i n l a ye r t h a t co n t a i n s h i g h l e v e l s o f co l l a g e n t yp e s I I I I a n d V ( 1 9 ) L i ke b a se m e n t m e m b r a n e s, t h i s l a y e r a l so co n t a i n s co l l a g e n t yp e I V l a m i n i n a s w e l l a s p e r l e ca n a h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l yca n I t i s a d e n se f e l t l i ke sh e e t ch a r a ct e r i ze d b y t h e p r e se n ce o f co l l a g e n f i b r i l s o f t h i n d i a m e t e r m a i n l y d u e t o t h e h i g h l e ve l s o f co l l a g e n t yp e V ( 1 9 ) E ve n t h o u g h t h e e xa c t f u n ct i o n o r t h e c e l l u l a r o r i g i n o f B o w m a n s m e m b r a n e i s n o t kn o w n ( 2 0 ) i t h a s b e e n p r o p o se d t h a t t h i s l a ye r m a y o r i g i n a t e f r o m t h e co n ce r t e d a ct i o n o f ke r a t o cyt e s a n d e p i t h e l i a l ce l l s a n d m a y se r ve a s a ce l l f r e e zo n e t o p r e ve n t p a t h o g e n i n f e ct i o n s o f t h e st r o m a a f t e r e p i t h e l i a l d a m a g e I t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t t h e a b se n ce o f t h i s l a ye r i n vi vo ca u se s e p i t h e l i a l ce l l s t o e xh i b i t a m o r p h o l o g y t h a t d i f f e r s f r o m t h e i r n o r m a l p h e n o t y p e ( 2 1 ) T h i s l a ye r i s n o t p r e se n t i n a l l a n i m a l s a n d i t s p r e se n ce a p p e a r s t o b e d e ve l o p m e n t a l l y r e g u l a t e d i n r a b b i t s ( 2 2 ) I m m u n o h i st o c h e m i ca l st a i n i n g st u d i e s sh o w t h a t se v e r a l g r o w t h f a c t o r s r e l e a se d b y e p i t h e l i a l ce l l s b i n d t o B o w m a n s

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5 m e m b r a n e p o ssi b l y m a ki n g t h i s l a ye r a g r o w t h f a ct o r si n k ( 2 3 ) I n a d u l t r a b b i t s w i t h o u t B o w m a n s m e m b r a n e t h e e p i t h e l i a l b a se m e n t m e m b r a n e p r e v e n t s t h e p a ssa g e o f T G F b 2 m a d e b y t h e e p i t h e l i u m i n t o t h e st r o m a T h e se g r o w t h f a ct o r s, h o w e ve r a r e r e l e a se d b y t h e d e g r a d a t i o n o f t h e b a se m e n t m e m b r a n e a f t e r d a m a g e o r p r o t e o l yt i c d e g r a d a t i o n ( 2 0 2 3 2 4 ) T h e co r n e a l st r o m a i s t h e m o st o r g a n i ze d e xt r a ce l l u l a r m a t r i x ( E C M ) i n t h e b o d y, a cc o u n t i n g f o r a p p r o xi m a t e l y 9 0 % o f co r n e a l t h i ckn e ss a n d i s co m p o se d o f co l l a g e n s a n d p r o t e o g l yca n s. T h e co l l a g e n f i b r i l s a r e o r g a n i ze d i n t o l a m e l l a e t h a t a r e o r t h o g o n a l t o e a ch o t h e r a n d a l so t o t h e p a t h o f l i g h t ( s h o w n i n F i g u r e 2 l e f t p a n e l ) T h e f i b r i l s a r e o f u n i f o r m d i a m e t e r ( ~ 3 0 n m ) a n d r e g u l a r l y sp a c e d ( ~ 6 0 n m f r o m ce n t e r t o c e n t e r ) ( F i g u r e 2 ce n t e r p a n e l co l l a g e n f i b r i l s st a i n e d w i t h O sO 4 ) T h e p r o t e o g l yca n s i n t h e st r o m a i n t e r a ct w i t h t h e co l l a g e n a n d f i l l t h e sp a ce s b e t w e e n f i b r i l s ( F i g u r e 2 r i g h t p a n e l st a i n e d w i t h C u p e r i o n i c b l u e ( 2 5 ) C o l l a g e n s co m p r i se a r o u n d 8 0 % o f t o t a l co r n e a l p r o t e i n C o l l a g e n s a r e p r o t e i n s ch a r a ct e r i ze d b y t h e p r e s e n ce o f a t l e a st o n e t r i p l e h e l i ca l d o m a i n a n d t h e p r e s e n ce o f ( G l y X Y ) n r e p e a t s, w i t h x b e i n g p r o l i n e a n d Y b e i n g h yd r o xyp r o l i n e ( 2 6 ) B a se d o n t h e i r su p r a m o l e cu l a r st r u ct u r e co l l a g e n s a r e se p a r a t e d i n t o f i b r i l a r co l l a g e n s, f i b r i l a sso ci a t e d co l l a g e n s, m e m b r a n e co l l a g e n s a n d m u l t i p l e xi n s. M u l t i p l e xi n s a r e co l l a g e n o u s p r o t e i n s w i t h m u l t i p l e t r i p l e h e l i ca l d o m a i n s a n d a l so a r e p r o t e o g l yca n s ( 2 6 ) I n t h e co r n e a co l l a g e n t yp e I i s t h e m o st a b u n d a n t ( ~ 7 5 % o f t o t a l co l l a g e n ) f o l l o w e d b y c o l l a g e n t yp e V I a n d co l l a g e n t yp e V ( a r o u n d 1 5 % a n d 1 0 % r e sp e ct i ve l y) ( 2 7 2 8 )

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6 F i g u r e 2 C o l l a g e n o r g a n i za t i o n a n d E C M s t a i n i n g f o r c o l l a g e n a n d p r o t e o g l yc a n s. L e f t P a n e l : S ch e m a t i c o f co l l a g e n l a m e l l a e o r g a n i za t i o n i n t h e c o r n e a T h e c o l l a g e n f i b r i l s w i t h i n e a c h l a m e l l a e a r e p a r a l l e l t o e a c h o t h e r b u t o r t h o g o n a l t o co l l a g e n f i b r i l s i n t h e n e i g h b o r i n g l a m e l l a e L e g e n d : O sO 4 : st a i n s co l l a g e n ; C u B : st a i n s p r o t e o g l yca n si d e ch a i n s. S e ct i o n i n g p e r f o r m e d p a r a l l e l t o t h e d i r e ct i o n o f co l l a g e n w i t h i n l a m e l l a e ( A D ) o r i n c r o ss se ct i o n ( E F ) M o d i f i e d f r o m M u e l l e r e t a l 2 0 0 4 ( 2 5 ) F i g u r e u se d w i t h p e r m i ssi o n b o t h f r o m t h e a u t h o r a n d a l s o f r o m E l se vi e r R e p r i n t e d f r o m E xp e r i m e n t a l E ye R e s e a r ch 7 8 ( 3 ) : 4 9 3

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7 C o l l a g e n t yp e V I b i n d s p r o t e o g l yca n s ( 2 9 ) a n d h a s b e e n sh o w n t o f o r m t h i n f i l a m e n t s i n t h e st r o m a ( 3 0 3 1 ) C o l l a g e n t y p e I a n d V a r e b o t h m e m b e r s o f t h e f i b r i l a r co l l a g e n s a n d si m i l a r t o o t h e r E C M s, f o r m t h i n h e t e r o f i b r i l s ( 3 2 3 3 ) I n co n t r a st t o B o w m a n s m e m b r a n e w h e r e i m m u n o st a i n i n g r e a d i l y d e t e ct s co l l a g e n V t h e d e t e ct i o n o f t h i s co l l a g e n i n t h e st r o m a r e q u i r e s t h a t t h e c o l l a g e n f i b r i l s f i r st b e d i sr u p t e d ( 3 3 ) i n d i ca t i n g t h a t t h i s co l l a g e n i s b u r i e d i n si d e t h e c o l l a g e n f i b r i l B o t h co l l a g e n t yp e I a n d co l l a g e n t yp e V a r e se cr e t e d a s p r o c o l l a g e n p o l yp e p t i d e s a n d r e q u i r e p o st t r a n sl a t i o n a l p r o ce ssi n g t o r e m o ve t h e p r o co l l a g e n d o m a i n s t o f o r m m a t u r e co l l a g e n P r o co l l a g e n t yp e I i s co m p l e t e l y p r o ce sse d t o t h e m a t u r e f o r m b u t m a t u r e co l l a g e n t yp e V st i l l r e t a i n s a p o r t i o n o f i t s g l o b u l a r n o n co l l a g e n o u s N t e r m i n a l d o m a i n ( 3 4 ) T h i s r e m n a n t d o e s n o t i n h i b i t t h e i n co r p o r a t i o n o f co l l a g e n t yp e V i n t o f i b r i l s ( 3 5 3 6 ) a n d h a s b e e n sh o w n t o p r o j e ct t h r o u g h g a p s i n t h e co l l a g e n f i b r i l ( 3 4 ) I n f a ct B i r k e t a l h a ve sh o w n t h a t c o l l a g e n V co n t r o l s t h e i n i t i a t i o n o f c o l l a g e n f i b r i l f o r m a t i o n ( 3 7 ) a n d a l s o t h a t co l l a g e n f i b r i l d i a m e t e r i s i n ve r se l y p r o p o r t i o n a l t o co l l a g e n t yp e V co n t e n t ( 3 8 3 9 ) w h i ch l i ke l y i n h i b i t s l a t e r a l f i b r i l g r o w t h b y st e r i c a n d ch a r g e i n t e r a ct i o n s ( 3 4 ) T h e t h r e e m a i n p r o t e o g l yca n s i n t h e st r o m a a r e d e co r i n ( 4 0 ) ke r a t o ca n ( 4 1 ) a n d l u m i ca n ( 8 4 2 4 4 ) w h i l e o st e o g l yci n / m i m e ca n ( 4 5 ) i s f o u n d a t l e sse r a m o u n t s T h e se p r o t e i n s a r e m e m b e r s o f t h e sm a l l l e u ci n e r i ch p r o t e o g l yca n ( S L R P ) g e n e f a m i l y a n d h a ve a si m i l a r p r i m a r y st r u ct u r e w i t h se ve r a l i d e n t i f i a b l e l e u ci n e r i ch r e p e a t s ( L R R ) a n d a r e p o st t r a n sl a t i o n a l l y m o d i f i e d b y t h e a d d i t i o n o f e i t h e r c h o n d r o i t i n s u l f a t e ( C S ) o r k e r a t a n su l f a t e ( K S ) ( 8 4 3 4 4 4 6 )

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8 g l yco sa m i n o g l yca n ( G A G ) si d e ch a i n s. D e co r i n i s a C S p r o t e o g l yca n ; a n d ke r a t o ca n l u m i ca n a n d m i m e ca n a r e K S p r o t e o g l yca n s. H o m o l o g y m o d e l i n g t o r i b o n u cl e a s e i n h i b i t o r a L R R p r o t e i n w i t h a k n o w n cr yst a l st r u ct u r e p r e d i ct s t h a t p r o t e i n s w i t h m u l t i p l e L R R a d o p t a so l e n o i d t e r t i a r y st r u ct u r e ( 4 7 ) w i t h t h e p r o t e o g l yc a n ch a i n s e xt e n d i n g o u t w a r d s f r o m t h e p r o t e i n T h e p r e se n ce o f L R R r e p e a t s i s i m p o r t a n t f o r p r o t e i n p r o t e i n i n t e r a ct i o n s ( 4 7 4 8 ) a n d t h e co r e p r o t e i n s o f d e co r i n l u m i ca n a n d ke r a t o ca n h a ve b e e n sh o w n t o a f f e ct co l l a g e n f i b r i l f o r m a t i o n a n d s t a b i l i t y i n vi t r o L u m i ca n a n d ke r a t o c a n n u l l m i ce e xh i b i t l a r g e r co l l a g e n f i b r i l d i a m e t e r s, su g g e st i n g t h a t t h e s e p r o t e o g l yca n s b i n d a n d m o d u l a t e co l l a g e n f i b r i l g r o w t h i n vi v o a s w e l l a n d t h a t t h e a b se n ce o f o n e ca n n o t b e r e scu e d b y t h e o t h e r p r o t e o g l yca n K e r a t a n su l f a t e G A G s a cco u n t f o r a r o u n d 6 0 % o f t h e G A G s i n t h e st r o m a a n d ch o n d r o i t i n su l f a t e f o r a r o u n d 4 0 % ( 4 9 ) E l e ct r o n m i cr o g r a p h s sh o w t h a t t h e se G A G s e xt e n d f r o m t h e co l l a g e n f i b r i l s i n t o t h e st r o m a l m a t r i x, f i l l i n g t h e sp a ce s b e t w e e n t h e co l l a g e n f i b r i l s ( F i g u r e 2 ) ( 2 5 ) T h e h i g h n e g a t i ve ch a r g e o f t h e su l f a t e d G A G s ca u se s b o t h w a t e r i n f l o w b e t w e e n t h e f i b r i l s a n d a l so e l e ct r o st a t i c r e p u l si o n b e t w e e n si d e ch a i n s a n d t h i s h e l p s t o m a i n t a i n co l l a g e n f i b r i l sp a ci n g T h e p r o t e i n co r e o f t h e se p r o t e o g l yca n s, h o w e v e r d o e s i n t e r a c t w i t h t h e co l l a g e n f i b r i l s d i r e ct l y, m o st p r o b a b l y vi a t h e L R R s. T h i s i n t e r a ct i o n ca n b e m e a su r e d i n vi t r o b y f o l l o w i n g co l l a g e n f i b r i l f o r m a t i o n i n t h e p r e se n ce o f t h e se p r o t e i n s b y t u r b i d i m e t r y ( 4 4 5 0 ) T h e c o l l a g e n f i b r i l s t h a t a r e f o r m e d i n t h e p r e se n ce o f t h e co r e p r o t e i n s n o t o n l y a r e d i f f e r e n t i n d i a m e t e r b u t a l so s h o w d i f f e r e n t f o r m a t i o n ki n e t i cs ( 5 1 ) T h e r e d u ct i o n a n d a l kyl a t i o n o f t h e co r e p r o t e i n

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9 e l i m i n a t e d t h e m o d u l a t o r y a ct i vi t y o f t h e p r o t e o g l yca n s, b u t t h e r e m o v a l o f t h e G A G si d e ch a i n d i d n o t su g g e st i n g t h a t o n l y t h e co r e p r o t e i n i n t e r a ct s w i t h a n d m o d u l a t e s c o l l a g e n f i b r i l f o r m a t i o n ( 4 4 ) L u m i ca n a n d ke r a t o ca n n u l l m i ce h a ve si g n i f i ca n t l y t h i n n e r co r n e a s t h a n t h e w i l d t yp e a n i m a l s, a n d t h e st r o m a s o f t h e l u m i ca n a n d t h e ke r a t o ca n n u l l m i ce e xh i b i t a r e d u ct i o n i n co l l a g e n f i b r i l h o m o g e n e i t y a n d sp a ci n g ( 6 5 2 ) T h e l o ss o f l u m i ca n t h e m a j o r K S P G i n t h e c o r n e a l st r o m a i s n o t r e scu e d b y ke r a t o ca n a n d co l l a g e n f i b r i l s i n cr e a se i n d i a m e t e r a n d t h e f i b r i l s a r e i r r e g u l a r i n sh a p e c o n f i r m i n g t h e i m p o r t a n ce o f t h e s e p r o t e o g l yca n s f o r t h e st r u ct u r e o f t h e co r n e a K e r a t a n su l f a t e i s a r e p e a t i n g d i ssa ch a r i d e o f g l u co sa m i n e a n d g a l a ct o se t h a t i s d e co r a t e d w i t h su l f a t e e st e r s. D e f e c t s i n t h e su l f a t i o n o f t h e r e p e a t i n g d i sa cch a r i d e ( 5 3 ) r e s u l t s i n a d i se a se p h e n o t yp e kn o w n a s M a c u l a r C o r n e a l D yst r o p h y. P a t i e n t s su f f e r i n g f r o m m a cu l a r co r n e a l d yst r o p h y h a ve t h i n n e r co r n e a s, m a i n l y d u e t o r e d u c e d sp a ci n g b e t w e e n t h e co l l a g e n f i b r i l s. T h e m a i n d e f e ct i n M C D h o w e ve r i s t h e a ccu m u l a t i o n o f o p a q u e d e p o si t s i n t h e co r n e a l st r o m a ( 5 4 ) B i o ch e m i ca l a n a l ysi s h a s sh o w n t h a t t h e se d e p o si t s co n t a i n m a t u r e l u m i ca n a n d ke r a t o ca n co r e p r o t e i n s, b u t i n st e a d o f b e i n g su b st i t u t e d w i t h ke r a t a n su l f a t e si d e c h a i n s, t h e y co n t a i n t h e u n su l f a t e d p o l yl a c t o sa m i n e ch a i n s ( 5 4 ) T h e se c h a i n s a r e i n so l u b l e i n a q u e o u s so l u t i o n s a n d l i ke l y ca u se t h e p r o t e o g l yc a n s t o p r e ci p i t a t e A s t h e e x p r e ssi o n o f l u m i ca n a n d ke r a t o ca n i n cr e a se d u r i n g co r n e a l t r a n sp a r e n cy t h e d e p o si t s i n cr e a se i n si ze l e a d i n g t o t h e o p a ci f i ca t i o n o f t h e co r n e a

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1 0 W h i l e b o t h ch o n d r o i t i n su l f a t e ( C S ) a n d ke r a t a n su l f a t e ( K S ) b i n d w a t e r K S i s m o r e h yg r o sco p i c t h a n C S b u t b i n d s w a t e r l e ss t i g h t l y. A s p r e vi o u sl y m e n t i o n e d t h e K S co n t e n t o f t h e st r o m a i s h i g h e r i n t h e p o st e r i o r s t r o m a co m p a r e d t o t h e a n t e r i o r st r o m a A s a co n se q u e n ce o f t h e h i g h G A G co n t e n t t h e co r n e a i s p r o n e t o sw e l l i n g E xce ss w a t e r i n f l o w w o u l d r e s u l t i n e d e m a ca u si n g t h e co r n e a t o sw e l l a n d b e co m e o p a q u e T h i s, h o w e ve r d o e s n o t o ccu r i n h e a l t h y co r n e a s, b e ca u s e t o t h e p u m p i n g a ct i o n o f t h e e n d o t h e l i u m ( 5 5 ) T h i s p u m p i n g a ct i o n r e m o v e s w a t e r f r o m t h e st r o m a i n t o t h e a q u e o u s h u m o r T h e e n d o t h e l i u m a l so p l a ys a r o l e i n t h e n o u r i s h m e n t o f t h e ce l l s i n t h e st r o m a ( 5 5 ) T h e l a ck o f va scu l a t u r e i n t h e c o r n e a c o m b i n e d w i t h t h e t i g h t j u n c t i o n s o f t h e e p i t h e l i u m p r e ve n t s t h e co r n e a l s t r o m a f r o m b e i n g n o u r i sh e d d i r e c t l y f r o m d i f f u si o n f r o m b l o o d ve sse l s o r f r o m t h e t e a r f i l m I n c o n t r a s t e n d o t h e l i a l ce l l s f o r m l e a ky j u n ct i o n s. T h e s e a l l o w n u t r i e n t s t o e n t e r t h e st r o m a t h r o u g h d i f f u si o n f r o m t h e a q u e o u s h u m o r a n d f e e d t h e ke r a t o cyt e s. E n d o t h e l i a l ce l l s a r e a l so r e sp o n si b l e f o r t h e se cr e t i o n o f co l l a g e n s a n d o t h e r m a t r i x co m p o n e n t s o f D e sce m e t s m e m b r a n e ( 5 6 ) T H E K E R A T O C Y T E U n l i ke o t h e r e xt r a ce l l u l a r m a t r i ce s ( E C M ) w h e r e ke r a t a n su l f a t e i s p r e se n t i n o n l y m i n o r a m o u n t s, t h e E C M o f t h e c o r n e a h a s ve r y h i g h l e ve l s o f ke r a t a n su l f a t e T h i s i s t h e r e a so n t h e se c e l l s a r e c a l l e d ke r a t o cyt e s. K e r a t o cyt e s a r e d i sp e r se d t h r o u g h o u t t h e st r o m a a n d f o r m a t h r e e d i m e n si o n a l n e t w o r k o f c e l l s t h a t i n t e r a ct vi a g a p j u n ct i o n s ( 5 7 6 1 ) T h e y h a ve a l a r g e r o u n d e d ce l l b o d y ( 6 0 )

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1 1 a n d a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y co n t a i n i n g b o t h l a r g e a n d sm a l l p r o ce sse s o r l a m e l l i p o d i a I t h a s b e e n s h o w n t h a t b o t h ce l l d e n si t y a n d t h e b r a n c h i n g o f t h e d e n d r i t e s d e cr e a se s a s d i st a n ce f r o m t h e e p i t h e l i u m i n cr e a se s ( 5 7 6 2 ) T h e r e a so n f o r t h i s i s n o t u n d e r st o o d b u t m a y b e r e l a t e d t o d i f f e r e n ce s i n t h e l o ca l co m p o si t i o n o f t h e E C M a n d p a r t i a l o xyg e n p r e ssu r e i n t h e t i ssu e s u r r o u n d i n g t h e se ce l l s. T h e se c e l l s a r e l o cke d i n G 0 o r q u i e sce n t ( 6 3 6 4 ) b u t a r e n o t s e n e sce n t T h e s e ce l l s m a i n t a i n t h e st r o m a b y syn t h e si zi n g a n d r e m o d e l i n g t h e co l l a g e n f i b r i l s a n d p r o t e o g l yc a n s p r e se n t i n i t ( 6 5 ) K e r a t o cyt e s se cr e t e l a r g e a m o u n t s o f t h e K S P G s. W h i l e l u m i ca n a n d m i m e ca n a r e f o u n d i n o t h e r t i ssu e s i n t h e b o d y, ke r a t o ca n i s t h e o n l y K S P G t h a t i s p r i m a r i l y e xp r e sse d i n t h e co r n e a K e r a t o ca n i s l i ke l y i m p o r t a n t f o r t h e m a i n t e n a n ce o f p r o p e r co r n e a l cu r va t u r e T h i s h a s b e e n su g g e st e d b y t h e cl i n i ca l a p p e a r a n ce o f p a t i e n t s w i t h C o r n e a P l a n a w h i ch i s ca u se d b y d e f e ct s i n t h e ke r a t o c a n g e n e C o r n e a P l a n a i s ch a r a ct e r i ze d b y a m a r k e d f l a t t e n i n g o f t h e co r n e a l c u r va t u r e w h i ch i n t u r n l o w e r s t h e r e f r a ct i ve p o w e r o f t h e st r o m a B e si d e s t h e i r h i g h l e v e l s o f ke r a t a n su l f a t e e xp r e ssi o n t h e i n si t u ke r a t o cyt e s a r e a l so ch a r a ct e r i ze d b y t h e e xp r e ssi o n o f h o u se ke e p i n g e n zy m e s a t ve r y h i g h l e ve l s ( 6 6 ) T h e s e e n zym e s, l i ke A L D H ca n co m p r i se 3 0 % o f t h e w a t e r so l u b l e p r o t e i n i n t h e ce l l ( 6 7 7 0 ) O t h e r p r o t e i n s e xp r e sse d a t h i g h l e ve l s a r e t r a n ske t o l a se a n d G 3 D P H ( 7 1 ) E ve n t h o u g h A L D H a n d t r a n sk e t o l a se a r e i m p o r t a n t f o r t h e r e m o va l o f U V i r r a d i a t i o n b y p r o d u ct s ( 6 8 ) t h e h i g h c e l l u l a r c o n t e n t s su g g e st s t h a t t h e se p r o t e i n s m a y h a ve a d i f f e r e n t r o l e t h a n t h e i r p u r e l y m e t a b o l i c o n e ( 6 9 7 2 7 4 ) T h e se p r o t e i n s

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1 2 a r e a l so e xp r e sse d a t ve r y h i g h l e ve l s i n t h e l e n s ( u p t o 9 0 % o f t o t a l p r o t e i n ) a n d a r e ca l l e d cr yst a l l i n s ( 7 5 7 7 ) T h e cr ys t a l l i n s ( 7 1 ) a r e t h o u g h t t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e ce l l u l a r co m p o n e n t o f co r n e a l t r a n sp a r e n cy ( 7 8 ) I t h a s b e e n p r o p o se d t h a t t h e se p r o t e i n s m i n i m i ze t h e d i f f e r e n ce i n r e f r a ct i ve i n d e x b e t w e e n t h e ce l l s a n d t h e E C M b u t i t a l so h a s b e e n p r o p o se d t h a t t h e h i g h l e ve l s o f t h e se p r o t e i n s c a u se d e st r u ct i ve i n t e r f e r e n c e i n l i g h t p a ssi n g t h r o u g h t h e ce l l s ( 7 9 ) K e r a t o cyt e s i n si t u a l s o e xp r e ss co l l a g e n b i n d i n g i n t e g r i n s l i ke a 3 b 1 a n d a vb 1 ( 8 0 8 1 ) O t h e r c e l l su r f a ce m a r ke r s f o r ke r a t o cyt e s a r e C D 3 4 ( 8 2 ) a n d 3 G 5 ( 8 3 ) A n a t o m i ca l l y, t h e s e ce l l s co n t a i n co r t i ca l l y o r g a n i ze d f a ct i n a n d l a ck p r o m i n e n t f o ca l a d h e si o n s ( 8 4 ) W h e n t h e co r n e a i s w o u n d e d so m e o f t h e su r vi vi n g ke r a t o cyt e s i n t h e st r o m a r e e n t e r t h e ce l l cycl e T h i s t r a n sf o r m a t i o n f r o m a q u i e sce n t ce l l p h e n o t yp e t o a m i t o t i ca l l y a ct i v e p h e n o t yp e h a s b e e n t e r m e d a ct i va t i o n T h e a ct i va t e d ke r a t o cyt e s a r e p r o l i f e r a t i ve e xp r e ss 5 # 1 i n t e g r i n ( t h e f i b r o n e ct i n r e ce p t o r ) o n t h e i r ce l l su r f a ce ( 8 1 ) a n d a r e m i g r a t o r y. A r e o r g a n i za t i o n o f t h e p r e vi o u sl y co r t i c a l l y f o u n d f a ct i n t a ke s p l a ce a n d f a ct i n st r e ss f i b e r s a n ch o r e d a t f o ca l a d h e si o n s ( 8 4 ) a r e f o r m e d B e si d e s t h e se ch a n g e s, a ct i v a t e d k e r a t o cy t e s syn t h e si ze a n d s e cr e t e f e w e r K S P G s a n d i n cr e a se C S P G syn t h e si s a n d se cr e t i o n ( 4 3 ) A l so a d e cr e a se i n c e l l u l a r cr yst a l l i n l e ve l s i n cr e a s e s i n t e r f e r e n ce w i t h l i g h t p a ssi n g t h r o u g h t h e c e l l s, m a ki n g t h e m l e ss t r a n s p a r e n t a n d t h e r e b y i n cr e a si n g st r o m a l h a ze ( 8 5 ) H i g h l e ve l s o f cr yst a l l i n s a r e t h e r e f o r e u su a l l y u se d a s a m a r ke r o f t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e a n d t h e i r l o ss, co m b i n e d w i t h o t h e r m a r ke r s l i ke ce l l m i g r a t i o n i n c r e a se d C S syn t h e si s a n d st r e s s f i b e r

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1 3 f o r m a t i o n a r e u se d a s i n d i ca t o r s t h a t t h e se c e l l s h a ve b e co m e a ct i va t e d ( 8 6 ) I t i s p o ssi b l e t h a t t h i s d e c r e a se i n ce l l u l a r cr yst a l l i n s i s p a r t i a l l y d u e t o t h e d i l u t i o n o f t h e se p r o t e i n s b y ce l l d i vi si o n a l t h o u g h a r e ce n t st u d y su g g e s t s t h a t t h e ce l l s m a y b e d e g r a d i n g t h e s e p r o t e i n s w h i l e i n t h e a ct i va t e d st a t e ( 8 7 ) A t h i r d ke r a t o cyt e p h e n o t yp e t h e m yo f i b r o b l a st s, i s u su a l l y o b se r ve d i n t h e h e a l i n g p h a se o f i n ci si o n a l co r n e a l w o u n d s. M yo f i b r o b l a st s r e m a i n p r o l i f e r a t i v e a n d m i g r a t o r y, a n d a l s o e xp r e ss a l p h a sm o o t h m u scl e a ct i n ( a S M A ) A s w i t h a ct i va t e d ke r a t o cyt e s m y o f i b r o b l a s t i c ke r a t o cyt e s d o n o t h a ve h i g h cyt o so l i c A L D H l e ve l s, a n d t h e r e f o r e i n t e r f e r e w i t h l i g h t p a ssi n g t h r o u g h t h e co r n e a T h e i n d u ct i o n o f t h e m yo f i b r o b l a st i c p h e n o t yp e h a s b e e n s h o w n t o b e d u e t o t h e a ct i o n o f T G F ( 8 8 9 0 ) b u t a l so r e q u i r e s a c t i n r e o r g a n i za t i o n a n d P D G F si g n a l i n g ( 9 1 ) I t h a s a l so b e e n sh o w n t h a t T G F st i m u l a t i o n o f co r n e a l f i b r o b l a st s r e s u l t s i n t h e i n cr e a se d e xp r e ssi o n o f T G F P D G F a n d F G F 2 i n a n a u t o cr i n e m a n n e r ( 9 1 9 2 ) T h e se c e l l s, l i ke t h e a ct i va t e d ke r a t o cyt e s, c o n t i n u e t o e xp r e ss t h e 5 # 1 i n t e g r i n o n t h e i r ce l l su r f a c e ( 8 1 ) M y o f i b r o b l a st s a l so se cr e t e a n E C M t h a t i s co n si d e r a b l y d i f f e r e n t t h a n t h e m a t r i x se cr e t e d b y q u i e sce n t a n d a ct i va t e d ke r a t o cyt e s K S P G e xp r e ssi o n r e m a i n s l o w ( 9 3 ) b u t co l l a g e n t yp e I I I syn t h e si s a n d se cr e t i o n i n cr e a se s co n si d e r a b l y, a s d o t h e syn t h e si s a n d se cr e t i o n o f f i b r o n e ct i n l a m i n i n b i g l yca n p e r l e ca n a n d S P A R C ( 8 6 9 4 ) T h e syn t h e si s a n d se cr e t i o n o f t h e se p r o t e i n s t h e r e f o r e a r e m a r k e r s f o r t h e m yo f i b r o b l a st i c p h e n o t yp e i n vi vo T h e syn t h e si s a n d se cr e t i o n o f t h e se f i b r o t i c E C M co m p o n e n t s d i sr u p t t h e cr yst a l l i ke o r g a n i za t i o n o f t h e s t r o m a l E C M r e su l t i n g i n i n cr e a se d sca t t e r i n g o f l i g h t d e t e c t a b l e a s co r n e a l h a ze ( 7 9 ) I t i s n o t

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1 4 kn o w n i f m yo f i b r o b l a st s i n si t u r e ve r t t o t h e f i b r o b l a st i c p h e n o t yp e o r t h e ke r a t o cyt e p h e n o t y p e S o m e e vi d e n ce e xi st s, h o w e ve r t h a t m yo f i b r o b l a st s u n d e r g o a p o p t o t i c ce l l d e a t h d u r i n g t h e r e so l u t i o n o f t h e w o u n d si m i l a r t o w h a t i s o b se r ve d i n h e a l e d ski n w o u n d s ( 9 5 9 7 ) T r a d i t i o n a l l y, ke r a t o cyt e s w e r e i so l a t e d a n d c u l t u r e d i n m e d i u m co n t a i n i n g 1 0 % f e t a l b o vi n e se r u m ( F B S ) C e l l s cu l t u r e d i n se r u m p r o l i f e r a t e r a p i d l y, a n d p o p u l a t i o n s c a n b e e xp a n d e d a n d p a ssa g e d W h i l e t h i s i s a n a d va n t a g e a n d a l l o w s f o r a n i n c r e a se i n ce l l n u m b e r i t a l so r e su l t s i n t h e ke r a t o cyt e s l o si n g t h e i r ch a r a ct e r i st i c d e n d r i t i c m o r p h o l o g y a n d a d o p t i n g a sp i n d l e sh a p e d f i b r o b l a st i c m o r p h o l o g y ( 9 4 ) b u t so m e o f t h e ce l l s a l so b e co m e m y o f i b r o b l a st i c ( 9 8 ) D u e t o t h e i r m o r p h o l o g y, t h e se ce l l s a r e co m m o n l y r e f e r r e d t o i n t h e l i t e r a t u r e a s co r n e a l / st r o m a l f i b r o b l a s t s ( 8 6 9 4 9 9 1 0 0 ) T h e cyt o so l i c l e ve l s o f A L D H d e cr e a se a s d o t h e syn t h e si s a n d s e cr e t i o n o f ke r a t o ca n a n d t h e o t h e r ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n s. C h o n d r o i t i n su l f a t e sy n t h e si s, h o w e v e r i n c r e a se s ( 4 0 ) i n a m a n n e r si m i l a r t o ce l l s o f t h e a ct i va t e d p h e n o t yp e ( 9 9 ) S e r u m i s t h e r e f o r e t h o u g h t t o r e c r e a t e t h e a ct i va t e d p h e n o t yp e i n vi t r o W h e n g r o w t h st i m u l a t i o n b y se r u m i s r e m o ve d t h e ce l l s r e st o r e t h e i r d e n d r i t i c m o r p h o l o g y, s e cr e t e m o r e ke r a t o ca n a n d k e r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n s, b u t n o t g a i n t h e h i g h cyt o so l i c A L D H l e ve l s ( 1 0 0 ) T h e s e f i n d i n g s r e su l t e d i n t h e su g g e st i o n t h a t t h e d e n d r i t i c m o r p h o l o g y a l so b e co n si d e r e d a m a r k e r f o r t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e C u l t u r e o f r a b b i t k e r a t o cyt e s d i r e ct l y i n se r u m f r e e m e d i a w a s sh o w n t o p r e ve n t t h e i n d u c t i o n o f t h e p r e su m e d a ct i v a t e d p h e n o t y p e ( 9 8 ) a n d t h i s w a s a d a p t e d t o b o vi n e ke r a t o cyt e s b y B e a l e s e t a l ( 9 9 ) w h e r e ce l l s a r e p l a t e d i n 1 %

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1 5 p l a t e l e t p o o r h o r se se r u m ( P P H S ) w h i ch i s e sse n t i a l l y p l a sm a a n d ch a n g e d t o se r u m f r e e m e d i u m o n d a y 1 ( h a r ve st i n g d a y i s d a y 0 a n d t h e ce l l s a r e a l l o w e d t o a t t a ch o v e r n i g h t a n d t r e a t e d o n d a y 1 ) U n d e r t h e se cu l t u r e co n d i t i o n s, ke r a t o cyt e s r e m a i n m o st l y q u i e sce n t a n d m a i n t a i n t h e i r d e n d r i t i c m o r p h o l o g y ( F i g u r e 3 ) F a ct i n i s d e t e ct e d co r t i ca l l y ( F i g u r e 4 A ) T h e se ce l l s a l so m a i n t a i n h i g h cyt o so l i c A L D H l e ve l s, a s w e l l a s syn t h e si z e a n d s e cr e t e ke r a t a n s u l f a t e a n d ch o n d r o i t i n su l f a t e p r o t e o g l yca n s si m i l a r t o t h e i n si t u ke r a t o cyt e s, t h e r e f o r e t h i s m e t h o d i s co m m o n l y u se d t o st u d y t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e i n vi t r o H o w e ve r t h e d i sa d va n t a g e o f t h i s cu l t u r e co n d i t i o n i s t h a t ce l l s d o n o t p r o l i f e r a t e a n d ce l l n u m b e r s d e cr e a se o ve r t h e c o u r se o f cu l t u r e

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1 6 F i g u r e 3 K e r a t o c y t e m o r p h o l o g y i n h i g h d e n s i t y c e l l c u l t u r e s K e r a t o cy t e s i so l a t e d b y co l l a g e n a se a n d p l a t e d i n 1 % p l a t e l e t p o o r h o r se se r u m T h e ce l l s m a i n t a i n a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y, a n d l a m e l l i p o d i a co n n e ct n e i g h b o r i n g ce l l s. K e r a t o cyt e s m e a su r e a r o u n d 1 0 0 m i n d i a m e t e r

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1 7 F i g u r e 4 F a c t i n s t a i n i n g o f k e r a t o c y t e s i n c u l t u r e ( A ) K e r a t o cyt e s c u l t u r e d i n 1 % P P H S a l o n e o r su p p l e m e n t e d w i t h 1 n g / m l T G F f o r 6 d a ys ( B ) C e l l s w e r e st a i n e d f o r f a ct i n ( g r e e n a r r o w ) o r p a xi l i n ( r e d a r r o w h e a d ) F a ct i n a n d p a xi l i n st a i n i n g i n t h e m yo f i b r o b l a st s sh o w s t h a t t h e a ct i n f i l a m e n t s a r e a n c h o r e d a t f o ca l co n t a ct s. F i g u r e b y F u n d e r b u r g h e t a l ( 2 7 0 ) f r o m t h e Jo u r n a l o f B i o l o g i ca l C h e m i st r y, N o v 2 0 0 1 ( 2 7 6 ) : 4 4 1 7 3 ( N o co p y r i g h t r e q u e st n e e d e d t o u se f i g u r e i n t h e si s)

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1 8 A ct i va t e d ke r a t o cyt e s a r e t r a n sf o r m e d t o t h e m yo f i b r o b l a st i c p h e n o t yp e b y a d d i n g T G F b t o t h e 1 0 % se r u m co n t a i n i n g cu l t u r e m e d i u m T h e se ce l l s h a ve p r o m i n e n t st r e ss f i b e r s t h a t a r e a n ch o r e d a t p r o m i n e n t f o ca l a d h e si o n s ( F i g u r e 4 B ) a n d se cr e t e t h e f i b r o t i c E C M m a r ke r s p r e vi o u sl y d e scr i b e d T h e s e ce l l s a l so e xp r e ss a S M A i n t h e i r cyt o so l W h i l e i t i s co m m o n l y a ss u m e d t h a t b o vi n e ke r a t o cyt e s r e q u i r e b o t h se r u m a n d T G F b t o b e co m e m yo f i b r o b l a st i c, cu r r e n t e vi d e n ce su g g e st s t h a t t h e p r e se n ce o f T G F b a l o n e i n t h e m e d i u m i s s u f f i ci e n t ( 1 0 1 ) T h i s t r a n sf o r m a t i o n h o w e ve r i s sl o w a n d t h o u g h t t o b e d u e t o t h e a u t o cr i n e se c r e t i o n o f g r o w t h f a ct o r s b y t h e ce l l s e xp o se d t o T G F b T h e t r a n sf o r m a t i o n i s sp e d u p i f t h e ce l l s a r e cu l t u r e d i n m e d i u m co n t a i n i n g g r o w t h f a ct o r s. M a su r e t a l ( 1 0 2 ) h a ve sh o w e d t h a t r a b b i t k e r a t o cy t e s ca n b e c o m e m yo f i b r o b l a st i c w h e n p l a t e d a t l o w d e n si t y a n d a r e g r o w n t o co n f l u e n c e i n se r u m a n d Je st e r e t a l ( 1 0 1 ) h a ve sh o w n t h a t t h e y a l so b e co m e m yo f i b r o b l a s t i c i n S F M su p p l e m e n t e d w i t h T G F b T h i s su g g e st s t h a t q u i e sce n t r a b b i t ke r a t o cyt e s r e sp o n d t o T G F b a n d t h a t t h e se ce l l s p r o d u ce a u t o cr i n e T G F b w h e n g r o w n i n se r u m w h i ch t h e n i n d u ce s t h e m yo f i b r o b l a s t p h e n o t yp e T h e m yo f i b r o b l a st i c p h e n o t yp e a t l e a st i n r a b b i t s, ca n b e r e ve r se d b y t h e a d d i t i o n o f F G F 2 a n d h e p a r i n t o t h e cu l t u r e m e d i u m ( 1 0 3 ) o r b y r e p l a t i n g t h e m yo f i b r o b l a st s a t h i g h d e n si t y ( 1 0 2 ) I t i s n o t ye t kn o w n h o w e ve r i f t h i s r e ve r si o n a l so o ccu r s i n vi vo Je st e r e t a l a s w e l l a s M o h a n e t a l ( 9 5 ) h a ve p r e s e n t e d e vi d e n ce t h a t m yo f i b r o b l a st s u n d e r g o a p o p t o t i c ce l l d e a t h u p o n w o u n d r e so l u t i o n T h e i d e n t i f i ca t i o n o f m a r k e r s f o r e a c h ke r a t o cyt e p h e n o t yp e a l l o w s r e s e a r ch e r s t o d e t e r m i n e i f t h e i r cu l t u r e co n d i t i o n s ca u se p h e n o t yp i c ch a n g e s o f t h e se ce l l s.

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1 9 C O R N E A L W O U N D H E A L I N G S e ve r a l e xce l l e n t r e vi e w s o f t h e i n t e r a ct i o n s b e t w e e n t h e co r n e a l e p i t h e l i u m a n d st r o m a d u r i n g w o u n d h e a l i n g a n d o f t h e cyt o ki n e s i n vo l v e d i n t h e p r o ce ss ca n b e f o u n d i n t h e l i t e r a t u r e ( 6 4 1 0 4 1 1 0 ) A f t e r w o u n d i n g cyt o ki n e s m a d e a n d s e cr e t e d b y e p i t h e l i a l ce l l s, l i ke I L 1 a n d T G F # ca n e n t e r t h e st r o m a i f t h e b a se m e n t m e m b r a n e h a s b e e n d i sr u p t e d I L 1 st i m u l a t e s t h e e xp r e ssi o n o f F A S l i g a n d b y ke r a t o cyt e s, a n d t h i s h a s b e e n i m p l i ca t e d i n t h e r e su l t i n g a p o p t o si s o f t h e ke r a t o cyt e s ( 1 0 7 ) T h e T G F # se cr e t e d b y t h e e p i t h e l i u m w h i ch e n t e r s t h e st r o m a a f t e r b a s e m e n t m e m b r a n e d i sr u p t i o n c a u se s t h e m yo f i b r o b l a st i c t r a n sf o r m a t i o n o f t h e ke r a t o cyt e s. O t h e r cyt o ki n e s, m a d e b y ke r a t o cyt e s l i ke H G F a n d K G F h a v e b e e n sh o w n t o st i m u l a t e e p i t h e l i a l ce l l m i g r a t i o n a s h a s l u m i ca n o n e o f t h e c o r n e a l K S P G s. T h e s e i n t e r a ct i o n s, b e t w e e n t h e e p i t h e l i u m a n d st r o m a m a k e i t d i f f i cu l t t o st u d y t h e h e a l i n g r e s p o n se o f t h e ce l l s i n t h e st r o m a a l o n e T h e st u d y o f a p u r e l y st r o m a l w o u n d h e a l i n g r e sp o n se h o w e ve r h a s b e e n f a ci l i t a t e d b y t h e d e ve l o p m e n t o f L A S I K e ye su r g e r y. I n t h i s t yp e o f r e f r a ct i ve su r g e r y, a st r o m a l e p i t h e l i a l f l a p i s cr e a t e d u si n g a m i cr o k e r a t o m e a n d r e su l t s i n o n l y l o ca l i ze d e p i t h e l i a l b a se m e n t m e m b r a n e d i sr u p t i o n a t t h e f l a p e d g e w i t h m o st o f t h e w o u n d a r e a cr e a t e d i n si d e t h e co r n e a l st r o m a T h e w o u n d h e a l i n g r e sp o n se w i l l b e d e sc r i b e d b r i e f l y l a t e r T h e d e n si t y o f t h e ce l l s i n t h e s t r o m a d e cr e a s e d co n si d e r a b l y a f t e r co r n e a l w o u n d i n g ( 1 1 1 ) M o st st u d i e s a t t r i b u t e d t h i s r a p i d d e cr e a se t o ce l l u l a r d a m a g e F i g u r e 5 t h a t o ccu r r e d d u r i n g t h e w o u n d i n g p r o ce ss ( 9 5 ) I t i s n o w a cce p t e d

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2 0 h o w e ve r t h a t t h i s d e cr e a se i s d u e t o b o t h n e cr o t i c a n d a p o p t o t i c c e l l d e a t h ( 6 4 1 0 9 1 1 2 1 1 5 ) W h i l e t h e e xa ct r e a s o n s a n d i n i t i a t o r s o f t h e a p o p t o t i c e ve n t a r e n o t kn o w n se ve r a l p o ssi b l e ca n d i d a t e s h a ve b e e n i d e n t i f i e d I L 1 P A F F A S l i g a n d h a v e a l l b e e n sh o w n t o c a u se a p o p t o si s i n ke r a t o cyt e s i n vi vo a n d i n vi t r o ( 9 6 1 1 0 1 1 6 1 1 7 ) T h e se cyt o ki n e s a r e r e l e a se d b y t h e d a m a g e d e p i t h e l i u m B o w m a n s m e m b r a n e o r a r e p r e se n t i n t e a r f l u i d ( 1 0 5 1 0 7 1 1 8 ) H o w e ve r ke r a t o cy t e a p o p t o si s i s a l so o b se r ve d e ve n i f t h e co r n e a m e r e l y e xp e r i e n ce s p r e ssu r e e xe r t e d o n i t b y a l e n s o r r i n g ( 1 1 9 ) i n d i ca t i n g t h a t e p i t h e l i a l d a m a g e o r st r o m a l d i sr u p t i o n i s n o t r e q u i r e d f o r t h e a p o p t o t i c r e sp o n se T h i s a p o p t o t i c e ve n t i s n o t l i m i t e d t o ce l l s i m m e d i a t e l y i n t h e i n j u r y si t e b u t r e su l t s i n t h e f o r m a t i o n o f a r e l a t i ve l y l a r g e c e l l vo i d sp a ce i n t h e co r n e a a d j a ce n t t o t h e w o u n d si t e ( 9 5 1 1 1 ) B e ca u se m o st a n i m a l s r e q u i r e vi su a l a c u i t y t o su r vi ve t h i s h a s l e d t o t h e t h e o r y t h a t t h e r a p i d l o ss o f ke r a t o cyt e s i s a n e vo l u t i o n a r y m e ch a n i sm t o p r e ve n t i n f e ct i o n o f ke r a t o cy t e s b y p a t h o g e n s ( 1 1 5 ) u p o n e p i t h e l i a l b a r r i e r d a m a g e

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2 1 F i g u r e 5 S c r a p e i n j u r y w o u n d h e a l i n g ( f r o m Z i e ske e t a l 2 0 0 1 ) sh o w s t h e h e a l i n g o f a co r n e a l scr a p e w o u n d i n r a t o v e r 1 0 d a ys ( 6 4 ) F i g u r e u se d w i t h p e r m i ssi o n b o t h f r o m t h e o r i g i n a l a u t h o r a n d a l so f r o m E l se vi e r R e p r i n t e d f r o m E xp e r i m e n t a l E ye R e se a r ch 7 2 ( 1 ) 3 3 3 9 S e ct i o n s w e r e st a i n e d w i t h p r o p i d i u m i o d i d e ( r e d f o r D N A ) a n d w i t h K i 6 7 ( g r e e n m a r ke r o f ce l l cycl e ) A r r o w s i n P a n e l B ( 8 h o u r s ) i n d i ca t e t h e o r i g i n a l m a r g i n o f t h e e p i t h e l i a l sc r a p e A r r o w s i n P a n e l s C a n d F ( 2 4 h o u r s a n d 1 2 0 h o u r s, r e sp e ct i v e l y) i n d i ca t e s p r o l i f e r a t i n g ke r a t o cyt e s st a i n i n g p o si t i ve f o r K i 6 7

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2 2 F i g u r e 5

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2 3 I n t h e t o p p a n e l w h i ch sh o w s t h e co r n e a p r i o r t o w o u n d i n g o n l y 3 0 4 0 % o f t h e e p i t h e l i a l ce l l s st a i n p o si t i ve f o r K i 6 7 i n d i ca t i n g t h a t t h e y a r e d i vi d i n g N o p o si t i ve ce l l s a r e o b se r ve d i n t h e s t r o m a o r e n d o t h e l i u m E i g h t h o u r s a f t e r scr a p i n g t h e ce l l s i n t h e a n t e r i o r st r o m a a d j a ce n t t o t h e w o u n d h a ve d i sa p p e a r e d ( a p o p t o si s) A f t e r w o u n d i n g a n d w i t h i n 2 4 h o u r s t h e co r n e a l e p i t h e l i u m l o o se n s i t s a t t a ch m e n t s t o t h e b a se m e n t m e m b r a n e t h e ce l l s f l a t t e n a n d m i g r a t e o ve r t h e e xp o se d b a se m e n t m e m b r a n e a s a s h e e t a n d cl o se t h e d e f e ct ( F i g u r e 5 ) A m o n g f a ct o r s t h a t f a ci l i t a t e e p i t h e l i a l ce l l m i g r a t i o n a r e K G F H G F I G F 1 a n d P D G F a s w e l l a s t h e f i b r o n e ct i n d e p o si t e d d u r i n g w o u n d h e a l i n g ( 1 1 0 1 2 0 ) I n d i vi d u a l k e r a t o cy t e s a d j a ce n t t o t h e ce l l v o i d a r e a n o w st a i n p o si t i ve f o r K i 6 7 i n d i ca t i n g t h a t t h e y h a ve l e f t G 0 a n d e n t e r e d t h e ce l l cycl e a n d h a ve b e co m e a ct i va t e d A f t e r 2 8 h o u r s, a n d co ve r a g e o f t h e e p i t h e l i a l d e f e ct b a sa l ce l l s o f t h e co r n e a l e p i t h e l i u m e n t e r t h e ce l l cycl e a n d st a r t t o p r o l i f e r a t e t o r e f o r m t h e s t r a t i f i e d e p i t h e l i u m T h e a n t e r i o r st r o m a n o w st a i n s f o r D N A h o w e ve r t h e se ce l l s a r e n o t p r o l i f e r a t i n g a n d Z i e ske e t a l ( 6 4 ) sp e c u l a t e t h a t t h e se ce l l s a r e i n f l a m m a t o r y c e l l s t h a t m i g r a t e i n t o t h e a n t e r i o r st r o m a t o t a k e ca r e o f a n y p a t h o g e n s t h a t m a y h a ve e n t e r e d t h e st r o m a a f t e r i n j u r y. I n t h e st r o m a w i t h i n 1 2 2 4 h o u r s p o st w o u n d i n g a n d t h e a p o p t o t i c e ve n t t h e ke r a t o cyt e s su r r o u n d i n g t h e ce l l vo i d sp a ce b e co m e a ct i va t e d r e e n t e r t h e ce l l cycl e a n d b e co m e m i g r a t o r y ( 6 4 1 1 3 1 1 5 1 2 1 ) I t i s n o t ye t kn o w n w h a t ca u se s t h e se ce l l s t o a ct i va t e b u t i t h a s b e e n p r o p o se d t h a t ke r a t o cyt e a ct i va t i o n i n vo l ve s cyt o ki n e s t h a t a r e r e l e a se d b y t h e d a m a g e d e p i t h e l i u m o r b y t h e a p o p t o t i c r e sp o n se o f t h e ke r a t o cyt e s. B y 4 4 h o u r s, t h e p o st e r i o r st r o m a st a i n s

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2 4 st r o n g l y f o r K i 6 7 i n d i ca t i n g t h a t m a n y o f t h e s e ce l l s h a ve e n t e r e d t h e ce l l cycl e B y 1 2 0 h o u r s, o n l y t h e a n t e r i o r st r o m a st a i n s f o r K i 6 7 su g g e st i n g t h a t i n t h e p o st e r i o r st r o m a t h e ke r a t o cyt e s h a ve e xi t e d t h e ce l l cycl e l i ke l y d u e t o c e l l ce l l co n t a ct i n h i b i t i o n O n l y ce l l s t h a t h a ve sp a ce t o g r o w i n t h e a n t e r i o r st r o m a p r o l i f e r a t e B y 2 4 0 h o u r s, b o t h st a i n i n g f o r K i 6 7 a n d p r o p i d i u m i o d i d e i n t h e e p i t h e l i u m a n d t h e s t r o m a r e se m b l e t h e st a i n i n g p r i o r t o w o u n d i n g T h e w o u n d h e a l i n g r e sp o n se i n t h i s m o d e l d i d n o t r e su l t i n a n y ce l l s st a i n i n g p o si t i ve f o r a S M A i n d i ca t i n g t h a t t h e h e a l i n g p r o ce ss i n vo l ve d a ct i va t e d ke r a t o cyt e s o n l y a n d n o t m y o f i b r o b l a st i c ke r a t o cyt e s C o r n e a l f i b r o b l a st s h a ve b e e n sh o w n t o e i t h e r p r o d u ce o r e xp r e ss r e ce p t o r s t o B M P 2 a n d 4 E G F F G F 2 I G F s I a n d I I i n su l i n L P A P D G F a n d T G F b ( 1 2 2 1 2 5 ) W i t h t h e e xce p t i o n o f T G F # 1 a n d 2 a l l t h e se g r o w t h f a ct o r s h a ve b e e n sh o w n t o st i m u l a t e ce l l g r o w t h ( 1 2 5 ) M a i n t a i n i n g t h e i n t e g r i t y o f B o w m a n s m e m b r a n e o r t h e b a se m e n t m e m b r a n e p r e ve n t s t h e e n t r y o f T G F # 2 i n t o t h e st r o m a I n t h e se ca s e s, a s sh o w n a b o ve t h e w o u n d h e a l i n g o cc u r s w i t h o u t t h e m yo f i b r o b l a st i c t r a n s f o r m a t i o n o f t h e ce l l s ( 1 2 6 ) T h e ce l l s i n t h e st r o m a h o w e v e r st i l l b e co m e a ct i va t e d a n d p r o l i f e r a t e u n t i l t h e y h a ve r e f o r m e d t h e ce l l n e t w o r k i n t h e st r o m a a n d t h e n b e co m e q u i e sce n t a g a i n ( 6 4 ) I n ci si o n a l w o u n d s, h o w e v e r d a m a g e t h e e p i t h e l i u m a n d t h e b a se m e n t m e m b r a n e a n d a l so a f f e ct t h e b i o m e c h a n i c a l st r u ct u r e o f t h e co r n e a A s a co n se q u e n c e m i t o g e n s a n d m o r p h o g e n s e i t h e r m a d e b y t h e e p i t h e l i u m a n d se q u e st e r e d i n t h e b a s e m e n t m e m b r a n e o r p r e se n t i n t e a r s, e n t e r t h e st r o m a a n d ca u s e t h e m yo f i b r o b l a s t i c d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e ke r a t o cyt e s ( 1 2 6 ) C i n t r o n

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2 5 d e ve l o p e d a f u l l t h i ckn e ss, p e n e t r a t i n g w o u n d m o d e l u si n g a 3 m m t r e p h i n e o n yo u n g r a b b i t s ( 1 2 7 ) A f i b r i n p l u g w h i ch se r v e s a s a t e m p o r a r y m a t r i x f o r ce l l u l a r m i g r a t i o n f o r m s s h o r t l y a f t e r w o u n d i n g I n i t i a l l y, t h e p l u g i s co ve r e d b y t h e m i g r a t i n g e p i t h e l i u m A f t e r t h e e p i t h e l i u m h a s co ve r e d t h e p l u g st r o m a l c e l l s i n va d e i t a n d w i t h i n t h r e e w e e ks r e p l a ce i t b y a n e w l y se cr e t e d m a t r i x ( 3 ) T h e n e w m a t r i x, h o w e ve r i s d i f f e r e n t t h a n t h e m a t r i x p r e se n t p r i o r t o w o u n d i n g C o l l a g e n t yp e I I I e xp r e ssi o n i s u p r e g u l a t e d a n d t h e l e ve l s o f ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n s syn t h e si ze d a n d t h e i r su l f a t i o n d e cr e a s e ; d e co r i n a n d b i g l yca n syn t h e si s a r e u p r e g u l a t e d w h i l e c h o n d r o i t i n s u l f a t e G A G ch a i n si ze a l so i n cr e a s e s ( 4 3 8 6 9 3 1 0 0 ) O t h e r f i b r o t i c E C M co m p o n e n t s se c r e t e d b y t h e se ce l l s a r e f i b r o n e ct i n l a m i n i n p e r l e ca n a n d S P A R C ( 4 3 9 3 1 2 8 ) T h e se ch a n g e s i n E C M co m p o n e n t s s e cr e t e d d u r i n g t h e h e a l i n g p h a se d i s r u p t t h e n o r m a l st r o m a l o r g a n i za t i o n a n d co m b i n e d w i t h a d e cr e a se i n t h e h o m o g e n e i t y o f t h e co l l a g e n f i b r i l d i a m e t e r a r e d e t e ct e d a s co r n e a l h a ze ( 1 2 9 ) T h e a ct i va t e d a n d m yo f i b r o b l a st i c ce l l s a l so co n t r i b u t e t o t h e d e t e ct a b l e h a ze ( 8 5 ) O ve r t i m e h o w e ve r t h e f i b r o t i c t i ssu e i s r e m o d e l e d ; t h e i r r e g u l a r co l l a g e n f i b r i l s a r e r e d u c e d i n si ze a n d t h e E C M r e t u r n s t o a st a t e t h a t r e s e m b l e s t h e p r e w o u n d s t a t e C o n se q u e n t l y, t h e p r e w o u n d st a t e o f t h e co r n e a i s r e st o r e d a n d t h e co r n e a r e c o ve r s i t s t r a n sp a r e n cy ( 4 3 1 2 7 ) W o u n d s t h a t cu t t h r o u g h t h e b a se m e n t m e m b r a n e o f t h e e p i t h e l i u m a n d i n t o t h e st r o m a d o n o t f o r m a n i n i t i a l f i b r i n p l u g b u t t h e y a l so b e c o m e f i b r o t i c a s h a s b e e n sh o w n u si n g yo u n g c h i ck co r n e a s ( 9 3 )

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2 6 T h e d e ve l o p m e n t o f L A S I K e ye su r g e r y h a s o f f e r e d sci e n t i st s t h e p o ssi b i l i t y o f st u d yi n g t h e st r o m a l w o u n d h e a l i n g r e sp o n s e i n t h e a b se n ce o f m a j o r e p i t h e l i a l d i s r u p t i o n ( 9 5 1 0 4 1 1 3 1 3 0 ) D u r i n g L A S I K su r g e r y a l l t h e st r o m a l r e m o d e l i n g t a k e s p l a ce i n t h e a ct u a l st r o m a w i t h o u t d a m a g i n g t h e b a se m e n t m e m b r a n e i n t h e p h o t o a b l a t e d zo n e W h i l e so m e f i b r o si s i s so m e t i m e s o b se r ve d i t i s l i m i t e d t o t h e a r e a s w h e r e t h e m i cr o ke r a t o m e cu t s t h r o u g h t h e e p i t h e l i u m a n d b a se m e n t m e m b r a n e ( 1 3 0 ) Ju st a s i n scr a p e a n d i n ci si o n w o u n d s, t h e i n i t i a l r e sp o n s e o f t h e ke r a t o cyt e s a d j a c e n t t o t h e i n ci si o n si t e i s t o u n d e r g o a p o p t o t i c ce l l d e a t h a n d cr e a t e t h e ch a r a ct e r i st i c ce l l vo i d sp a ce ( 1 1 1 ) K e r a t o cyt e s t h e n b e co m e a c t i va t e d p r o l i f e r a t e a n d m i g r a t e t o r e p o p u l a t e t h i s sp a ce w i t h o u t b e co m i n g m yo f i b r o b l a st i c ( 1 1 1 ) S P E C I F I C A I M S T h e w o r k i n D r H a sse l l s l a b o r a t o r y h a s f o c u se d o n t h e g o a l o f i d e n t i f yi n g t h e m i t o g e n s t h a t a ct i va t e k e r a t o cyt e s a n d t h e g r o w t h f a ct o r s t h a t w i l l i n d u ce ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e w h i l e m a i n t a i n i n g t h e i r n o r m a l n a t i ve p h e n o t yp e W h e n t h e r e se a r ch p r e se n t e d i n t h i s d i sse r t a t i o n w a s st a r t e d ke r a t o cyt e s w e r e p l a t e d i n l o w co n ce n t r a t i o n s o f p l a t e l e t p o o r h o r se se r u m t o m a i n t a i n t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e a n d t h e n se r u m a d d e d a t 1 0 % t o t h e m e d i u m t o r e p l i ca t e t h e p h e n o t yp i ca l ch a n g e d u r i n g ke r a t o cyt e a ct i va t i o n T h e co r n e a h o w e ve r i s a va scu l a r a n d co r n e a l n e o va scu l a r i za t i o n r e su l t s i n p e r m a n e n t d a m a g e t o t h e co r n e a I t i s t h e r e f o r e u n l i ke l y t h a t t h e a ct i va t i o n o f ke r a t o cyt e s i n vi vo i s ca u se d b y e xp o su r e t o se r u m o r t o m i t o g e n s p r e se n t i n s e r u m C o n t r a r y t o t h e

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2 7 f i b r o b l a st / m yo f i b r o b l a st d i f f e r e n t i a t i o n w h i ch h a s b e e n sh o w n b o t h i n vi v o a n d i n vi t r o t o b e m o d u l a t e d b y T G F ( 9 8 ) t h e m i t o g e n s t h a t s t i m u l a t e t h e t r a n si t i o n f r o m t h e q u i e sce n t t o t h e a ct i va t e d ke r a t o c yt e p h e n o t yp e i n vi vo h a ve n o t ye t b e e n i d e n t i f i e d T h i s ke r a t o cyt e a ct i va t i o n i s t h e i n i t i a l p h a s e o f t h e st r o m a l w o u n d h e a l i n g r e sp o n se a f t e r t h e a p o p t o t i c e ve n t T h e f i r st a i m o f t h i s d i sse r t a t i o n w a s t o d e ve l o p a cu l t u r e m e d i u m t h a t w i l l a l l o w t h e st u d y o f t h e a ct i va t e d ke r a t o cyt e p h e n o t yp e B a se d o n t h e scr a p e w o u n d h e a l i n g r e sp o n se m o d e l i n w h i ch t h e b a se m e n t m e m b r a n e i s n o t d a m a g e d w e p r o p o se d t h e h yp o t h e si s t h a t t h e co r n e a l st r o m a a l r e a d y co n t a i n s t h e m i t o g e n s r e q u i r e d f o r t h e t r a n si t i o n f r o m t h e q u i e sc e n t t o t h e a ct i va t e d ke r a t o cyt e p h e n o t yp e T h e w o r k d e sc r i b e d i n t h e f i r st p a p e r o f t h i s d i sse r t a t i o n t e st s t h i s h y p o t h e si s b y p r e p a r i n g a st r o m a l e x t r a ct a n d co m p a r e s i t s a ct i vi t y t o F B S T h e b i o ch e m i ca l a n d b i o p h ysi ca l ch a r a ct e r i st i cs o f t h i s e xt r a ct a n d t h e r e sp o n se o f ke r a t o cyt e cu l t u r e s t o t h e e xt r a ct a r e d e t e r m i n e d S u p p l e m e n t a l d a t a t o t h e p u b l i sh e d m a n u scr i p t a r e p r e s e n t e d a f t e r t h e p a p e r a n d f u r t h e r ch a r a ct e r i ze t h e m i t o g e n s i n t h e s t r o m a l e xt r a ct T h e se co n d a i m o f t h i s d i sse r t a t i o n w a s t o d e ve l o p a d e f i n e d cu l t u r e m e d i u m t h a t s t i m u l a t e s ke r a t o cyt e s t o g r o w w i t h o u t t h e l o ss o f t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e K e r a t o cyt e s i n cu l t u r e a r e q u i e sc e n t a n d d o n o t p r o l i f e r a t e A g r o w t h m e d i u m t h a t a l l o w s f o r ke r a t o cyt e g r o w t h w i t h o u t t h e l o ss o f t h e k e r a t o cy t e p h e n o t yp e w o u l d a l l o w a m o r e co m p l e t e ch a r a ct e r i za t i o n o f t h e k e r a t o cyt e p h e n o t yp e I n t h e se co n d p a p e r w e sh o w t h a t k e r a t o cyt e s ca n b e g r o w n i n d e f i n e d cu l t u r e m e d i u m co n t a i n i n g i n su l i n w h i l e m a i n t a i n i n g h i g h l e ve l s o f A L D H

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2 8 i n t h e i r cyt o so l se c r e t i n g ke r a t o c a n a n d m a i n t a i n i n g a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y. W e a l so sh o w t h a t t h e p r o t e o g l yc a n s se cr e t e d b y ke r a t o cyt e s a t l o w d e n si t y a r e d e g r a d e d a n d t h a t t h i s d e g r a d a t i o n ca n b e p r e ve n t e d b y t h e a d d i t i o n o f g r o w t h f a ct o r s t o t h e m e d i u m T h e co r n e a co n t a i n s h i g h l e ve l s o f a sco r b a t e a n d a sco r b a t e i s r e q u i r e d f o r t h e h yd r o xyl a t i o n o f co l l a g e n I n t h e t h i r d p a p e r w e a d d e d a sco r b a t e t o t h e i n su l i n co n t a i n i n g m e d i u m d e scr i b e d i n t h e se co n d p a p e r a n d m e a su r e d ce l l p r o l i f e r a t i o n co l l a g e n a n d ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n e xp r e ssi o n W e f i n d t h a t h i g h l e ve l s o f K S P G p r o d u ct i o n a r e d e p e n d e n t i n p a r t u p o n t h e h yd r o xyl a t i o n o f c o l l a g e n

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2 9 P A P E R 1 : I S O L A T I O N O F A P U T A T I V E K E R A T O C Y T E A C T I V A T I N G F A C T O R F R O M T H E C O R N E A L S T R O M A K u r t M u s s e l m a n n B r a d l e y P K a n e a n d J o h n R H a s s e l l T h e D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y C o l l e g e o f M e d i c i n e U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a T a m p a F L 3 3 6 1 2 A n d D e p a r t m e n t o f R e s e a r c h S h r i n e r s H o s p i t a l f o r C h i l d r e n 1 2 5 0 2 P i n e D r i v e T a m p a F L 3 3 6 1 2 P u b l i s h e d i n E x p e r i m e n t a l E y e R e s e a r c h 7 7 ( 2 0 0 3 ) 2 7 3 2 7 9

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3 0 S U M M A R Y F e t a l b o vi n e s e r u m h a s co m m o n l y b e e n u se d t o e xp a n d t h e p o p u l a t i o n o f ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e T i ssu e e xt r a ct s, h o w e ve r h a ve a l so b e e n u se d t o g r o w o t h e r ce l l t yp e s. W e p r e p a r e d a D M E M / F 1 2 e xt r a ct o f co r n e a l st r o m a a n d co m p a r e d t h e g r o w t h a n d m o r p h o l o g y o f co l l a g e n a se i so l a t e d ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n D M E M / F 1 2 o r D M E M / F 1 2 co n t a i n i n g e i t h e r st r o m a l e xt r a c t o r f e t a l b o vi n e se r u m C e l l p r o l i f e r a t i o n w a s m e a su r e d b y 3 H t h y m i d i n e a n d B r d U i n co r p o r a t i o n a s w e l l a s b y D N A q u a n t i t a t i o n T h e e xt r a ct w a s f r a ct i o n a t e d b y g e l f i l t r a t i o n C e l l m o r p h o l o g y w a s a sse sse d b y p h a se co n t r a st m i cr o sco p y. C u l t u r e i n b o t h e xt r a ct a n d se r u m st i m u l a t e d ke r a t o c yt e s t o p r o l i f e r a t e b u t ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n t h e e xt r a ct g r e w m o r e sl o w l y d u e t o a l o n g e r ce l l cycl e a n d t o a l o w e r f i n a l d e n si t y b e ca u se o f g r e a t e r se n si t i vi t y t o co n t a ct i n h i b i t i o n K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n se r u m b e ca m e f i b r o b l a st i c w h i l e t h o se cu l t u r e d i n e xt r a ct r e t a i n e d t h e d e n d r i t i c m o r p h o l o g y o f q u i e sc e n t ke r a t o cyt e s. T h e st i m u l a t i n g f a ct o r s i n t h e co r n e a l e xt r a ct w e r e m o r e s e n si t i ve t o h e a t i n a ct i va t i o n a n d o f h i g h e r m o l e cu l a r w e i g h t t h a n t h e st i m u l a t i n g f a ct o r s i n se r u m T h e s e r e su l t s i n d i ca t e t h a t t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y i n e xt r a c t a n d s e r u m a r e d i f f e r e n t a n d t h a t t h e p h e n o t yp e s r e su l t i n g f r o m g r o w t h i n s e r u m a n d e xt r a ct a r e a l so d i f f e r e n t K e r a t o cyt e s cu l t u r e d a t l o w ce l l d e n si t i e s i n t h e co r n e a l e xt r a ct m a y m i m i c ke r a t o cyt e a ct i va t i o n a n i n i t i a l a n d cr u ci a l e ve n t f o r ke r a t o cyt e s d u r i n g t h e co r n e a l w o u n d h e a l i n g p r o ce ss.

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3 1 I N T R O D U C T I O N T h e co r n e a l st r o m a co n si st s p r i m a r i l y o f a u n i q u e l y t r a n sp a r e n t e xt r a ce l l u l a r m a t r i x co m p o s e d o f co l l a g e n f i b r i l s a n d p r o t e o g l yca n s ( 4 6 1 3 1 ) T h i s m a t r i x i s syn t h e si ze d a n d d e p o si t e d b y ke r a t o cyt e s, w h i ch a r e i n t e r s p e r se d t h r o u g h o u t t h e co l l a g e n sc a f f o l d I n t h e a d u l t co r n e a t h e ke r a t o cyt e s h a ve a q u i e sce n t p h e n o t yp e t h a t i s ch a r a ct e r i ze d b y a u n i q u e d e n d r i t i c m o r p h o l o g y a n d a ve r y l o w t o n o n e xi st e n t r a t e o f p r o l i f e r a t i o n ( 6 4 8 4 1 3 2 ) K e r a t o cyt e s f o r m a t h r e e d i m e n si o n a l n e t w o r k o f ce l l s i n co n t a ct w i t h o n e a n o t h e r b y t h e i r e xt e n si ve d e n d r i t i c p r o ce sse s ( 5 8 1 3 3 1 3 4 ) ( 6 4 ) W h e n t h e co r n e a i s w o u n d e d t h e i n j u r e d a n d d a m a g e d ke r a t o cyt e s a s w e l l a s ke r a t o cyt e s f l a n ki n g t h e w o u n d u n d e r g o a p o p t o si s ( 6 4 1 0 5 1 1 3 1 3 5 ) S o m e o f t h e vi a b l e r e m a i n i n g k e r a t o cy t e s b e c o m e a ct i va t e d t o p r o l i f e r a t e a n d m i g r a t e t o t h e w o u n d si t e ( 6 4 1 3 6 1 3 7 ) K e r a t o cyt e s a n d / o r a ct i va t e d ke r a t o cyt e s ca n a l so b e co m e m yo f i b r o b l a st s, ke r a t o cyt e d e r i va t i ve s ch a r a ct e r i ze d b y t h e p r e s e n ce o f e xt e n si ve sm o o t h m u scl e ( S M ) a ct i n f i l a m e n t s ( 1 3 8 ) T G F b h a s b e e n sh o w n t o i n d u ce ke r a t o cyt e s t o b e co m e m yo f i b r o b l a st s i n vi t r o ( 9 8 ) a n d i s r e s p o n si b l e f o r p r o d u ci n g t h e m yo f i b r o b l a st p h e n o t yp e i n vi vo ( 8 9 ) F i b r o b l a st g r o w t h f a ct o r h a s b e e n sh o w n t o b e a n t a g o n i st i c t o t h i s p h e n o t yp e ( 1 0 3 ) T h e s e o b se r va t i o n s su g g e st t h a t t h e r e a r e a t l e a st t h r e e d i f f e r e n t i n vi v o ke r a t o cyt e p h e n o t yp e s: q u i e sce n t a ct i v a t e d a n d m yo f i b r o b l a st C o l l a g e n a se i so l a t e d ke r a t o c yt e s cu l t u r e d i n se r u m f r e e m e d i u m d o n o t p r o l i f e r a t e a n d r e t a i n m a n y a sp e ct s o f t h e i r i n vi vo q u i e sce n t p h e n o t yp e ( 6 6 9 8 1 0 0 1 3 9 ) F e t a l b o vi n e se r u m w i l l i n d u ce ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e t o

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3 2 p r o l i f e r a t e b u t a l so ca u se s ke r a t o cyt e s t o b e c o m e f i b r o b l a st s a n d m yo f i b r o b l a st s ( 1 0 2 ) E xt r a ct s o f t h e E H S t u m o r k n o w n a s M a t r i g e l ca n i n d u ce c e r t a i n ce l l t yp e s t o p r o l i f e r a t e a n d m a i n t a i n a m o r e n a t i ve p h e n o t yp e i n cu l t u r e t h a n t h a t a ch i e ve d b y cu l t u r e i n m e d i u m co n t a i n i n g se r u m ( 1 4 0 1 4 5 ) T h e ce l l s t h a t co m p r i se t h e E H S t u m o r p r o d u ce a n e xt e n si ve b a se m e n t m e m b r a n e m a t r i x w h i ch co n si st s o f co l l a g e n I V a n d l a m i n i n a n d t h e e x t r a ct s o f t h e t u m o r p r i m a r i l y b e n e f i t c e l l s t h a t m a k e b a s e m e n t m e m b r a n e s su ch a s e n d o t h e l i a l a n d e p i t h e l i a l ce l l s. K e r a t o cyt e s a r e e m b e d d e d i n a n e x t r a c e l l u l a r m a t r i x, c o n si st i n g p r i m a r i l y o f co l l a g e n t yp e s I a n d V a s w e l l a s l e u ci n e r i ch p r o t e o g l yca n s ( 4 6 1 3 1 ) C o n se q u e n t l y, w e p r e p a r e d a n e xt r a ct o f c o r n e a l st r o m a t o u se a s a cu l t u r e m e d i u m f o r k e r a t o cy t e s. T h e r e su l t s s h o w e d t h a t m u ch l i ke se r u m st r o m a l e xt r a ct st i m u l a t e d t h e p r o l i f e r a t i o n o f ke r a t o cyt e s, b u t ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a ct a p p e a r e d p h e n o t yp i ca l l y d i st i n c t f r o m ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n se r u m M A T E R I A L S A N D M E T H O D S S t r o m a l e x t r a c t p r e p a r a t i o n T h e e p i t h e l i a o f t w e l ve m o n t h o l d ca l f co r n e a s w a s r e m o ve d b y scr a p i n g t h e co r n e a s w i t h a 1 0 r o u n d e d b l a d e sca l p e l a n d t h e e n d o t h e l i a r e m o ve d b y b l o t t i n g t h e co r n e a s o n f i l t e r p a p e r T h e r e su l t i n g c o r n e a l st r o m a s w e r e m i n ce d u si n g a r a zo r b l a d e a n d t h e n h o m o g e n i ze d i n 5 m l o f D M E M F 1 2 p e r g r a m o f w e t w e i g h t co r n e a f o r o n e m i n u t e o n i ce u si n g a P o l yt r o n ( P T 3 1 0 0 K i n e m a t i ca ) T h e

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3 3 h o m o g e n a t e w a s g e n t l y r o cke d o ve r n i g h t a t 4 C a n d t h e i n so l u b l e m a t e r i a l p e l l e t e d a t 2 0 0 0 0 x g f o r 3 0 m i n u t e s. T h e h o m o g e n a t e w a s t h e n c e n t r i f u g e d a t 3 3 0 0 0 R P M f o r 1 h o u r i n a B e ckm a n 5 0 2 T i R o t o r T h i s cl a r i f i e d e xt r a c t w a s f i l t e r st e r i l i ze d u si n g a 0 2 m f i l t e r a n d st o r e d f r o ze n a t 8 0 C u n t i l f u r t h e r u se T h i s w a s d e si g n a t e d a s 1 0 0 % e xt r a ct a n d a l l f u r t h e r d i l u t i o n s o f t h e e xt r a ct w e r e m a d e w i t h f r e sh D M E M / F 1 2 p r i o r t o u se K e r a t o c y t e i s o l a t i o n a n d c u l t u r e B o vi n e ke r a t o cyt e s w e r e i s o l a t e d a n d cu l t u r e d a s p r e vi o u sl y d e sc r i b e d ( 1 0 0 ) B r i e f l y, co r n e a s w e r e d i sse ct e d f r o m f r e sh l y h a r ve st e d 1 2 m o n t h o l d c a l f e ye s ( P e l F r e e ze B i o l o g i ca l s, R o g e r s, A R ) a n d se q u e n t i a l l y d i g e s t e d w i t h co l l a g e n a se t o sp e ci f i ca l l y i so l a t e t h e ke r a t o cyt e s. T h e ke r a t o cyt e s w e r e p l a t e d a t 1 0 0 0 0 ce l l s/ cm 2 ( u n l e ss o t h e r w i se i n d i ca t e d ) i n D M E M / F 1 2 ( I n vi t r o g e n C a r l sb a d C A ) su p p l e m e n t e d w i t h 1 % p l a t e l e t p o o r h o r se se r u m ( P P H S ) P l a t i n g d a y w a s d e si g n a t e d d a y ze r o T h e m e d i u m w a s r e p l a ce d t h e n e xt d a y ( d a y 1 ) w i t h D M E M / F 1 2 D M E M / F 1 2 co n t a i n i n g 1 0 % f e t a l b o vi n e se r u m o r D M E M / F 1 2 co n t a i n i n g 2 0 % ( u n l e ss o t h e r w i se i n d i ca t e d ) st r o m a l e xt r a ct T h e m e d i u m w a s ch a n g e d e v e r y 4 d a y s. M e a s u r e m e n t o f D N A s y n t h e s i s C u l t u r e m e d i a w a s su p p l e m e n t e d w i t h 1 0 C i 3 H t h ym i d i n e ( N E N B o st o n M A ) p e r m l f r o m d a y 1 t o d a y 3 F o r t h e ce l l cycl e a n a l ysi s, t h e m e d i u m w a s su p p l e m e n t e d w i t h 1 0 C i 3 H t h ym i d i n e f o r o n l y 3 h o u r t i m e p e r i o d s. T h e

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3 4 m e d i u m w a s r e m o ve d a n d t h e ce l l s l yse d i n 7 5 l o f 0 2 % S D S f o r 1 0 m i n u t e s, a f t e r w h i ch 0 3 7 5 m l o f 1 X T N E w e r e a d d e d t o e a ch w e l l a n d g e n t l e r o cki n g co n t i n u e d f o r 1 0 m o r e m i n u t e s. T h e ce l l l a ye r s w e r e t h e n scr a p e d a n d t r a n sf e r r e d t o a 1 5 m l b o i l p r o o f E p p e n d o r f t u b e F i f t y m i cr o l i t e r s o f a 2 m g / m l B S A so l u t i o n a n d 1 / 1 0 vo l u m e o f co l d 1 0 0 % t r i ch l o r o a ce t i c a ci d ( T C A ) w e r e a l i q u o t e d i n t o e a ch t u b e t h e co n t e n t s m i xe d a n d n u cl e i c a ci d s a n d p r o t e i n s w e r e p r e ci p i t a t e d o n i ce f o r 1 h o u r o r a t 4 C o ve r n i g h t I n so l u b l e m a t e r i a l s w e r e p e l l e t e d b y ce n t r i f u g a t i o n a t 2 0 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n u t e s, a n d t h e p e l l e t w a sh e d t h r e e t i m e s w i t h co l d 5 % T C A T w o h u n d r e d m i cr o l i t e r s o f 1 0 % T C A w a s a d d e d t o e a ch t u b e p r i o r t o h e a t i n g sa m p l e s f o r 3 0 m i n u t e s a t 9 0 C t o h yd r o l yse t h e D N A T h e i n so l u b l e m a t e r i a l w a s r e m o ve d b y ce n t r i f u g a t i o n a n d t h e i so t o p e i n co r p o r a t i o n i n t h e su p e r n a t a n t w a s m e a su r e d b y l i q u i d sci n t i l l a t i o n co u n t i n g M o l e c u l a r s i e v e c h r o m a t o g r a p h y F i ve m l o f e i t h e r 1 0 0 % st r o m a l e xt r a ct o r 1 0 0 % f e t a l b o vi n e se r u m w e r e a p p l i e d t o a co l u m n ( 3 5 x 2 5 cm ) co n t a i n i n g S e p h a c r yl S 3 0 0 e q u i l i b r a t e d a n d e l u t e d i n D M E M / F 1 2 a t 3 m l / m i n T h e se r u m w a s d i a l yze d a g a i n st D M E M / F 1 2 p r i o r t o l o a d i n g o n t h e co l u m n N i n e m l f r a ct i o n s w e r e co l l e ct e d f i l t e r st e r i l i ze d a n d d i l u t e d t o 1 0 % i n D M E M / F 1 2 f o r u se a s c u l t u r e m e d i u m

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3 5 H e a t i n a c t i v a t i o n T w e n t y p e r ce n t d i l u t i o n s o f t h e e xt r a c t i n D M E M / F 1 2 o r 1 0 % d i l u t i o n s o f F B S w e r e i n cu b a t e d a t 5 0 6 0 7 0 8 0 a n d 9 0 C f o r t e n m i n u t e s a n d t h e n co o l e d i n i ce w a t e r E a ch a l i q u o t w a s st e r i l i ze d b y f i l t r a t i o n p r i o r t o h e a t i n g D N A c o n t e n t C e l l s w e r e h a r ve s t e d a t d e si g n a t e d t i m e p o i n t s a n d t h e D N A co n t e n t m e a su r e d u si n g a C yq u a n t ki t ( M o l e cu l a r P r o b e s, E u g e n e O R ) a cco r d i n g t o t h e m a n u f a ct u r e r s i n st r u ct i o n s. M i c r o m a s s c u l t u r e a n d B r d U l a b e l i n g 2 0 0 0 0 ke r a t o cyt e s i n 2 0 l o f D M E M / F 1 2 co n t a i n i n g 1 % P P H S w e r e sp o t t e d o n t o d r y t i ssu e cu l t u r e p l a t e s. A f t e r ce l l a t t a ch m e n t t h e w e l l s w e r e f l o o d e d w i t h D M E M / F 1 2 T h e m e d i u m w a s r e p l a ce d b y D M E M / F 1 2 o r D M E M / F 1 2 co n t a i n i n g 2 0 % st r o m a l e xt r a ct o n d a y 1 a n d t h e n su p p l e m e n t e d w i t h B r d U o n d a y 4 f o r 2 4 h o u r s. T h e B r d U l a b e l i n g a n d d e t e ct i o n K i t 2 ( R o ch e D i a g n o st i cs, I n d i a n a p o l i s, I N ) w a s u se d a n d t h e d e t e ct i o n p r o t o co l o p t i m i ze d f o r o u r e xp e r i m e n t T h e ce l l s w e r e p h o t o g r a p h e d u si n g a N i ko n i n ve r t e d m i cr o sco p e a n d a S P O T D i g i t a l ca m e r a

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3 6 S t a t i s t i c a l a n a l y s i s A l l st a t i st i ca l co m p a r i so n s w e r e m a d e u si n g S t a t vi e w V e r si o n 5 ( S A S I n st i t u t e C a r y, N C ) T h e d i f f e r e n t t r e a t m e n t g r o u p s w e r e e va l u a t e d u si n g a p a i r e d t t e st A l l f i g u r e s sh o w m e a n st a n d a r d e r r o r w h e n n $ 4 a n d m e a n st a n d a r d d e vi a t i o n f o r n < 4 R E S U L T S T h e e f f e ct o f i n cr e a si n g co n ce n t r a t i o n s o f st r o m a l e xt r a ct i n t h e m e d i u m o n 3 H t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n b y ke r a t o cyt e s w a s e va l u a t e d f i r st A p r o g r e ssi ve a n d si g n i f i ca n t i n cr e a s e i n 3 H t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n w a s o b se r ve d f r o m 2 % t o 2 0 % st r o m a l e xt r a ct t o a m a xi m u m w i t h 2 0 % e xt r a ct w i t h n o si g n i f i ca n t d i f f e r e n ce b e t w e e n 2 0 % 3 0 % a n d 5 0 % ( F i g u r e 1 ) S t i m u l a t i o n o f 3 H t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n b y m e d i u m co n t a i n i n g 1 0 % se r u m w a s si m i l a r t o 2 0 % st r o m a l e xt r a ct K i l l i n g t h e k e r a t o cyt e s b y f r e e zi n g t h e co r n e a s a t 8 0 C f o r 1 h o u r p r i o r t o m i n ci n g a n d e xt r a ct i o n d i d n o t a l t e r t h e a m o u n t o f e xt r a ct a b l e st i m u l a t o r y a ct i vi t y ( F i g u r e 2 ) T h i s i n d i ca t e s t h a t t h e D N A s yn t h e si s st i m u l a t i n g a ct i vi t y i s n o t d e r i ve d f r o m m e t a b o l i c p r o ce ss e s o r a p o p t o si s r e su l t i n g f r o m m i n ci n g a n d h o m o g e n i zi n g t h e c o r n e a l st r o m a s. W e t h e n d e t e r m i n e d 3 H t h ym i d i n e i n c o r p o r a t i o n f o r 3 h o u r se g m e n t s o ve r a 4 8 h o u r p e r i o d a f t e r t h e a d d i t i o n o f D M E M / F 1 2 D M E M / F 1 2 co n t a i n i n g 2 0 % e xt r a ct a n d D M E M / F 1 2 co n t a i n i n g 1 0 % se r u m ( F i g u r e 3 ) T h e r e w e r e 1 5 t o 1 8 h o u r l a g p e r i o d s f o r ce l l s cu l t u r e d i n se r u m a n d i n e xt r a ct r e sp e c t i ve l y, b e f o r e

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3 7 D N A syn t h e si s b e g a n t o r i se T h i s l o n g l a g t i m e i n d i ca t e s t h a t t h e ke r a t o cyt e s a r e l o cke d i n G 0 o f t h e ce l l cycl e a n d t h i s e xp l a i n s t h e i r q u i e sce n t b e h a vi o r i n si t u a n d i n c u l t u r e i n D M E M / F 1 2 a l o n e D N A syn t h e si s f o r ke r a t o cyt e s i n e xt r a ct r e a ch e d a m a xi m u m a t 2 4 h o u r s, d e cl i n e d t o n e a r l y b a se l i n e a t 3 9 h o u r s a n d t h e n r o se a g a i n a t 4 8 h o u r s. I n co n t r a st D N A syn t h e si s f o r k e r a t o cy t e s i n se r u m sh o w e d m a xi m a a t 2 1 3 6 a n d 4 2 h o u r s w i t h l i t t l e d e cl i n e i n b e t w e e n T h e se r e su l t s i n d i ca t e t h a t ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n s e r u m h a ve a sh o r t e r ce l l cycl e t h a n ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n e xt r a ct T h e g r o w t h r a t e o f k e r a t o cy t e s cu l t u r e d o ve r a 1 3 d a y t i m e p e r i o d w a s d e t e r m i n e d b y m e a su r i n g t h e D N A co n t e n t o f e a ch w e l l ( F i g u r e 4 ) K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n 1 0 % se r u m g r e w m o r e r a p i d l y a n d a ch i e ve d a h i g h e r d e n si t y t h a n t h e ce l l s cu l t u r e d i n 2 0 % e xt r a ct K e r a t o cyt e cu l t u r e s co n t a i n e d 1 3 3 n g / w e l l o f D N A o n d a y 1 T h i s va l u e i n cr e a se d t o 4 5 0 n g / w e l l o n d a y 9 f o r ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a ct a n d 1 0 2 8 n g / w e l l f o r ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n se r u m T h i s i n d i ca t e s t h a t ke r a t o cyt e s i n e x t r a ct u n d e r w e n t f i ve cu l t u r e d o u b l i n g s, w h i l e ke r a t o cyt e s i n se r u m u n d e r w e n t si x cu l t u r e d o u b l i n g s i n a n e i g h t d a y p e r i o d T h e se r e su l t s su g g e st t h a t ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n t h e e xt r a ct g r o w a t a sl o w e r r a t e t h a n ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n se r u m a n d t h i s co n f i r m s t h e r e su l t s o f t h e p r e vi o u s e xp e r i m e n t K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a ct a l so a p p e a r t o b e co n t a ct i n h i b i t e d a t a l o w e r f i n a l d e n si t y t h a n ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n se r u m a s b o t h cu l t u r e s r e a ch t h e i r r e s p e ct i ve D N A m a xi m a a t d a y 9 T h e e f f e ct o f i n i t i a l ke r a t o cyt e p l a t i n g d e n si t y o n t h e ke r a t o cyt e s r e sp o n se t o 2 0 % e xt r a ct w a s e v a l u a t e d n e xt K e r a t o cyt e s p l a t e d a t l o w ce l l d e n si t i e s w e r e

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3 8 st i m u l a t e d e q u a l l y b y 1 0 % se r u m a n d b y t h e st r o m a l e x t r a ct t o i n co r p o r a t e 3 H t h ym i d i n e i n t o D N A ( F i g u r e 5 ) K e r a t o cyt e s p l a t e d a t h i g h d e n si t y, h o w e v e r w e r e st i m u l a t e d t o syn t h e si ze D N A si g n i f i c a n t l y m o r e b y 1 0 % se r u m t h a n b y t h e st r o m a l e xt r a ct T h i s su g g e st s t h a t ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n t h e e xt r a ct a r e m o r e se n si t i ve t o co n t a ct i n h i b i t i o n o r d e n si t y d e p e n d e n t g r o w t h t h a n ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n s e r u m D N A syn t h e si s b y ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n 2 0 % e xt r a ct i n m i cr o m a ss cu l t u r e w a s a l so d e t e r m i n e d b y B r d U l a b e l i n g ( F i g u r e 6 ) f o r a 2 4 h o u r p e r i o d M o st i f n o t a l l o f t h e ce l l s i n t h e p e r i p h e r y o f t h e m i cr o m a ss cu l t u r e sp o t h a ve i n co r p o r a t e d B r d U i n t o D N A a si g n a l t h a t t h e y a r e syn t h e si zi n g D N A H o w e ve r i n t h e ce n t e r o f t h e sp o t w h e r e ke r a t o cyt e s a r e i n cl o se co n t a ct o n l y a f e w ce l l s i n co r p o r a t e B r d U K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n D M E M / F 1 2 a l o n e d i d n o t st a i n p o si t i ve l y f o r i n co r p o r a t e d B r d U ( d a t a n o t sh o w n ) T h e s e r e su l t s sh o w d i r e ct l y t h a t t h e e xt r a c t d o e s n o t st i m u l a t e t h e ke r a t o cyt e s t h a t a r e i n cl o se p r o xi m i t y t o e a ch o t h e r t o syn t h e si ze D N A U si n g p h a se co n t r a st m i cr o sco p y w e a n a l yze d t h e m o r p h o l o g y o f ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n e xt r a ct o r i n se r u m A t l o w d e n si t y, ce l l s i n se r u m a n d e xt r a ct a p p e a r e d si m i l a r t h r e e d a ys a f t e r p l a t i n g b u t t h e ce l l s i n e xt r a ct h a d m o r e p r o m i n e n t d e n d r i t i c p r o ce ss e s ( F i g u r e 7 A a n d B ) A t co n f l u e n ce t h e ce l l s i n se r u m co ve r e d t h e w h o l e p l a t e a n d a p p e a r e d t o o v e r l a p e a ch o t h e r ( F i g u r e 7 C ) a p r o c e ss t yp i ca l o f f i b r o b l a st s I n co n t r a st ce l l s cu l t u r e d i n s t r o m a l e xt r a ct st i l l m a i n t a i n e d sp a ce b e t w e e n ce l l b o d i e s a t co n f l u e n ce a n d t h e ce l l s w e r e co n n e ct e d b y m u l t i p l e d e n d r i t i c p r o c e sse s ( F i g u r e 7 D )

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3 9 W e a l so e va l u a t e d t h e se n si t i vi t y o f t h e st i m u l a t i n g f a ct o r ( s) i n t h e e xt r a ct a n d t h e se r u m t o h e a t t r e a t m e n t K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n t h e h e a t t r e a t e d st r o m a l e xt r a ct sh o w a d e cr e a si n g r a t e o f 3 H t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n p r o p o r t i o n a l t o t h e t r e a t m e n t t e m p e r a t u r e ( F i g u r e 8 ) I n co n t r a st a m o r e g r a d u a l d e c r e a se i n a ct i vi t y i s o b se r ve d f o r h e a t t r e a t e d 1 0 % se r u m ; t h e r e i s a 2 0 % l o ss o f p r o l i f e r a t i n g a ct i vi t y b e t w e e n 3 7 a n d 8 0 C t r e a t m e n t co m p a r e d t o a 6 4 % l o ss f o r e x t r a ct T h e se r e s u l t s su g g e st t h a t t h e m i t o g e n i c f a c t o r ( s) i n t h e e xt r a ct i s ( a r e ) d i f f e r e n t t h a n t h o s e i n se r u m B o t h t h e st r o m a l e xt r a c t a n d f e t a l b o vi n e se r u m w e r e f r a c t i o n a t e d o n a m o l e cu l a r si e ve co l u m n a n d e a ch f r a ct i o n o f t h e co l u m n w a s m o n i t o r e d f o r p r o t e i n co n t e n t b y o p t i ca l d e n si t y a t 2 8 0 n m ( F i g u r e 9 A ) a n d f o r D N A syn t h e si s b y 3 H t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n ( F i g u r e 9 B ) T h e o p t i ca l d e n si t y p r o f i l e f o r f r a ct i o n a t e d se r u m co n si st e d o f o n e m a j o r p e a k e l u t i n g a t f r a ct i o n s 8 1 3 w h i l e t h e e xt r a ct r e so l ve d i n t o t h r e e m a j o r p e a k s a t f r a ct i o n s 8 1 0 1 3 1 4 a n d 1 8 ( F i g u r e 9 A ) T h e D N A syn t h e si s p r o m o t i n g a ct i vi t y i n t h e f r a ct i o n a t e d e xt r a ct e l u t e d i n o n e m a j o r p e a k a t f r a ct i o n 8 w h i l e t h e a ct i vi t y i n se r u m e l u t e d i n t w o p e a ks a t f r a c t i o n s 9 a n d 1 2 ( F i g u r e 9 B ) T h i s i n d i ca t e s t h a t t h e m i t o g e n s i n e xt r a ct h a v e a h i g h e r m o l e cu l a r w e i g h t t h a n t h o se p r e se n t i n se r u m ( N o t e t o r e a d e r : t h e se t w o l a st f i g u r e s h a ve b e e n ch a n g e d f o r t h e d i sse r t a t i o n F i g u r e 9 A n o w sh o w s t h e f r a ct i o n a t e d e xt r a ct ( a ct i vi t y a n d A 2 8 0 ) w h i l e F i g u r e 9 B n o w sh o w s t h e f r a ct i o n a t e d se r u m )

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4 0 D I S C U S S I O N T h i s st u d y s h o w s t h a t t h e co r n e a l st r o m a c o n t a i n s a r e a d i l y e xt r a ct a b l e m i t o g e n t h a t ca n st i m u l a t e D N A syn t h e si s a n d p r o l i f e r a t i o n o f ke r a t o cyt e s si m i l a r t o t h a t p r o d u ce d b y cu l t u r e i n 1 0 % f e t a l b o vi n e se r u m K e r a t o cyt e s i n e xt r a ct h o w e ve r g r e w m o r e sl o w l y b e c a u se o f a l o n g e r ce l l cycl e a n d w e r e co n t a ct i n h i b i t e d a t a l o w e r ce l l d e n si t y t h a n k e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n se r u m A t co n f l u e n ce ce l l s i n e xt r a ct w e r e s e p a r a t e f r o m e a c h o t h e r a n d a p p e a r e d d e n d r i t i c w i t h a l a r g e ce l l b o d y a n d l o n g b r a n ch e d ce l l p r o ce sse s, si m i l a r t o t h a t se e n f o r q u i e sce n t ke r a t o cyt e s ( 9 9 ) I n c o n t r a st ce l l s i n se r u m w e r e i n cl o se co n t a ct a n d a p p e a r e d t o o ve r l a p a t co n f l u e n ce T h e se r e su l t s su g g e st t h e ce l l s cu l t u r e d i n e xt r a ct a r e p h e n o t y p i ca l l y d i st i n ct f r o m ce l l s cu l t u r e d i n se r u m T h e m i t o g e n i c f a ct o r e x t r a ct e d f r o m t h e c o r n e a l st r o m a i s d i f f e r e n t t h a n t h e m i t o g e n i c f a c t o r ( s ) p r e se n t i n se r u m F i r st t h e m i t o g e n ( s) i n se r u m ca u se d t h e ce l l s t o cycl e w i t h a sh o r t e r f r e q u e n cy t h a n t h e m i t o g e n ( s) p r e se n t i n t h e st r o m a F u r t h e r m o r e t h e s t r o m a l m i t o g e n e xh i b i t s a h i g h e r m o l e cu l a r w e i g h t a n d a g r e a t e r se n si t i vi t y t o h e a t t h a n t h e m i t o g e n p r e se n t i n se r u m T h e h i g h m o l e cu l a r w e i g h t a n d h e a t se n si t i vi t y o f t h e m i t o g e n i so l a t e d f r o m t h e st r o m a su g g e st s t h a t i t m a y b e a l a r g e p r o t e i n a l t h o u g h i t m a y b e a sm a l l m o l e cu l e b o u n d t o a l a r g e p r o t e i n T h e m i t o g e n i c f a ct o r s i n f e t a l b o vi n e se r u m a n d i n t h e s t r o m a l e xt r a c t u se d i n t h i s st u d y a r e n o t kn o w n S o m e o f t h e g r o w t h p r o m o t i n g p r o p e r t i e s o f m a t r i g e l a n e xt r a c t o f t h e E H S t u m o r ( 1 4 5 ) h a v e b e e n sh o w n t o b e d u e t o

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4 1 ce r t a i n g r o w t h f a ct o r s ( 1 4 3 ) a n d t h e b a se m e n t m e m b r a n e p r o t e i n l a m i n i n ( 1 4 0 ) I t i s l i ke l y t h a t t h e g r o w t h p r o m o t i n g a ct i vi t y i n t h e st r o m a l e xt r a ct i s a l so d u e t o ce r t a i n g r o w t h f a ct o r s a n d st r o m a l m a t r i x co m p o n e n t s a n d t h e se a r e ye t t o b e i d e n t i f i e d E ve n w i t h o u t i d e n t i f yi n g t h e m i t o g e n i c f a ct o r s, h o w e v e r t h e e xt r a ct w i l l b e u se f u l f o r e xp a n d i n g t h e p o p u l a t i o n o f ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e i n a p h e n o t yp e d i st i n ct f r o m t h a t a ch i e v e d b y cu l t u r e i n se r u m A n e a r l i e r st u d y sh o w e d t h a t e xt r a ct s o f r a b b i t co r n e a s st i m u l a t e d D N A s yn t h e si s o f ke r a t o cyt e s b u t o n l y b y 4 0 6 0 % ( 1 4 6 ) I n t h a t st u d y, ke r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n m e d i u m co n t a i n i n g se r u m t h a t w o u l d h a ve a l so st i m u l a t e d t h e ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e t h e r e f o r e m a sk i n g t h e a ct i vi t y o f t h e e xt r a ct F u r t h e r m o r e t h e e xt r a ct s w e r e l yo p h i l i ze d b e f o r e u se a n d t h i s m a y h a ve i n a ct i va t e d so m e o f t h e f a ct o r s. W e p r o p o se t h a t t h e m i t o g e n s i n t h e e xt r a ct t h a t st i m u l a t e ke r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n i n vi t r o m a y i n d u ce t h e a ct i va t e d p h e n o t yp e se e n d u r i n g i n vi vo w o u n d h e a l i n g T h e ke r a t o cyt e s i n t h e m a t u r e co r n e a w o u l d l i ke l y b e i n co n t a ct w i t h t h e m i t o g e n i so l a t e d i n e xt r a ct s o f c o r n e a l st r o m a si n ce i t s e x t r a ct a b i l i t y w o u l d i n d i ca t e t h a t i t i s r e a d i l y d i f f u si b l e T h e se ke r a t o cyt e s co u l d n o t r e s p o n d t o t h e m i t o g e n b e ca u se t h e c e l l ce l l co n n e ct i o n s vi a d e n d r i t i c p r o ce ss e s w o u l d ca u se t h e m t o b e co n t a ct i n h i b i t e d O n c e t h e co r n e a i s w o u n d e d h o w e v e r t h e ke r a t o cyt e s i n t h e w o u n d a r e a a s w e l l a s t h e ke r a t o cyt e s a d j a ce n t t o i t u n d e r g o a p o p t o si s, r e su l t i n g i n a n a r e a vo i d o f ce l l s. I t i s l i ke l y t h a t t h e vo i d w o u l d cr e a t e a l o ss o f ce l l ce l l co n t a ct s o n o n e si d e o f t h e r e m a i n i n g ke r a t o cyt e s f l a n ki n g t h e vo i d a n d t h i s l o ss w o u l d a l l o w t h e m t o b e a ct i va t e d b y t h e d i f f u si b l e m i t o g e n

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4 2 p r e se n t i n t h e s t r o m a T h e n o w a ct i va t e d ke r a t o cyt e s w o u l d p r o l i f e r a t e a n d m i g r a t e i n t o t h e ce l l vo i d a r e a W h e n t h e y r e p o p u l a t e d t h e vo i d a n d r e f o r m e d t h e t h r e e d i m e n si o n a l n e t w o r k o f ce l l s, t h e y w o u l d a g a i n b e co m e co n t a c t i n h i b i t e d a n d ce a se d i vi d i n g I n t h i s p r o p o se d ke r a t o cyt e a ct i va t i o n m e c h a n i sm t h e m i t o g e n i s a l w a ys p r e se n t a n d t h e i n i t i a t i n g e v e n t i s l o ss o f ce l l ce l l co n t a c t

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4 3 F i g u r e 1 D o s e r e s p o n s e c u r v e o f s t r o m a l e x t r a c t c o m p a r e d t o s e r u m 3 H t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n b y ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n d i f f e r e n t l e ve l s o f s t r o m a l e xt r a ct a n d 1 0 % se r u m M a xi m u m D N A syn t h e si s i s se e n a t a 2 0 % st r o m a l e xt r a ct co n c e n t r a t i o n V a l u e s e xp r e ss e d a s m e a n st a n d a r d e r r o r o f m e a n i n d i ca t e s t h a t t h e st i m u l a t i o n b y e xt r a c t ( 1 p < 0 0 0 0 1 ) a n d se r u m ( 2 p < 0 0 0 0 1 ) a r e st a t i st i ca l l y d i f f e r e n t t h a n cu l t u r e i n D M E M / F 1 2 a l o n e ( 0 % e xt r a ct )

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4 4 F i g u r e 2 E f f e c t o f f r e e zi n g o n e x t r a c t p o t e n c y F r e sh c o r n e a s o r co r n e a s t h a t h a d b e e n f r o z e n a n d t h a w e d w e r e m i n ce d h o m o g e n i ze d a n d e xt r a c t e d F r e e zi n g t h e c o r n e a s d i d n o t r e su l t i n a si g n i f i ca n t ch a n g e i n e x t r a ct p o t e n cy, i n d i ca t i n g t h a t t h e f a ct o r p r e se n t i s n o t a r e su l t o f a m e t a b o l i c p r o ce ss b y i n j u r e d ke r a t o cyt e s. V a l u e s e xp r e ss e d a s m e a n st a n d a r d e r r o r o f m e a n n o si g n i f i ca n t d i f f e r e n ce w a s o b se r ve d b e t w e e n f r e sh a n d f r o ze n co r n e a s. L e g e n d : C E 2 0 % : co r n e a l e xt r a ct m a d e f r o m f r e s h co r n e a s ( u se d a t 2 0 % co n ce n t r a t i o n ) ; F C E 2 0 % : co r n e a l e xt r a c t m a d e f r o m f r o ze n co r n e a s ( u s e d a t 2 0 % co n ce n t r a t i o n )

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4 5 F i g u r e 3 A n a l y s i s o f e n t r y i n t o S p h a s e b y k e r a t o c y t e s c u l t u r e d i n s e r u m a n d i n e x t r a c t K e r a t o cyt e s p l a t e d o u t a t 1 0 0 0 0 ce l l s/ c m 2 w e r e cu l t u r e d i n 2 0 % st r o m a l e xt r a ct ( S E ) o r 1 0 % se r u m st a r t i n g o n d a y 1 T h e m e d i u m w a s su p p l e m e n t e d w i t h 1 0 C i / m l o f 3 H t h ym i d i n e a n d t h e ce l l s l a b e l e d f o r 3 h o u r t i m e p e r i o d s. T h e ce l l s cu l t u r e d i n D M E M / F 1 2 co n t a i n i n g e xt r a ct i n i t i a t e D N A syn t h e si s a t l e a st 3 h o u r s a f t e r t h e ce l l s i n se r u m T h e r e i s a d e cl i n e i n D N A syn t h e si s b e t w e e n t h e cycl e s i n e xt r a ct cu l t u r e d ke r a t o cyt e s, w h i c h i s n o t a s a p p a r e n t i n ce l l s cu l t u r e d i n m e d i u m co n t a i n i n g s e r u m V a l u e s e xp r e sse d a s m e a n st a n d a r d e r r o r o f m e a n

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4 6 F i g u r e 4 G r o w t h r a t e s o f k e r a t o c y t e s c u l t u r e d f o r 1 2 d a y s 3 3 0 0 ce l l s/ c m 2 w e r e p l a t e d i n 1 2 w e l l t i ssu e cu l t u r e p l a t e s a n d c u l t u r e d i n D M E M / F 1 2 D M E M / F 1 2 p l u s 1 0 % se r u m o r D M E M / F 1 2 a n d 2 0 % st r o m a l e xt r a ct ( S E ) T h e m e d i u m w a s a sp i r a t e d a n d t h e D N A co n t e n t m e a su r e d

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4 7 F i g u r e 5 E f f e c t o f p l a t i n g d e n s i t y o n k e r a t o c y t e r e s p o n s e t o s t r o m a l e x t r a c t a n d t o 1 0 % s e r u m K e r a t o cyt e s w e r e p l a t e d a t t h e sh o w n p l a t i n g d e n si t i e s/ c m 2 o n a 1 2 w e l l p l a t e a n d cu l t u r e d i n D M E M / F 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h 2 0 % st r o m a l e xt r a ct ( S E ) o r D M E M / F 1 2 w i t h 1 0 % F B S K e r a t o cyt e s a t l o w i n i t i a l p l a t i n g d e n si t i e s i n co r p o r a t e 3 H t h ym i d i n e a t t h e sa m e r a t e i n b o t h e x t r a ct a n d se r u m K e r a t o cyt e s a t t h e h i g h e st d e n si t y i n co r p o r a t e si g n i f i ca n t l y m o r e 3 H t h ym i d i n e i n se r u m t h a n i n e xt r a ct V a l u e s e xp r e ss e d a s m e a n st a n d a r d e r r o r o f m e a n i n d i ca t e s t h a t t h e st i m u l a t i o n i n e xt r a ct ( 1 p = 0 0 0 0 4 ) o r se r u m ( 2 p = 0 1 4 9 ) a r e st a t i st i ca l l y d i f f e r e n t b e t w e e n h i g h a n d l o w p l a t i n g d e n si t i e s.

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4 8 F i g u r e 6 M i c r o m a s s c u l t u r e w i t h B r d U l a b e l i n g K e r a t o cyt e s w e r e p l a t e d a t 2 0 0 0 0 c e l l s/ 2 0 L a l l o w e d t o a t t a ch a n d t h e n cu l t u r e d i n m e d i u m co n t a i n i n g 2 0 % st r o m a l e x t r a ct O n d a y 4 t h e m e d i u m w a s r e p l a ce d b y 2 0 % st r o m a l e xt r a ct co n t a i n i n g B r d U f o r 2 4 h o u r s T h e b l a ck ce l l n u cl e i i n d i ca t e ce l l s t h a t i n co r p o r a t e d B r d U i n t o D N A

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4 9 F i g u r e 7 P h a s e c o n t r a s t i m a g e s o f k e r a t o c y t e s c u l t u r e d i n s e r u m ( F B S ) a n d s t r o m a l e x t r a c t ( S E ) T h e ce l l s w e r e p l a t e d a t 3 3 0 0 ce l l s/ cm 2 a n d p h o t o g r a p h e d a f t e r 3 d a ys ( l o w d e n si t y L D ) a n d t h e n a g a i n a f t e r 1 0 d a ys ( co n f l u e n c e C F ) A ) K e r a t o cyt e s a t l o w d e n si t y i n se r u m B ) K e r a t o cy t e s a t l o w d e n si t y i n st r o m a l e xt r a ct C ) K e r a t o cyt e s i n s e r u m a t co n f l u e n ce D ) K e r a t o cyt e s a t co n f l u e n c e i n st r o m a l e xt r a ct

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5 0 F i g u r e 8 E f f e c t o f h e a t o n s t r o m a l e x t r a c t a n d s e r u m a c t i v i t y D M E M / F 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h e i t h e r 2 0 % st r o m a l e xt r a ct ( S E ) o r 1 0 % se r u m w e r e h e a t e d a n d t h e e f f e ct o f h e a t i n g o n t h e p r o l i f e r a t i n g a ct i vi t y m e a su r e d K e r a t o cyt e s w e r e r a d i o l a b e l e d w i t h 3 H t h ym i d i n e f o r 4 8 h o u r s a n d i n co r p o r a t i o n m e a su r e d a s p r e vi o u sl y d e sc r i b e d T h e a ct i vi t y o f t h e st r o m a l e xt r a ct i s m o r e se n si t i ve t o h e a t t h a n t h e a c t i vi t y o f se r u m V a l u e s e xp r e ss e d a s m e a n st a n d a r d e r r o r o f m e a n i n d i ca t e t h a t h e a t r e su l t s i n a st a t i st i ca l l y d i f f e r e n t st i m u l a t i o n f o r e xt r a ct ( 1 p < 0 0 0 0 1 ) o r se r u m ( 2 p = 0 0 1 4 9 ) w h e n co m p a r e d t o u n h e a t e d su p p l e m e n t e d m e d i u m

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5 1 F i g u r e 9 C h r o m a t o g r a p h y o f s e r u m a n d e x t r a c t o n S 3 0 0 T h e f r a ct i o n s o f t h e S 3 0 0 c o l u m n w e r e u se d a s cu l t u r e m e d i u m f o r b o t h t h e se r u m a n d st r o m a l e xt r a ct r u n s. K e r a t o cyt e s w e r e r a d i o l a b e l e d f o r 4 8 h o u r s w i t h 3 H t h y m i d i n e a n d i n co r p o r a t i o n m e a su r e d a s p r e vi o u sl y d e scr i b e d V a l u e s e xp r e sse d a s m e a n st a n d a r d e r r o r o f m e a n N o t e t o r e a d e r : t h i s f i g u r e h a s b e e n m o d i f i e d f r o m t h e a ct u a l p u b l i sh e d f i g u r e A M i t o g e n i c a ct i vi t y o f st r o m a l e xt r a ct f r a ct i o n s a n d r e s p e ct i ve A 2 8 0 n m B M i t o g e n i c a ct i vi t y o f se r u m f r a ct i o n s a n d r e sp e ct i ve A 2 8 0 n m

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5 2 F i g u r e 9

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5 3 S U P P L E M E N T T O P A P E R 1 S U M M A R Y P a p e r 1 f o c u se d m a i n l y o n t h e m i t o g e n i c e f f e ct o f t h e st r o m a l e xt r a ct a n d a l so o n so m e o f t h e b i o ch e m i ca l ch a r a ct e r i st i cs o f i t S i n ce t h e p u b l i ca t i o n o f t h a t m a n u scr i p t h o w e ve r si g n i f i ca n ce a d va n ce s h a ve b e e n a ch i e ve d i n i d e n t i f yi n g p r o t e i n s f o u n d i n t h e st r o m a l e x t r a ct t h e b i o c h e m i ca l ch a r a ct e r i st i cs o f t h e e xt r a ct a n d i t s i n st a b i l i t y i n d e n a t u r i n g b u f f e r s ( l i ke 4 M G u a n i d i n e H C l o r 8 M u r e a ) T h e e f f e ct o f cu l t u r e i n st r o m a l e xt r a ct o n su l f a t e i n c o r p o r a t i o n w a s a l so st u d i e d T h i s su p p l e m e n t p r e se n t s d a t a n o t o r i g i n a l l y p u b l i sh e d b u t t h a t su p p o r t t h e a r g u m e n t t h a t t h e co r n e a co n t a i n s t h e m i t o g e n s r e q u i r e d f o r t h e a ct i va t i o n o f ke r a t o cyt e s i n si t u a n d t h a t t h e se c a n b e e xt r a ct e d i n D M E M / F 1 2 I t a l so p r e se n t s e vi d e n ce t h a t t h e d i f f e r e n t ke r a t o cyt e p h e n o t y p e s ca n b e i n d u c e d b y u si n g e xt r a c t i n cu l t u r e A s t h e m a i n g o a l o f t h i s d i sse r t a t i o n i s t o d e v e l o p cu l t u r e m e d i a t h a t w i l l a l l o w t h e st u d y o f t h e d i f f e r e n t ke r a t o cyt e p h e n o t yp e s, e xp e r i m e n t a l r e s u l t s o f i m p o r t a n ce t o t h e m a t t e r a r e p r e se n t e d A l l t h e m e t h o d s u se d i n t h i s se c t i o n h a v e b e e n e i t h e r p r e vi o u s l y d e scr i b e d o r w i l l b e d e scr i b e d i n p a p e r s 2 a n d 3 t h e r e f o r e o n l y a s h o r t d e scr i p t i o n o f t h e m e t h o d u se d w i l l b e p r o vi d e d

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5 4 L I S T O F E X P E R I M E N T S 1 E f f e ct o f se r u m o n m i t o g e n i c p o t e n cy o f g r o w t h f a ct o r s 2 S u l f a t e st i m u l a t o r y a ct i vi t y o f B S A si ze e xcl u si o n ch r o m a t o g r a p h y 3 M i t o g e n i c a ct i vi t y o f e xt r a ct s m a d e o f l e n s, vi t r e o u s a n d r e t i n a 4 S u l f a t e i n co r p o r a t i o n b y e xt r a ct co m p a r e d t o s e r u m 5 K e r a t o cyt e cu l t u r e d i n e xt r a c t o r e x t r a ct p l u s T G F B a ct i va t i o n a n d m yo f i b r o b l a st i c t r a n sf o r m a t i o n 6 S 3 0 0 ch r o m a t o g r a p h y o f e xt r a ct 7 H e p a r i n a f f i n i t y ch r o m a t o g r a p h y 8 A n t i b o d y n e u t r a l i za t i o n o f st r o m a l e xt r a ct

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5 5 T r a d i t i o n a l l y, ke r a t o cyt e s w e r e p l a t e d a n d cu l t u r e d i n 1 0 % F B S T h i s p l a t i n g r e s u l t e d i n t h e ce l l s b e c o m i n g f i b r o b l a s t i c. A n a l t e r n a t i ve m e t h o d w a s d e ve l o p e d i n w h i ch ce l l s w e r e p l a t e d i n m e d i u m co n t a i n i n g 1 % P P H S t o f a ci l i t a t e ce l l a d h e si o n T h i s m e d i u m w a s r e m o ve d o n d a y 1 a n d c h a n g e d t o se r u m f r e e m e d i u m ( S F M ) I t w a s f o u n d h o w e ve r t h a t 1 % P P H S d i d n o t e n h a n ce ce l l b i n d i n g t o t h e cu l t u r e d i sh e s a n d s e e m e d t o a f f e ct t h e r e sp o n s e t o g r o w t h f a ct o r s. T o d e t e r m i n e t h e e f f e ct o f se r u m o n g r o w t h f a ct o r p o t e n cy, ke r a t o cyt e s w e r e p l a t e d i n S F M o r 1 % P P H S D M E M a n d sw i t ch e d o n d a y 1 t o S F M o r 0 1 % P P H S D M E M ( S u p p l e m e n t F i g u r e 1 ) w i t h o r w i t h o u t g r o w t h f a ct o r s o r e xt r a ct T h e ce l l s w e r e r a d i o l a b e l e d w i t h 3 H t h ym i d i n e f o r 4 8 h o u r s a n d i n co r p o r a t i o n d e t e r m i n e d o n a p e r w e l l b a si s. C o m p a r e d t o ke r a t o cyt e s p l a t e d i n S F M a n d cu l t u r e d i n S F M k e r a t o cy t e s p l a t e d i n 1 % P P H S a n d sw i t ch e d t o S F M o n d a y 1 i n c o r p o r a t e d 8 4 f o l d m o r e t h y m i d i n e a n d 1 4 0 f o l d m o r e i f p l a t e d a n d cu l t u r e d i n m e d i u m co n t a i n i n g se r u m K e r a t o cyt e s p l a t e d i n S F M a n d cu l t u r e d i n m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h F G F 2 i n co r p o r a t e d 1 8 f o l d m o r e t h ym i d i n e t h a n ce l l s i n S F M a l o n e C o m p a r e d t o F G F 2 / S F M m e d i u m k e r a t o cyt e s p l a t e d i n 1 % P P H S D M E M a n d cu l t u r e d i n F G F 2 / S F M i n co r p o r a t e d 1 4 f o l d m o r e t h ym i d i n e a n d t h i s i n c r e a se d t o 1 9 f o l d i f t h e ce l l s h a d b e e n p l a t e d i n 1 % P P H S a n d cu l t u r e d i n F G F 2 / 0 1 P P H S D M E M P D G F B B w h e n u se d i n S F M o n l y i n cr e a se d t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n 5 f o l d o ve r S F M W h e n se r u m w a s u se d i n t h e p l a t i n g m e d i u m h o w e ve r ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n P D G F B B i n co r p o r a t e d 4 0 f o l d m o r e t h ym i d i n e t h a n t h e P D G F S F M ce l l s a n d t h i s i n c r e a se d t o 6 0 f o l d i f se r u m w a s p r e se n t i n t h e cu l t u r e m e d i u m A d d i n g e xt r a c t t o ke r a t o cyt e s p l a t e d

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5 6 i n S F M st i m u l a t e d t h y m i d i n e i n co r p o r a t i o n 2 8 0 f o l d o v e r ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n S F M H o w e ve r t h e c e l l s p l a t e d i n 1 % P P H S a n d cu l t u r e d i n e xt r a ct i n co r p o r a t e d 3 5 % m o r e t h ym i d i n e a n d t o t a l t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n w a s u n ch a n g e d i f 0 1 % P P H S w a s p r e se n t i n t h e m e d i u m T h i s su g g e st s t h a t ke r a t o cyt e s i so l a t e d f r o m t h e st r o m a a n d p l a t e d i n S F M d o n o t p r o l i f e r a t e a n d t h e sm a l l a m o u n t o f t h ym i d i n e i n co r p o r a t e d i s l i ke l y l i m i t e d t o D N A r e p a i r W h e n se r u m i s u se d i n t h e p l a t i n g m e d i u m h o w e ve r s o m e ke r a t o cyt e s a r e st i m u l a t e d t o e n t e r t h e ce l l cycl e a n d d i vi d e T h i s e xp l a i n s t h e 8 0 f o l d i n cr e a s e i n t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n w h e n co m p a r i n g ke r a t o cyt e s p l a t e d a n d cu l t u r e d i n S F M o r k e r a t o cyt e s p l a t e d i n 1 % P P H S a n d cu l t u r e d i n S F M K e e p i n g s e r u m i n t h e cu l t u r e m e d i u m e ve n a t r e d u ce d c o n ce n t r a t i o n s, f u r t h e r i n c r e a se s t h y m i d i n e i n co r p o r a t i o n e i t h e r b y st i m u l a t i n g a s e co n d r o u n d o f d i vi si o n b y so m e o f t h e c e l l s t h a t d i vi d e d p r e vi o u sl y, o r b y st i m u l a t i n g m o r e c e l l s t o d i vi d e i n t h e i n i t i a l r o u n d I t i s a l so cl e a r t h a t u si n g se r u m i n t h e p l a t i n g a n d i n t h e cu l t u r e m e d i u m e n h a n ce s t h e ce l l u l a r r e sp o n se t o st i m u l a t i o n b y t h e g r o w t h f a ct o r s, e v e n t h o u g h t h e e xp o su r e t o s e r u m m a y b e t e m p o r a r y. I t i s l i ke l y t h a t se r u m ca u s e s so m e ke r a t o cyt e s t o r e e n t e r t h e ce l l cycl e a n d so m e ce l l s u n d e r g o d i vi si o n e ve n a f t e r r e m o vi n g o f t h e g r o w t h f a ct o r s ( t h e y a r e p a st t h e r e st r i ct i o n p o i n t ) T h i s w a s a l so d e t e ct e d i n t h e ce l l cycl e e xp e r i m e n t i n p a p e r 1 ( F i g u r e 3 ) I n c o n t r a s t se r u m a t p l a t i n g a p p e a r s t o st i m u l a t e m o st c e l l s cu l t u r e d i n t h e p r e se n ce o f g r o w t h f a ct o r s t o e n t e r t h e ce l l c ycl e a s e vi d e n c e d b y t h e l a r g e i n cr e a s e i n t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n ( si m i l a r t o t h e i n co r p o r a t i o n o f e xt r a ct i n S F M ) P a p e r 1 sh o w s t h a t a l l o f t h e ce l l s i n e xt r a ct a r e d i vi d i n g a n d t h a t t h e ce l l cycl e t a ke s a r o u n d 3 0

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5 7 h o u r s. I n co r p o r a t i o n b y ce l l s i n e xt r a ct st a r t s a f t e r 1 5 h o u r s, a n d d e cl i n e s a f t e r a r o u n d 3 9 h o u r s o n l y t o r i se a g a i n b e t w e e n 4 5 a n d 4 8 h o u r s I f a l l t h e ce l l s i n e xt r a ct e n t e r t h e ce l l cycl e a t 1 5 h o u r s, t h e n t h e m o st l i ke l y e xp l a n a t i o n t o w h y ke r a t o cyt e s i n e xt r a ct i n co r p o r a t e d m o r e t h y m i d i n e w h e n p l a t e d i n m e d i u m co n t a i n i n g 1 % P P H S co m p a r e d t o S F M i s t h a t t h e p r e s e n ce o f P P H S a t p l a t i n g i s ca u si n g t h e c e l l s t o r e e n t e r t h e ce l l cycl e f a st e r T h e se ce l l s, h o w e ve r d o n o t a d va n ce i n t o S p h a se i n t h e a b se n ce o f g r o w t h f a ct o r s. S e r u m r e m o va l i s a m e t h o d c o m m o n l y u se d t o syn ch r o n i ze ce l l s i n ce l l cycl e st u d i e s, a n d i t h a s b e e n sh o w n t h a t e xp r e ssi o n o f g r o w t h f a c t o r r e ce p t o r s i n cr e a se s a f t e r r e m o va l o f se r u m I t i s t h e r e f o r e a l so p o ssi b l e t h a t t h e k e r a t o cyt e s p l a t e d o r cu l t u r e d i n se r u m e x p r e ss r e ce p t o r s f o r F G F 2 a n d P D G F B B a f t e r s e r u m r e m o va l a n d t h a t t h e a d d i t i o n o f t h e se g r o w t h f a ct o r s t o t h e m e d i u m a l l o w s t h e ce l l s t o t h e n e n t e r S p h a se a n d d i vi d e T h e se r e su l t s sh o w t h a t t h e a d d i t i o n o f se r u m t o t h e m e d i u m a t p l a t i n g o r a d d i n g se r u m t o t h e cu l t u r e m e d i u m a f f e ct s t h e r e sp o n se o f t h e ke r a t o cyt e s t o t h e g r o w t h f a ct o r s, a l t h o u g h i n t h e a b s e n ce o f g r o w t h f a ct o r s, i t d o e s n o t a f f e ct t h e ce l l u l a r m o r p h o l o g y.

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5 8 F i g u r e 1 E f f e c t o f s e r u m o n m i t o g e n i c p o t e n c y o f g r o w t h f a c t o r s K e r a t o cyt e s w e r e p l a t e d i n se r u m f r e e m e d i u m o r i n D M E M / F 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h 1 % P P H S O n d a y 1 t h e cu l t u r e m e d i u m w a s ch a n g e d t o S F M o r D M E M / F 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h 0 1 % P P H S a n d t h e t r e a t m e n t w i t h g r o w t h f a ct o r s st a r t e d

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5 9 T h e m i t o g e n i c a ct i vi t y o f t h e e xt r a ct w a s l o st w h e n 4 M g u a n i d i n e w a s u se d a s b u f f e r f o r g e l f i l t r a t i o n ch r o m a t o g r a p h y. T h e st i m u l a t i o n o f su l f a t e i n co r p o r a t i o n b y t h e d e n a t u r e d e xt r a ct h o w e v e r w a s n o t a f f e ct e d T h e f a ct o r t h a t st i m u l a t e d su l f a t e i n co r p o r a t i o n w a s i d e n t i f i e d a f t e r p u r i f i c a t i o n b y g e l f i l t r a t i o n a n d i t s se q u e n ce m a t ch e d b o vi n e se r u m a l b u m i n ( B S A ) I n t h e se co n d e xp e r i m e n t B S A a t i n cr e a si n g co n ce n t r a t i o n s w a s a d d e d t o t h e c u l t u r e m e d i u m a n d i t s e f f e c t o n su l f a t e i n co r p o r a t i o n b y k e r a t o cyt e s p l a t e d a t l o w a n d h i g h d e n si t y m e a s u r e d ( S u p p l e m e n t F i g u r e 2 A ) T h e a d d i t i o n o f B S A a t 0 0 1 m g / m l o r 0 1 m g / m l i n c r e a se d su l f a t e i n co r p o r a t i o n 8 f o l d b y ke r a t o cyt e s p l a t e d a t e i t h e r p l a t i n g d e n si t y. O n l y a B S A co n ce n t r a t i o n o f 1 m g / m l i n c r e a se d su l f a t e i n co r p o r a t i o n 1 0 f o l d f o r ke r a t o c yt e s a t l o w d e n si t y a n d h i g h d e n si t y. C u l t u r e i n 1 0 % e xt r a ct st i m u l a t e d s u l f a t e i n co r p o r a t i o n 8 f o l d si m i l a r t o B S A a t 0 0 1 o r 0 1 m g / m l E q u i va l e n t co u n t s o f i n co r p o r a t e d su l f a t e b y c e l l s p l a t e d a t l o w a n d h i g h d e n si t y, a n d cu l t u r e d i n S F M o r m e d i u m co n t a i n i n g B S A o r 1 0 % e xt r a ct w e r e se p a r a t e d u si n g S u p e r o se 6 t o d e t e r m i n e i f t h e i n co r p o r a t i o n u n d e r t h e se c u l t u r e co n d i t i o n s w a s i n t o f u l l l e n g t h p r o t e o g l yca n s o r i n t o G A G si d e ch a i n s o n l y ( S u p p l e m e n t f i g u r e 2 B a n d C ) T h e ch r o m a t o g r a m s o f i n co r p o r a t e d su l f a t e o f ce l l s cu l t u r e d i n B S A a n d e xt r a ct s h o w t h a t e x t r a ct st i m u l a t e d su l f a t e i n co r p o r a t i o n sl i g h t l y m o r e t h a n B S A a n d t h e p e a ks co n t a i n i n g f u l l l e n g t h C S a n d K S p r o t e o g l yca n s a r e d e t e ct e d ( 2 B a n d C f r a ct i o n s 1 5 2 3 ) K e r a t o cyt e s a t l o w d e n si t y ( 2 B ) a s a l so sh o w n i n p a p e r 2 f i g u r e 6 d e g r a d e d m o st o f t h e syn t h e si ze d p r o t e o g l yca n s, a n d t h e G A G c h a i n s a r e d e t e ct e d b e t w e e n f r a ct i o n s

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6 0 2 7 3 2 A t h i g h p l a t i n g d e n si t y, t h e e l u t i o n p r o f i l e o f t h e syn t h e si ze d p r o t e o g l yc a n s i n t h e p r e s e n ce o f B S A o r e xt r a ct i s i d e n t i ca l t o t h e e l u t i o n p r o f i l e o f t h e syn t h e si ze d p r o t e o g l yca n s a t l o w p l a t i n g d e n si t y u n d e r t h o se cu l t u r e co n d i t i o n s. T h e i n co r p o r a t i o n p r o f i l e o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n S F M h o w e ve r i s d i f f e r e n t A t h i g h d e n si t y, m o s t o f t h e i n co r p o r a t e d su l f a t e e l u t e s b e t w e e n f r a ct i o n s 1 6 a n d 2 3 t h e si ze o f t h e f u l l l e n g t h p r o t e o g l yc a n s, t h e p e a k i n f r a ct i o n s 2 5 2 8 i s m o st l i ke l y P G D S m a d e b y ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e a s a K S P G T h e se r e su l t s su g g e st t h a t B S A i n cr e a se s p r o t e o g l yca n syn t h e si s a s w e l l a s t h e a ccu m u l a t i o n i n t h e m e d i u m B S A m a y a l so e n h a n c e t h e u p t a ke o f r a d i o l a b e l e d su l f a t e f r o m t h e m e d i u m r e su l t i n g i n i n cr e a s e d i n co r p o r a t i o n i n t o t h e p r o t e o g l yca n s. H o w e ve r i t i s a l so p o ssi b l e t h a t B S A st a b i l i ze s t h e p r o t e o g l yc a n s i n so l u t i o n p r e ve n t i n g t h e i r d e g r a d a t i o n i n cu l t u r e o r d u e t o t h e h i g h co n ce n t r a t i o n o f B S A u se d i n t h e st u d y, t h a t t h e B S A i s sh i e l d i n g t h e syn t h e si ze d p r o t e i n s f r o m d e g r a d a t i o n T h e n a t u r e o f t h e e xt r a ct a l s o su g g e s t s t h a t i t co n t a i n s E C M co m p o n e n t s o f t h e co r n e a l st r o m a si m i l a r t o t h e o n e s b e i n g syn t h e si ze d a n d se cr e t e d b y t h e ke r a t o cyt e s T h e se p r o t e i n s sh o u l d i n a m a n n e r si m i l a r t o t h e a d d e d B S A sh i e l d t h e n e w l y syn t h e si ze d p r o t e o g l yca n s f r o m d e g r a d a t i o n T h e e x t r a ct a l s o co n t a i n s B S A so i t i s co n ce i va b l e t h a t t h e B S A i n t h e st r o m a l e xt r a ct m a y a l so st a b i l i ze t h e p r o t e o g l yca n s sy n t h e si ze d i n cu l t u r e so t h a t t h e i n cr e a se i n su l f a t e i n co r p o r a t i o n d e t e c t e d i s t h e b a se r a t e o f p r o t e o l g yc a n syn t h e si s b y ke r a t o cyt e s, b u t i n s t e a d o f b e i n g d e g r a d e d t h e s e p r o t e o g l yc a n s a r e a l l o w e d t o a ccu m u l a t e i n t h e m e d i u m

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6 1 F i g u r e 2 S t i m u l a t i o n o f s u l f a t e i n c o r p o r a t i o n b y B S A ( A ) E f f e ct o f B S A o n su l f a t e i n co r p o r a t i o n b y ke r a t o cyt e s a t l o w a n d h i g h p l a t i n g d e n si t y co m p a r e d t o i n co r p o r a t i o n i n e xt r a ct ( B ) a n d ( C ) C h r o m a t o g r a m o f m e d i u m o f ce l l s cu l t u r e d i n e xt r a ct B S A o r S F M a t l o w ( B ) a n d h i g h ( C ) p l a t i n g d e n si t i e s. A

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6 2 F i g u r e 2 B a n d C S u p e r o s e 6 c h r o m a t o g r a p y o f i n c o r p o r a t e d s u l f a t e K e r a t o cyt e s w e r e p l a t e d a t l o w ( 5 0 0 0 ce l l s/ c m 2 ) ( B ) a n d h i g h d e n si t y ( 2 0 0 0 0 ce l l s/ cm 2 ) ( C ) a n d cu l t u r e d i n m e d i u m c o n t a i n i n g 0 1 m g / m l B S A o r 1 0 % st r o m a l e xt r a ct

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6 3 P a p e r 1 d e sc r i b e s t h a t t h e co r n e a l st r o m a co n t a i n s m i t o g e n s t h a t st i m u l a t e ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e i n a d o se a n d ce l l d e n si t y d e p e n d e n t m a n n e r I n t h e t h i r d e xp e r i m e n t e xt r a ct s f r o m l e n s, r e t i n a a n d vi t r e o u s f r o m b o vi n e e ye s w e r e m a d e a n d t e st e d o n ke r a t o cyt e s t o d e t e r m i n e i f t h e s e o t h e r p a r t s o f t h e e ye a l so st i m u l a t e d t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n ( S u p p l e m e n t F i g u r e 3 ) O f t h e e xt r a ct s m a d e o n l y l e n s e xt r a ct st i m u l a t e d t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n b y k e r a t o cyt e s. T h e l e n s i s b a t h e d b y t h e a q u e o u s h u m o r w h i ch a l so b a t h e s t h e co r n e a l e n d o t h e l i u m I t m a y b e p o ssi b l e t h a t t h e m i t o g e n s r e sp o n si b l e f o r a ct i vi t y i n t h e st r o m a m a y a l so b e p r e se n t i n t h e l e n s e xt r a ct b u t n o t i n o t h e r p a r t s o f t h e e ye

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6 4 F i g u r e 3 M i t o g e n i c a c t i v i t y o f e x t r a c t s m a d e f r o m l e n s v i t r e o u s a n d r e t i n a F o r r e t i n a a n d l e n s, t h e e xt r a ct p r e p a r a t i o n w a s i d e n t i ca l t o t h e p r e p a r a t i o n o f t h e st r o m a l e xt r a ct T i ssu e s w e r e e xt r a ct e d i n 1 0 vo l u m e s o f D M E M / F 1 2 o ve r n i g h t a t 4 C a n d t h e i n so l u b l e m a t e r i a l s p r e ci p i t a t e d b y ce n t r i f u g a t i o n D u e t o i t s h i g h vo l u m e t h e vi t r e o u s w a s e xt r a ct e d i n 2 vo l u m e s o f D M E M / F 1 2 o ve r n i g h t

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6 5 A ct i va t e d ke r a t o cyt e s, d u r i n g w o u n d h e a l i n g p r e d o m i n a n t l y syn t h e si ze ch o n d r o i t i n su l f a t e p r o t e o g l yca n s a n d l e ss ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n s ( 4 3 9 3 ) I n cu l t u r e t h i s i s r e p l i ca t e d b y a d d i n g f e t a l b o vi n e se r u m t o t h e cu l t u r e m e d i u m ( 9 9 1 0 0 ) I f t h e m i t o g e n s i n t h e e xt r a ct a r e r e sp o n si b l e f o r t h e a c t i va t i o n o f ke r a t o cyt e s, a d e c r e a se i n ke r a t a n su l f a t e w o u l d b e e xp e c t e d a n d a r e l a t i ve i n cr e a se i n c h o n d r o i t i n su l f a t e T o t e st t h i s, k e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n S F M o r S F M co n t a i n i n g 2 0 % e xt r a ct o r 1 0 % F B S ( S u p p l e m e n t F i g u r e 4 ) a n d b o t h t o t a l su l f a t e i n co r p o r a t i o n a s w e l l a s G A G si d e ch a i n co m p o si t i o n w e r e a n a l yze d a n d co m p a r e d K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a c t o r F B S i n co r p o r a t e d 1 1 f o l d o r 2 0 f o l d m o r e su l f a t e i n t o G A G s t h a n k e r a t o cyt e s i n S F M r e sp e ct i ve l y. 2 0 % o f t h e s e G A G s w e r e se n si t i ve t o e n d o b g a l a ct o si d a se ( E B G ) d i g e st i o n i n d i ca t i n g t h a t 2 0 % o f t h e G A G s m a d e i n e xt r a ct a r e ke r a t a n su l f a t e a si g n i f i ca n t d e cr e a se co m p a r e d t o t h e 4 0 6 0 % K S syn t h e si ze d b y q u i e sce n t ke r a t o cyt e s. I n co n t r a st o ve r 9 4 % o f t h e p r o t e o g l yca n s syn t h e si z e d b y ce l l s cu l t u r e d i n F B S w e r e se n si t i ve t o ch o n d r o i t i n a se A B C a n d o n l y 5 % t o E B G T h e se r e su l t s su g g e st t h a t ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a c t b e si d e s p r o l i f e r a t i n g a l so se cr e t e E C M co m p o n e n t s t h a t a r e d i f f e r e n t t o t h e E C M co m p o n e n t s o f t h e i n si t u q u i e sce n t ke r a t o cyt e s a n d a r e si m i l a r t o t h e E C M co m p o n e n t s d e t e ct e d d u r i n g w o u n d h e a l i n g T h i s e vi d e n c e f u r t h e r s u g g e st s t h a t t h e m i t o g e n s p r e s e n t i n t h e e xt r a ct a r e r e s p o n si b l e f o r t h e a ct i va t i o n o f ke r a t o cyt e s d u r i n g t h e w o u n d h e a l i n g r e sp o n se

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6 6 F i g u r e 4 S u l f a t e i n c o r p o r a t i o n s t i m u l a t e d b y e x t r a c t c o m p a r e d t o s e r u m A S u l f a t e i n co r p o r a t i o n b y ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n e xt r a ct o r s e r u m B t yp e o f G A G p a r e n t o f t h e i n c o r p o r a t e d su l f a t e K e r a t o cyt e s i n S F M i n co r p o r a t e e q u a l a m o u n t s o f su l f a t e i n t o b o t h C S o r K S A B

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6 7 K e r a t o cyt e s a ct i va t e d d u r i n g t h e w o u n d h e a l i n g r e sp o n s e b e co m e m yo f i b r o b l a st i c w h e n e x p o se d t o T G F r e l e a se d f r o m t h e d a m a g e d b a se m e n t m e m b r a n e ( 1 2 6 ) I n cu l t u r e t h e a ct i va t i o n i s u su a l l y r e p l i ca t e d b y t h e a d d i t i o n o f se r u m t o t h e cu l t u r e m e d i u m a n d t h e m yo f i b r o b l a st i c t r a n s f o r m a t i o n b y t h e a d d i t i o n o f T G F ( 9 8 ) R e ce n t e vi d e n ce su g g e st s t h a t T G F i s su f f i ci e n t t o ca u se t h e m yo f i b r o b l a st i c d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e ce l l s, b u t t h a t i t r e q u i r e s P G D F B B a n d i n t e g r i n si g n a l i n g ( 9 1 ) K e r a t o cyt e s a r e a l so a ct i va t e d w h e n cu l t u r e d i n e xt r a ct a n d i n t h i s e xp e r i m e n t T G F w a s a d d e d t o t h e cu l t u r e m e d i u m co n t a i n i n g e xt r a ct t o d e t e r m i n e i f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a ct a n d T G F a l so t r a n sf o r m e d i n t o t h e m yo f i b r o b l a st p h e n o t y p e ( S u p p l e m e n t F i g u r e 5 ) C o n se q u e n t l y, T G F ( 5 n g / m l ) w a s a d d e d t o ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n 1 0 % e xt r a ct T h e ce l l s w e r e p h o t o g r a p h e d a f t e r 4 d a ys, b e f o r e t h e c e l l l a ye r w a s d i sso l ve d i n 2 % S D S f o r W e st e r n b l o t a n a l ysi s ( S u p p l e m e n t F i g u r e 5 A ) K e r a t o cyt e s c u l t u r e d i n e xt r a ct m a i n t a i n t h e ch a r a ct e r i st i c d e n d r i t i c m o r p h o l o g y, b u t f l a t t e n l o s e t h e i r d e n d r i t i c m o r p h o l o g y a n d g r o w t o co ve r t h e c u l t u r e d i sh w h e n T G F i s a d d e d T h e m e d i u m o f ce l l s cu l t u r e d i n S F M ( n e g a t i v e co n t r o l ) ce l l s cu l t u r e d i n F B S p l u s T G F ( p o si t i ve c o n t r o l ) ce l l s cu l t u r e d i n e xt r a ct a n d e xt r a ct p l u s T G F w a s i m m u n o b l o t t e d ( S u p p l e m e n t F i g u r e 5 B ) a g a i n st f i b r o n e ct i n a n d S P A R C a n d t h e ce l l l a ye r f o r a S M A A w a t e r e xt r a ct o f t h e cy t o so l w a s st a i n e d f o r t o t a l p r o t e i n t o d e t e ct t h e p r e se n ce o f t h e A L D H b a n d ( f o u r t h r o w a r r o w ) P e r l e ca n w a s d e t e ct e d b y i m m u n o p r e ci p i t a t i o n K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n S F M o r e xt r a ct a l o n e d o n o t m a ke p e r l e ca n S P A R C o r f i b r o n e ct i n o r co n t a i n a S M A a t e i t h e r d a y 4 o r d a y 8 T h e A L D H b a n d i n ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a ct o r e x t r a ct p l u s T G F

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6 8 h o w e ve r d e cr e a s e s co n si d e r a b l y b y d a y 4 a n d i s o n l y f a i n t i n t h e d a y 8 st r o m a l e xt r a ct cu l t u r e s. N o b a n d w a s d e t e ct e d i n t h e ce l l s cu l t u r e d i n e xt r a ct p l u s T G F K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a ct p l u s T G F h o w e ve r a r e p o si t i ve f o r a l l f i b r o t i c m a r ke r s. A w e a k si g n a l i s d e t e ct e d a t d a y 4 b u t t h e si g n a l s a r e v e r y st r o n g a t d a y 8 T h e se d a t a su g g e st s t h a t t h e m i t o g e n s i n t h e e xt r a ct a ct i va t e ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e b u t d o n o t ca u s e t h e m t o b e co m e m yo f i b r o b l a st i c a n d e xp r e ss m a r ke r s f o r t h a t p h e n o t yp e I t i s l i ke l y t h a t ke r a t o cyt e s r e s p o n d t o T G F st i m u l a t i o n b y i n d u ci n g P D G F e xp r e ssi o n b u t t h a t t h i s t r a n sf o r m a t i o n i s sl o w P D G F h o w e ve r i s p r e s e n t i n se r u m s o t h e f i b r o b l a st m yo f i b r o b l a st p h e n o t y p e ch a n g e o ccu r s i n l e ss t i m e t h a n i n cu l t u r e s w i t h o u t e xt r a n e o u s P D G F ( l i ke e xt r a ct o r S F M + T G F ) T a ki n g t h e d a t a f r o m S u p p l e m e n t F i g u r e 4 a n d F i g u r e 5 t o g e t h e r i n d i ca t e t h a t cu l t u r e i n e xt r a ct o n l y r e su l t s i n t h e a ct i va t i o n o f t h e ke r a t o cyt e s, b u t n o t i n a m yo f i b r o b l a st i c t r a n sf o r m a t i o n u n l e ss T G F i s p r e se n t i n t h e cu l t u r e m e d i u m W h e n e x t r a ct a n d T G F a r e u se d t h e ce l l s b e co m e m yo f i b r o b l a st i c, a n d e xp r e ss t h e m a r ke r s f o r t h a t p h e n o t yp e

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6 9 F i g u r e 5 E f f e c t o f T G F o n k e r a t o c y t e c u l t u r e s ( A ) C e l l m o r p h o l o g y o f ce l l s cu l t u r e d i n e xt r a ct ( A ) o r e xt r a c t w i t h T G F ( B ) ( B ) W e st e r n b l o t s o f t h e m e d i u m o f d a y 1 d a y 4 a n d d a y 8 cu l t u r e s f o r S P A R C f i b r o n e ct i n a n d t h e ce l l l a ye r f o r a S M A T o t a l w a t e r so l u b l e cy t o so l i c p r o t e i n s st a i n e d w i t h C o o m a ssi e f o r A L D H ( a r r o w ) D D M E M / F 1 2 ( co n t r o l ) ; S E st r o m a l e xt r a ct 1 0 % ; S E T 1 0 % S t r o m a l e xt r a ct 5 n g / m l T G F ; F T 1 0 % F B S 5 n g / m l T G F ( p o si t i ve co n t r o l ) P r e st a i n e d m o l e cu l a r w e i g h t m a r ke r s a r e i n d i ca t e d a t t h e m a r g i n A e xt r a ct B e xt r a ct p l u s T G F

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7 0 F i g u r e 5 B W e s t e r n b l o t s t o f i b r o n e c t i n S P A R C a n d a S M A

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7 1 T h e m i t o g e n i c a ct i vi t y i n t h e e xt r a ct e l u t e d i n t h e h i g h m o l e cu l a r m a ss r a n g e w h e n f r a ct i o n a t e d u si n g S 3 0 0 g e l f i l t r a t i o n ch r o m a t o g r a p h y ( p a p e r 1 f i g u r e 7 ) a n d l o w s a l t b u f f e r s, su g g e st i n g t h a t t h e m i t o g e n s f o u n d i n e xt r a ct a r e e i t h e r o f ve r y l a r g e si ze o r t h a t t h e y a r e p a r t o f a l a r g e co m p l e x. I n o r d e r t o i so l a t e o r i d e n t i f y t h e c o m p o n e n t s o f t h e co m p l e x, st r o n g d e n a t u r i n g so l ve n t s, su ch a s 4 M g u a n i d i n e H C l o r 8 M u r e a a r e co m m o n l y u se d T h e u se o f t h e se so l v e n t s, h o w e ve r r e su l t e d i n t h e l o ss o f m o s t o f t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y a n d co u l d n o t b e r e co ve r e d a f t e r e xt e n si ve d i a l ysi s a g a i n st w a t e r o r b y d i a l ysi s o f g u a n i d i n e e xp o se d e xt r a ct a g a i n st w a t e r ( d a t a n o t sh o w n ) C o n se q u e n t l y a s a n a l t e r n a t i ve l e ss st r i n g e n t b u f f e r s w e r e u s e d t o f r a ct i o n a t e t h e e xt r a ct ( S u p p l e m e n t F i g u r e 6 A a n d B ) T h e e l u t i o n p r o f i l e s o f t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y u si n g l o w a n d h i g h N a C l co n ce n t r a t i o n s u n d e r n o n d e n a t u r i n g a n d m i l d d e n a t u r i n g co n d i t i o n s a r e sh o w n i n S u p p l e m e n t F i g u r e 6 A a n d B E xt r a ct w a s d i a l yze d a g a i n st w a t e r co n ce n t r a t e d 1 0 f o l d a n d i t s N a C l co n t e n t a d j u st e d t o 0 1 5 o r 2 M N a C l ( A ) p r i o r t o f r a ct i o n a t i o n o n a n S 3 0 0 co l u m n e q u i l i b r a t e d a n d e l u t e d i n b u f f e r c o n t a i n i n g t h e sa m e s a l t co n ce n t r a t i o n T h e f r a ct i o n s w e r e t h e n d i a l yze d a g a i n st D I w a t e r d i l u t e d w i t h t h e sa m e v o l u m e o f 2 X D M E M / F 1 2 a n d st e r i l i ze d b y f i l t r a t i o n p r i o r t o t h e i r u se i n ce l l cu l t u r e T h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n w a s m e a s u r e d a s d e sc r i b e d i n p a p e r 1 T h e n a r r o w p e a k ( 2 f r a ct i o n s ) co n t a i n i n g m i t o g e n i c a ct i vi t y d e t e ct e d a t p h ysi o l o g i ca l sa l t co n ce n t r a t i o n s b r o a d e n s co n si d e r a b l y a t 2 M N a C l ( A ) ( t o 4 f r a ct i o n s) su g g e s t i n g t h a t t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y i s p a r t o f a co m p l e x h e l d t o g e t h e r a t l e a st p a r t i a l l y b y ch a r g e ch a r g e i n t e r a ct i o n s. W h e n t h e e xp e r i m e n t w a s r e p e a t e d b u t t h e e x t r a ct f r a ct i o n a t e d i n b u f f e r co n t a i n i n g 1 M U r e a 1 m M

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7 2 C H A P S a n d va r yi n g co n ce n t r a t i o n s o f N a C l ( B ) ( 0 1 5 M 1 M a n d 2 M r e sp e ct i ve l y) t h e m i t o g e n i c a c t i vi t y e l u t e d a s a b r o a d e r p e a k i n l o w sa l t ( so l i d l i n e ) I n c r e a si n g t h e N a C l co n c e n t r a t i o n t o 1 M n a r r o w e d t h e e l u t i o n p r o f i l e o f t h e m i t o g e n p e a k, a n d a d i st i n ct se co n d p e a k f o r m e d a t f r a ct i o n 8 W h e n s e p a r a t e d u si n g b u f f e r co n t a i n i n g 2 M N a C l t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y e l u t e d i n t w o d i st i n ct n a r r o w p e a ks. T h i s f u r t h e r su g g e st s t h a t t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y o f t h e e xt r a ct i s p a r t o f a p r o t e i n p r o t e i n c o m p l e x, a n d n o t d u e t o o n e l a r g e p r o t e i n T a k e n t o g e t h e r t h e se d a t a s u g g e st t h a t t h e e xt r a ct c o n t a i n s a co m p l e x t h a t h a s m i t o g e n i c a ct i vi t y, t h a t i s h e l d t o g e t h e r b y b o t h ch a r g e ch a r g e a n d p r o t e i n p r o t e i n i n t e r a ct i o n s.

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7 3 F i g u r e 6 G e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ( a ) S 3 0 0 ch r o m a t o g r a p h y o f e xt r a ct i n l o w o r h i g h N a C l ( A ) o r u n d e r d i sso ci a t i n g c o n d i t i o n s ( B ) ( A ) E xt r a ct w a s co n ce n t r a t e d 1 0 f o l d a n d se p a r a t e d o n S 3 0 0 i n r u n n i n g b u f f e r co n t a i n i n g l o w ( 0 1 5 M so l i d l i n e ) o r h i g h ( 2 M d a sh e d l i n e ) N a C l ( B ) C o n ce n t r a t e d e xt r a ct w a s se p a r a t e d o n t h e sa m e co l u m n a t i n c r e a si n g N a C l co n ce n t r a t i o n s i n t h e p r e se n ce o f 1 m M C H A P S a n d 1 M u r e a

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7 4 F i g u r e 6 G e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ( a ) S 3 0 0 ch r o m a t o g r a p h y o f e xt r a ct i n l o w o r h i g h N a C l ( A ) o r u n d e r d i sso ci a t i n g c o n d i t i o n s ( B ) ( A ) E xt r a ct w a s co n ce n t r a t e d 1 0 f o l d a n d se p a r a t e d o n S 3 0 0 i n r u n n i n g b u f f e r co n t a i n i n g l o w ( 0 1 5 M so l i d l i n e ) o r h i g h ( 2 M d a sh e d l i n e ) N a C l ( B ) C o n ce n t r a t e d e xt r a ct w a s se p a r a t e d o n t h e sa m e co l u m n a t i n c r e a si n g N a C l co n ce n t r a t i o n s i n t h e p r e se n ce o f 1 m M C H A P S a n d 1 M u r e a

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7 5 H e p a r i n a f f i n i t y ch r o m a t o g r a p h y h a s b e e n u se d t o p u r i f y g r o w t h f a ct o r s f r o m se r u m a n d a l so t i ssu e s ( 1 4 7 1 5 2 ) H e p a r i n i s n e g a t i v e l y ch a r g e d so i n t e r a ct i o n s w i t h t h i s m a t r i x a r e b a se d o n ch a r g e T o t e st i f h e p a r i n a f f i n i t y co u l d b e u se d t o i so l a t e t h e m i t o g e n i n t h e e xt r a ct 2 m l o f e xt r a ct w a s f r a ct i o n a t e d o n 1 m l o f h e p a r i n se p h a r o s e ( S u p p l e m e n t F i g u r e 7 ) T h e u n b o u n d m a t e r i a l w a s co l l e ct e d i n t h e p a ss t h r o u g h ( P T ) T h e r e si n w a s w a sh e d w i t h 5 vo l u m e s o f P B S ( 5 m l t o t a l ) T h e b o u n d p r o t e i n s w e r e e l u t e d w i t h 2 m l o f 0 5 M N a C l ( l o w sa l t L S ) a n d 2 m l o f 2 M N a C l ( h i g h sa l t H S ) T h e m i t o g e n i c a ct i vi t y o f t h e s e f r a ct i o n s w e r e t e st e d e i t h e r a l o n e o r co m b i n e d a n d co m p a r e d t o e xt r a ct a l o n e M o st o f t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y d i d n o t b i n d t o t h e r e si n a n d w a s d e t e ct e d i n t h e P T S o m e a ct i vi t y b o u n d t o t h e m a t r i x a n d e l u t e d i n t h e L S a n d i n t h e H S w a sh e s. W h e n t h e se t w o f r a ct i o n s w e r e co m b i n e d h o w e ve r a 7 f o l d i n c r e a se i n t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n o v e r t h e H S e l u a t e a n d 2 0 f o l d o ve r t h e L S e l u a t e w a s m e a su r e d su g g e st i n g a syn e r g i st i c i n cr e a se o n a ct i vi t y. A syn e r g i st i c i n cr e a se i n t h ym i d i n e i n c o r p o r a t i o n w a s d e t e ct e d w h e n t h e L S a n d t h e H S f r a ct i o n s w e r e co m b i n e d C o m b i n i n g t h e L S a n d t h e P T d i d n o t i n cr e a s e t h e a ct i vi t y o f t h e P T a l o n e b u t w h e n a l l t h r e e f r a ct i o n s w e r e c o m b i n e d t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y i n cr e a se d t o t w i ce t h e a ct i vi t y o f t h e P T a l o n e ( o r P T + L S ) T h e s e r e su l t s su g g e st t h a t t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y i s d e p e n d e n t o n co m p o n e n t s o f t h e co m p l e x p r e se n t i n a l l t h r e e f r a ct i o n s a n d t h a t t h e l o ss o f e i t h e r co m p o n e n t r e su l t s i n a l o ss o f p o t e n cy.

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7 6 F i g u r e 7 H e p a r i n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f 1 0 0 % e x t r a c t U n d i l u t e d e xt r a ct w a s f r a ct i o n a t e d u si n g h e p a r i n i n t o u n b o u n d ( p a sst h r o u g h ) 0 5 M a n d 2 M N a C l f r a ct i o n s ( L S a n d H S r e sp e ct i ve l y) T h e m i t o g e n i c a ct i vi t y o f t h e f r a ct i o n s w a s m e a su r e d a l o n e o r co m b i n e d w i t h o t h e r f r a ct i o n s.

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7 7 I n t h e l a st e xp e r i m e n t o f t h e su p p l e m e n t ( S u p p l e m e n t F i g u r e 8 ) b o vi n e g r o w t h f a ct o r s f o u n d i n s e r u m ( F G F 2 P D G F B B a n d I G F 1 ) a n d t h e i r n e u t r a l i zi n g a n t i b o d i e s w e r e p u r ch a se d a n d t e st e d t o d e t e r m i n e i f t h e s e g r o w t h f a ct o r s w e r e p a r t o f t h e a ct i ve c o m p l e x i n t h e st r o m a l e xt r a ct T o t e s t t h i s, S F M w a s su p p l e m e n t e d e i t h e r w i t h g r o w t h f a ct o r a n t i b o d y o r e xt r a ct a l o n e o r w i t h g r o w t h f a ct o r s p l u s t h e i r r e sp e ct i v e a n t i b o d y o r e xt r a ct p l u s a n t i b o d y, vo r t e xe d a n d i n cu b a t e d f o r 1 h o u r a t 3 7 C a n d t h e n u se d a s cu l t u r e m e d i u m f o r ke r a t o cyt e s p l a t e d a t l o w d e n si t y. A l l t h e g r o w t h f a ct o r s st i m u l a t e d t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n a n d t h e i r a ct i vi t y w a s si g n i f i ca n t l y r e d u ce d w h e n co i n cu b a t e d w i t h t h e i r n e u t r a l i zi n g a n t i b o d i e s. T h e p r e se n ce o f t h e s e a n t i b o d i e s, h o w e ve r d i d n o t r e d u ce t h e st i m u l a t o r y a c t i vi t y o f e xt r a ct W e s t e r n b l o t s o f e xt r a ct t o t h e se g r o w t h f a ct o r s a l so f a i l e d t o d e t e ct t h e m a n d n o i n su l i n w a s d e t e ct e d e i t h e r T h e se r e su l t s su g g e st t h a t t h e m i t o g e n i c a ct i v i t y i n t h e st r o m a l e xt r a ct i s n o t d u e t o a n y o f t h e se f o u r g r o w t h f a c t o r s.

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7 8 F i g u r e 8 A n t i b o d y n e u t r a l i za t i o n o f s t r o m a l e x t r a c t G r o w t h f a ct o r s a n d t h e i r r e sp e ct i ve n e u t r a l i zi n g a n t i b o d i e s w e r e o b t a i n e d C u l t u r e m e d i u m a l o n e o r m e d i u m su p p l e m e n t e d w i t h g r o w t h f a ct o r s o r e xt r a c t w e r e i n cu b a t e d f o r 1 h o u r a t 3 7 C w i t h o r w i t h o u t t h e n e u t r a l i zi n g a n t i b o d i e s a t t h e co n ce n t r a t i o n s r e co m m e n d e d b y t h e m a n u f a ct u r e r T h e a n t i b o d i e s n e u t r a l i ze d t h e a ct i vi t y o f t h e p u r i f i e d g r o w t h f a ct o r s, b u t n o t t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y o f e xt r a ct

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7 9 P A P E R 2 : M A I N T E N A N C E O F T H E K E R A T O C Y T E P H E N O T Y P E D U R I N G C E L L P R O L I F E R A T I O N S T I M U L A T E D B Y I N S U L I N K u r t M u s s e l m a n n 1 B r i d g e t t e A l e x a n d r o u 1 B r a d l e y K a n e 1 a n d J o h n R H a s s e l l 1 2 1 D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a C o l l e g e o f M e d i c i n e 1 2 9 0 1 B r u c e B D o w n s B o u l e v a r d T a m p a F l o r i d a 3 3 6 1 2 2 S h r i n e r s H o s p i t a l s f o r C h i l d r e n T a m p a 1 2 5 0 2 P i n e D r i v e T a m p a F l o r i d a 3 3 6 1 2 P u b l i s h e d i n : J o u r n a l o f B i o l o g i c a l C h e m i s t r y 2 8 0 ( 3 8 ) 3 2 6 3 4 3 2 6 3 9 R u n n i n g T i t l e : K e r a t o cyt e cu l t u r e i n i n su l i n A d d r e ss co r r e sp o n d e n ce t o : Jo h n R H a sse l l S h r i n e r s H o sp i t a l f o r C h i l d r e n R e se a r ch M o l e cu l a r B i o l o g y, 1 2 5 0 2 P i n e D r i v e T a m p a F L 3 3 6 1 2 T e l 8 1 3 9 7 5 7 1 4 4 ; F a x. 8 1 3 9 7 5 7 1 2 7 ; E m a i l : j h a sse l l @ s h ct a m p a u sf e d u

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8 0 S U M M A R Y K e r a t o cyt e s n o r m a l l y e xp r e ss h i g h l e ve l s o f a l d e h yd e d e h yd r o g e n a se a n d ke r a t o ca n T h e y p r o l i f e r a t e a n d l o se t h e i r ke r a t o cyt e m a r k e r s w h e n t h e y b e c o m e f i b r o b l a st i c d u r i n g c o r n e a l w o u n d h e a l i n g K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n f e t a l b o vi n e se r u m a l so b e c o m e f i b r o b l a s t i c, p r o l i f e r a t e a n d l o se t h e se m a r k e r s. I n t h i s r e p o r t w e st u d i e d t h e e f f e ct s o f t h r e e se r u m g r o w t h f a ct o r s, F G F 2 i n su l i n a n d P D G F B B o n ke r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n a n d t h e m a i n t e n a n ce o f t h e ke r a t o cy t e m a r ke r s i n 7 d a y cu l t u r e s i n ce l l s p l a t e d a t l o w ( 5 0 0 0 ce l l s/ cm 2 ) a n d h i g h ( 2 0 0 0 0 c e l l s/ cm 2 ) d e n si t y i n se r u m f r e e m e d i u m K e r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n w a s m e a su r e d b y 3 H t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n a n d b y D N A co n t e n t o f t h e cu l t u r e s. C yt o so l i c a l d e h yd e d e h yd r o g e n a se a n d ke r a t o ca n a ccu m u l a t e d i n t h e m e d i u m w e r e q u a n t i f i e d b y W e st e r n b l o t T h e r e s u l t s sh o w e d a l l t h e g r o w t h f a ct o r s st i m u l a t e d p r o l i f e r a t i o n b u t i n s u l i n st i m u l a t e d p r o l i f e r a t i o n m o r e co n si st e n t l y. T h e ke r a t o cyt e m a r ke r s A L D H a n d ke r a t o ca n w e r e m a i n t a i n e d a f t e r 7 d a ys i n cu l t u r e i n a l l g r o w t h f a ct o r s, b u t ke r a t o cyt e c e l l m o r p h o l o g y w a s o n l y m a i n t a i n e d i n m e d i u m c o n t a i n i n g i n su l i n M o st o f t h e p r o t e o g l yca n s w e r e d e g r a d e d i n cu l t u r e s o f ke r a t o cyt e s p l a t e d a t l o w d e n si t y a n d cu l t u r e d i n t h e a b se n c e o f g r o w t h f a ct o r s. T h i s d e g r a d a t i o n w a s p r e ve n t e d w h e n ke r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n t h e p r e se n ce o f t h e g r o w t h f a ct o r s o r w h e n ke r a t o cyt e s w e r e p l a t e d a t h i g h d e n si t y. T h e r e su l t s o f t h i s st u d y sh o w t h a t i n su l i n ca n e xp a n d ke r a t o cyt e s i n vi t r o m a i n t a i n t h e i r p h e n o t yp e a n d p r e ve n t p r o t e o g l yca n d e g r a d a t i o n

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8 1 I N T R O D U C T I O N K e r a t o cyt e s, t h e ce l l s o f t h e m a t u r e co r n e a l st r o m a h a ve a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y a n d a r e r e sp o n si b l e f o r t h e m a i n t e n a n ce o f t h e e xt r a ce l l u l a r m a t r i x o f t h e st r o m a T h e se ce l l s p r o d u ce l u m i ca n a n d ke r a t o ca n t w o ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yc a n s ( 4 1 4 2 ) t h a t a r e n e c e ssa r y t o m a i n t a i n t h e t r a n sp a r e n cy a n d sh a p e o f t h e st r o m a L u m i ca n a n d ke r a t o ca n a r e m e m b e r s o f t h e S L R P f a m i l y a n d a r e t h e m o st a b u n d a n t ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n s i n t h e co r n e a l st r o m a ( 1 5 3 ) L u m i ca n i s a l so p r e se n t i n m a n y t i ss u e s ( 4 1 ) a s a g l yco syl a t e d p r o t e i n K e r a t o ca n i s e xcl u si ve l y f o u n d a s a p r o t e o g l yca n i n t h e co r n e a ( 4 1 1 5 4 ) B o t h ke r a t o ca n a n d l u m i ca n ( 5 5 0 1 5 3 ) i n t e r a ct w i t h co l l a g e n f i b r i l s a n d m o d u l a t e t h e i r si ze a n d sp a ci n g ( 5 2 5 1 5 3 1 5 5 ) T h e co l l a g e n f i b r i l s o f b o t h l u m i ca n ( 5 1 5 3 1 5 5 1 5 6 ) a n d k e r a t o c a n ( 1 5 3 1 5 7 ) k n o ck o u t m i c e a r e l a r g e r a n d l e ss d e n se l y p a cka g e d t h a n t h e co l l a g e n h e t e r o f i b r i l s i n t h e n o r m a l st r o m a a n d i n t h e l u m i ca n n u l l m o u se t h e co r n e a s l o se t r a n sp a r e n cy ( 1 5 3 1 5 5 ) T h e co r n e a s i n t h e ke r a t o ca n n u l l m o u se w e r e r e d u c e d i n t h i c kn e ss, m o st l i ke l y d u e t o r e d u ce d h yd r a t i o n o f t h e c o r n e a l st r o m a M u t a t i o n s i n t h e h u m a n ke r a t o ca n g e n e h a ve b e e n i d e n t i f i e d a s a ca u se o f co r n e a p l a n a ( 1 5 7 1 5 9 ) T h i s su g g e st s t h a t ke r a t o ca n p l a ys a f u n d a m e n t a l r o l e i n m a i n t e n a n ce o f t h e c o r n e a l st r u ct u r e a n d t h a t i t s f u n ct i o n c a n n o t b e r e scu e d b y o t h e r m e m b e r s o f t h e S L R P f a m i l y ( 1 6 0 ) K e r a t o cyt e s n o r m a l l y e xh i b i t a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y, b u t b e co m e f i b r o b l a st i c i n a p p e a r a n ce d u r i n g w o u n d h e a l i n g B o t h ke r a t a n su l f a t e syn t h e si s a n d t h e e xp r e ssi o n o f ke r a t o ca n su b st a n t i a l l y d e cr e a se d u r i n g t h e f i b r o b l a st / m yo f i b r o b l a st t r a n sf o r m a t i o n t h a t o ccu r s d u r i n g w o u n d h e a l i n g ( 4 3 1 2 9 1 6 1 )

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8 2 K e r a t o cyt e s i so l a t e d f r o m t h e st r o m a a n d cu l t u r e d i n se r u m f r e e m e d i u m r e t a i n a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y, a n d m a i n t a i n t h e e xp r e ssi o n o f A L D H a n d ke r a t o ca n a f t e r e xt e n d e d p e r i o d i n cu l t u r e ( 8 6 1 0 0 1 6 1 1 6 2 ) H o w e ve r w h e n t h e m e d i u m i s su p p l e m e n t e d w i t h f e t a l b o vi n e se r u m t h e ke r a t o cyt e s e xh i b i t f i b r o b l a st i c o r m yo f i b r o b l a st i c p h e n o t y p e s ( 8 6 9 9 ) K e r a t a n su l f a t e syn t h e si s a n d ke r a t o ca n e xp r e ssi o n d e c r e a se ( 1 6 3 ) i n a m a n n e r r e m i n i sce n t o f i n vi vo w o u n d h e a l i n g ( 1 6 1 ) T h i s i n d i ca t e s t h a t ke r a t o ca n ca n b e co n si d e r e d a m a r ke r f o r t h e n a t i ve ke r a t o cyt e p h e n o t yp e ( 1 0 0 ) K e r a t o cyt e s co n t a i n u n u su a l l y l a r g e a m o u n t s o f co r n e a l c r yst a l l i n s su ch a s a l d e h yd e d e h yd r o g e n a se ( A L D H ) ( 8 6 8 8 1 0 0 ) I t h a s b e e n sp e cu l a t e d t h a t cr yst a l l i n s m a y p l a y a r o l e i n m a t ch i n g t h e r e f r a ct i ve i n d e x o f t h e i n t r a ce l l u l a r sp a ce t o t h e r e f r a ct i ve i n d e x o f t h e st r o m a ( 8 8 ) o r t h e y m a y h e l p o r g a n i ze t h e i n t r a ce l l u l a r sp a ce a n d t h u s r e d u ce ke r a t o cyt e r e f l e ct i vi t y ( 8 5 ) A L D H m a y a l so p r o t e ct t h e co r n e a f r o m U V i r r a d i a t i o n ( 1 6 4 ) C o r n e a l cr yst a l l i n l e ve l s d e cr e a s e m a r ke d l y i n w o u n d h e a l i n g ke r a t o cyt e s i n vi vo a n d t h i s w o u l d p a r t i a l l y e xp l a i n t h e i n cr e a se d h a zi n e ss o b se r v e d d u r i n g t h e h e a l i n g o f co r n e a l w o u n d s ( 8 6 8 8 1 0 0 ) A L D H i s a 5 2 kD a p r o t e i n a n d i s l o st f r o m t h e cyt o p l a s m d u r i n g cu l t u r e i n se r u m ( 1 0 0 ) T h i s i n d i ca t e s t h a t a h i g h l e ve l o f cyt o so l i c A L D H i s a l so a m a r ke r o f t h e n a t i ve ke r a t o cyt e p h e n o t yp e T h e l o ss o f ke r a t o ca n a n d A L D H b y ke r a t o cy t e s i n cu l t u r e i s l i ke l y d u e t o f a ct o r s i n se r u m t h a t ca u se ch a n g e s i n t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e S e r u m i s a co m p l e x m i xt u r e o f sa l t s, p r o t e i n s, l i p i d s, g r o w t h f a ct o r s a n d h o r m o n e s.

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8 3 O n e o f t h e g r o w t h f a ct o r s i n se r u m i s P D G F B B ( 1 6 5 ) w h i ch i s r e l e a se d f r o m t h e p l a t e l e t s d u r i n g t h e cl o t t i n g p r o ce ss ( 1 6 6 ) R e m o va l o f t h e p l a t e l e t s f r o m b l o o d p r i o r t o t h e cl o t t i n g p r o ce ss p r o d u ce s s e r u m w i t h su b st a n t i a l l y l e ss g r o w t h p r o m o t i n g p r o p e r t i e s ( 1 6 7 ) I n ke r a t o cyt e cu l t u r e s, i n cl u si o n o f P D G F B B i n cu l t u r e m e d i u m c a u se s ce l l m i g r a t i o n a n d p r o l i f e r a t i o n a s w e l l a s co l l a g e n g e l co n t r a ct i o n a n d f i b r o b l a st i c d i f f e r e n t i a t i o n ( 1 6 2 ) I n s u l i n i s a l so p r e se n t i n se r u m ( 1 6 8 ) I n su l i n i n t e r a ct s w i t h i t s r e ce p t o r a n d m o d u l a t e s m e t a b o l i c p r o c e sse s b u t a l so a ct s a s a m i t o g e n f o r so m e ce l l t yp e s ( 1 6 9 1 7 0 ) S t u d i e s h a ve s h o w n t h a t i n su l i n r e ce p t o r s a r e p r e s e n t i n t h e a n t e r i o r s e g m e n t o f t h e e ye a n d i n su l i n h a s b e e n i d e n t i f i e d a s a c o m p o n e n t o f t e a r f i l m ( 1 7 1 ) P a t i e n t s w i t h t yp e I a n d I I d i a b e t e s m e l l i t u s h a ve a b n o r m a l c h a n g e s o c cu r a t t h e a n t e r i o r s e g m e n t o f t h e e ye ( 1 7 2 ) P a t i e n t s w i t h d i a b e t e s sh o w a t h i cke n i n g o f t h e co r n e a l st r o m a ( 1 7 2 1 7 3 ) d u e t o a cc u m u l a t i o n o f w a t e r a n d e l e va t e d s t r o m a l m R N A a n d p r o t e i n l e ve l s o f M M P 3 a n d M M P 1 0 ( st r o m e l ysi n 1 a n d 2 r e sp e ct i ve l y ) ( 1 7 3 1 7 5 ) F e t a l b o vi n e se r u m a l so co n t a i n s F G F 2 ( 1 7 6 1 7 7 ) a n d F G F 2 h a s b e e n sh o w n t o p r o m o t e ke r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n a s w e l l a s ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n se c r e t i o n i n t o t h e m e d i u m w h e n ce l l s w e r e cu l t u r e d i n 0 1 % p l a t e l e t p o o r h o r se se r u m ( 1 7 8 ) H e r e w e c h a r a c t e r i ze t h e e f f e ct s o f F G F 2 i n s u l i n a n d P D G F B B i n d e f i n e d ce l l cu l t u r e m e d i u m o n ke r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n a n d m o r p h o l o g y a s w e l l a s o n ke r a t a n su l f a t e syn t h e si s a n d A L D H e xp r e ssi o n t w o kn o w n m a r ke r s o f t h e n a t i ve ke r a t o cyt e p h e n o t yp e W e f i n d t h a t a l l g r o w t h f a ct o r s ca u se d ce l l p r o l i f e r a t i o n a n d m a i n t a i n e d ke r a t o ca n a n d A L D H e xp r e ssi o n b u t o n l y i n su l i n m a i n t a i n e d t h e d e n d r i t i c m o r p h o l o g y o f ke r a t o cyt e s. T h e r e s u l t s o f t h i s st u d y

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8 4 su g g e st t h a t i n su l i n m a y p l a y a r o l e i n t h e m a i n t e n a n ce o f t h e co r n e a l st r o m a a f t e r w o u n d i n g M A T E R I A L S A N D M E T H O D S C h e m i c a l s C h e m i ca l s w e r e f r o m S i g m a A l d r i ch ( S t L o u i s M O ) u n l e ss o t h e r w i se i n d i ca t e d C e l l C u l t u r e B o vi n e ke r a t o cyt e s w e r e i so l a t e d u si n g t w o s e q u e n t i a l c o l l a g e n a s e d i g e st i o n s a s p r e vi o u sl y d e sc r i b e d ( 1 3 9 1 7 9 ) B r i e f l y, co r n e a s w e r e o b t a i n e d f r o m f r e s h l y h a r ve st e d 1 2 1 8 m o n t h o l d ca l f e ye s ( P e l F r e e z, R o g e r s, A R ) T h e ce n t r a l p o r t i o n o f t h e co r n e a w a s m i n ce d a n d d i g e st e d w i t h 3 3 m g / m l S i g m a b l e n d C o l l a g e n a se T yp e L a t 3 7 C u n d e r sh a ki n g f o r 4 5 m i n t o r e m o ve t h e e p i t h e l i u m a n d t h e e n d o t h e l i u m T h e r e m a i n i n g st r o m a l f r a g m e n t s w e r e f u r t h e r d i g e st e d w i t h f r e sh co l l a g e n a se f o r a n a d d i t i o n a l 1 5 0 m i n t o d i sr u p t t h e m a t r i x a n d r e l e a se t h e ke r a t o cyt e s. T h e ce l l s w e r e p e l l e t e d b y l o w sp e e d ce n t r i f u g a t i o n ( 4 0 0 x g f o r 1 0 m i n ) a n d r e su sp e n d e d i n D M E M / F 1 2 ( G i b co I n vi t r o g e n C a r l sb a d C A ) C e l l vi a b i l i t y a n d n u m b e r w e r e d e t e r m i n e d u si n g t r yp a n b l u e e xcl u si o n T h e ce l l s w e r e t h e n p l a t e d i n se r u m f r e e D M E M / F 1 2 i n t o 6 w e l l p l a t e s ( C o st a r C a m b r i d g e M A ) a t l o w d e n si t y ( 5 0 0 0 ce l l s/ cm 2 ) o r h i g h d e n si t y ( 2 0 0 0 0 ce l l s/ cm 2 ) a n d a l l o w e d t o a t t a ch o ve r n i g h t a t 3 7 C i n 5 % C O 2 T h e m e d i u m w a s ch a n g e d t h e n e xt d a y a n d e ve r y t h i r d d a y a f t e r w a r d s w i t h f r e sh D M E M / F 1 2 o r D M E M / F 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h F G F 2 ( 1 0 n g / m l ) i n su l i n ( 1 0 g / m l ) P D G F B B ( 5 0 n g / m l ) o r

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8 5 I T S [ ( I n vi t r o g e n C a r l sb a d C A ; co n t a i n s i n su l i n ( 1 0 g / m l ) t r a n sf e r r i n ( 5 5 g / m l ) a n d se l e n i u m 0 6 7 g / m l ) ] F G F 2 a n d P D G F B B w e r e u s e d a t co n ce n t r a t i o n s p r e vi o u sl y sh o w n t o st i m u l a t e m a xi m u m o r n e a r m a xi m u m p r o l i f e r a t i o n o f ke r a t o cyt e s ( 1 6 2 ) T h e F G F 2 a n d P D G F B B w e r e d i ss o l ve d i n 1 m g / m l b o vi n e se r u m a l b u m i n ( B S A ) a s p e r t h e m a n u f a ct u r e r s i n st r u ct i o n s t h a t r e su l t e d i n a f i n a l co n ce n t r a t i o n 4 0 0 a n d 1 0 0 0 n g o f B S A / m l m e d i u m r e sp e c t i ve l y. T h e p r e se n ce o f t h e se l o w l e ve l s o f B S A i n t h e m e d i u m d i d n o t r e su l t i n a n i n cr e a se i n D N A co n t e n t A L D H ke r a t o ca n l e ve l s o r 3 5 S O 4 i n co r p o r a t i o n i n t o p r o t e o g l yc a n s ( d a t a n o t sh o w n ) 3 5 S O 4 i n c o r p o r a t i o n i n t o p r o t e o g l y c a n s C u l t u r e s w e r e su p p l e m e n t e d w i t h 5 0 C i / m l o f 3 5 S O 4 ( N E N P e r ki n E l m e r B o st o n M A ) o n d a y 1 f o r 7 2 h o u r s a n d t h e m e d i u m w a s co l l e ct e d f r o z e n a n d l yo p h i l i ze d T h e d r y m e d i u m w a s t h e n r e co n st i t u t e d i n 4 M G u H C l a n d u n i n co r p o r a t e d 3 5 S O 4 w a s r e m o ve d u si n g P D 1 0 co l u m n s ( A m e r sh a m B i o sci e n ce s, P i sca t a w a y, N J) T h e f r a ct i o n s co n t a i n i n g i n c o r p o r a t e d 3 5 S O 4 w e r e co m b i n e d co n ce n t r a t e d u si n g A m i co n U l t r a sp i n co n ce n t r a t o r s ( M i l l i p o r e C o r p M i l l f o r d M A ) a n d f r a ct i o n a t e d u si n g a S u p e r o se 6 1 2 / 3 0 H R c o l u m n ( A m e r sh a m B i o sci e n ce s, P i sca t a w a y, N J ) e q u i l i b r a t e d a n d e l u t e d w i t h 4 M G u H C l co n t a i n i n g 0 0 5 M so d i u m a ce t a t e p H 6 5 a t a f l o w r a t e o f 0 3 m l / m i n F r a ct i o n s ( 0 6 m l ) w e r e co l l e ct e d a n d i n co r p o r a t i o n m e a su r e d b y l i q u i d sci n t i l l a t i o n co u n t i n g

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8 6 D N A q u a n t i t a t i o n a n d 3 H t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n C e l l cu l t u r e s w e r e l a b e l e d w i t h 2 0 ( C i / m l o f 3 H t h ym i d i n e ( N E N P e r ki n E l m e r B o st o n M A ) f o r 7 2 h p e r i o d s o n d a ys 1 a n d 4 T h e ce l l l a ye r s w e r e h a r ve st e d o n d a ys 1 4 a n d 7 t o m e a su r e D N A co n t e n t a n d 3 H t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n B r i e f l y, t h e ce l l l a ye r s w e r e r i n se d w i t h P B S f r o z e n t h a w e d a n d t h e n so l u b i l i ze d i n a l ysi s b u f f e r su p p l e m e n t e d w i t h a D N A b i n d i n g d ye ( C yq u a n t M o l e cu l a r P r o b e s I n vi t r o g e n C a r l s b a d C A ) T h r e e a l i q u o t s f r o m e a ch w e l l w e r e u se d t o d e t e r m i n e t h e D N A co n t e n t / w e l l u si n g f l u o r i m e t r y a t 4 8 0 / 5 3 5 n m 3 H t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y p r e ci p i t a t i n g a n a l i q u o t o f t h e so l u b i l i ze d ce l l s o ve r n i g h t a t 4 C i n 1 0 % t r i ch l o r o a ce t i c a ci d u si n g B S A a s a ca r r i e r p r o t e i n T h e p r e ci p i t a t e d D N A w a s co l l e ct e d o n t o g l a ss f i b e r p r e f i l t e r s ( M i l l i p o r e C a t N o A P F C 0 2 5 0 0 ) b y va cu u m f i l t r a t i o n T h e f i l t e r s w e r e w a sh e d t h r e e t i m e s w i t h 5 m l i ce c o l d 5 % T C A p l a ce d i n t o vi a l s a n d i n c o r p o r a t i o n m e a s u r e d b y l i q u i d sci n t i l l a t i o n c o u n t i n g I m m u n o b l o t t i n g C e l l l a ye r s w e r e so l u b i l i ze d i n 2 % S D S a n d e xa m i n e d f o r A L D H l e ve l s b y S D S P A G E W e st e r n b l o t T h e m e d i u m w a s co l l e ct e d d i a l yze d a n d l yo p h i l i ze d T h e p o w d e r w a s r e c o n st i t u t e d i n 1 / 1 5 0 t h t h e vo l u m e f o r m e d i u m f r o m ke r a t o cyt e s a t l o w d e n si t y, o r i n 1 / 5 0 t h t h e vo l u m e f o r m e d i u m f r o m ke r a t o cy t e s a t h i g h d e n si t y i n w a t e r M e d i u m e q u i va l e n t t o 3 w e l l s w a s f o r ke r a t o cyt e s a t l o w d e n si t y a n d e q u i va l e n t t o h a l f a w e l l f o r ke r a t o cyt e s a t h i g h d e n si t y w e r e d i g e st e d w i t h e n d o g a l a ct o si d a se ( S e i ka g a ku A sso ci a t e s o f C a p e C o d E F a l m o u t h M A ) a n d ke r a t o ca n co r e p r o t e i n l e ve l s d e t e r m i n e d b y S D S P A G E W e st e r n b l o t T h e

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8 7 p r o t e i n s w e r e l o a d e d a n d s e p a r a t e d i n 4 1 0 % b i s t r i s g e l s ( N o ve x, I n vi t r o g e n C a r l sb a d C A ) T h e se p a r a t e d p r o t e i n s w e r e e l e ct r o t r a n sf e r r e d t o n i t r o ce l l u l o se m e m b r a n e s ( B i o R a d H e r cu l e s, C A ) a t r o o m t e m p e r a t u r e b l o ck e d w i t h 0 2 % I B l o ck a n d 0 3 % T w e e n 2 0 i n P B S ( 0 2 % I P B S T ) a n d i n cu b a t e d o ve r n i g h t a t 4 C w i t h e i t h e r 1 : 5 0 0 0 a n t i A L D H a n t i b o d y o r 1 : 1 0 0 0 r a b b i t a n t i b o vi n e ke r a t o ca n R a b b i t p o l ycl o n a l a n t i se r u m t o b o vi n e A L D H w a s a g e n e r o u s g i f t o f D r R L i n d a h l ( U n i ve r si t y o f S o u t h D a ko t a ) a n d t h e r a b b i t a n t i se r u m t o b o vi n e ke r a t o ca n w a s p r e vi o u sl y d e scr i b e d ( 1 3 9 ) M e m b r a n e s w e r e r i n se d i n 0 1 % I P B S T i n cu b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 h o u r i n 1 : 1 0 0 0 0 h o r se r a d i s h p e r o xi d a se co n j u g a t e d g o a t a n t i r a b b i t I g G ( A m e r sh a m B i o sci e n ce s, P i sca t a w a y, N J ) a n d r i n se d f o u r t i m e s w i t h 0 1 % I P B S T P r o t e i n b a n d s w e r e vi su a l i ze d u si n g ch e m i l u m i n e sce n c e ( E C L W e st e r n B l o t t i n g A n a l ysi s syst e m ; A m e r sh a m B i o sci e n ce s) o n K o d a k B i o M a x X A R X r a y f i l m F i l m s w e r e sca n n e d a n d b a n d d e n si t y w a s m e a su r e d u si n g a B i o R a d G S 7 1 0 C a l i b r a t e d I m a g i n g D e n si t o m e t e r ( B i o R a d H e r cu l e s C A ) T h e r e s u l t i n g p i xe l d e n si t y w a s d i vi d e d b y t h e D N A co n t e n t o f t h e cu l t u r e a n d e xp r e sse d i n p i xe l d e n si t y p e r g D N A C e l l M o r p h o l o g y C e l l m o r p h o l o g y w a s st u d i e d w i t h a N i ko n D i a p h o t p h a se c o n t r a s t m i c r o sco p e a n d r e c o r d e d u si n g a N i ko n D 1 0 0 d i g i t a l ca m e r a I m a g e s w e r e r e si ze d u si n g A d o b e P h o t o sh o p a n d i m a g e l e ve l s a n d co n t r a st a d j u st e d a f t e r t h e i m a g e s w e r e co n ve r t e d t o g r a ysca l e

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8 8 S t a t i s t i c a l A n a l y s i s S t a t i s t i ca l a n a l ysi s w a s p e r f o r m e d u si n g S t a t vi e w ( S A S I n st i t u t e C a r y, N C ) S a m p l e s w e r e a n a l yze d u si n g a p a i r e d t t e s t S t a n d a r d e r r o r w a s u se d w h e n n > 3 a n d st a n d a r d d e vi a t i o n u se d w h e n n = 3 R E S U L T S K e r a t o cyt e s p l a t e d a t l o w d e n si t y w e r e r a d i o l a b e l e d w i t h 3 H t h ym i d i n e f r o m d a ys 1 4 a n d d a ys 4 7 t o d e t e r m i n e t h e e f f e ct o f g r o w t h f a ct o r s o n D N A K e r a t o cyt e s c u l t u r e d i n a l l t e st e d g r o w t h f a ct o r s sh o w e d a si g n i f i ca n t i n cr e a se i n 3 H t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n d u r i n g b o t h l a b e l i n g p e r i o d s ( F i g u r e 1 ) w h e n co m p a r e d t o co n t r o l F G F 2 a n d P D G F B B h o w e ve r st i m u l a t e d si g n i f i c a n t l y m o r e i n co r p o r a t i o n d u r i n g t h e se co n d t i m e p e r i o d t h a n d u r i n g t h e f i r s t t i m e p e r i o d T h e D N A co n t e n t o f t h e cu l t u r e s w a s m e a su r e d o n d a ys 4 a n d 7 t o d e t e r m i n e i f t h e n u m b e r o f ce l l s i n t h e cu l t u r e i n cr e a se d B y d a y 7 t h e D N A co n t e n t p e r w e l l o f ce l l s cu l t u r e d i n I T S a n d i n su l i n i n cr e a se d 3 1 f o l d a n d c e l l s i n P D G F B B i n cr e a se d 2 3 f o l d w h i l e cu l t u r e i n F G F 2 r e su l t e d i n a 3 6 % i n cr e a se w h i l e t h e co n t r o l cu l t u r e s h a d a 2 0 % i n cr e a s e ( F i g u r e 2 A ) T h e D N A co n t e n t o f cu l t u r e s p l a t e d a t h i g h d e n si t y ( F i g u r e 2 B ) a l so i n cr e a se d o ve r t h e 7 d a y s t u d y p e r i o d b u t t h e m a xi m u m i n cr e a se i n D N A co n t e n t w a s 5 9 % f o r ce l l s cu l t u r e d i n i n su l i n f o l l o w e d b y I T S F G F 2 a n d P D G F B B ( 5 2 % 4 7 % a n d 2 7 % r e sp e ct i ve l y) b u t t h e D N A l e ve l s o f t h e co n t r o l cu l t u r e s d e cl i n e d b y 3 1 % T h e l o w e r g r o w t h r a t e o f t h e ce l l s p l a t e d a t h i g h d e n si t y i s l i ke l y d u e t o co n t a ct i n h i b i t i o n

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8 9 A L D H i s a 5 2 kD a cyt o p l a sm i c p r o t e i n d e t e ct e d i n W e st e r n b l o t s o f ce l l l a ye r e xt r a ct s ( F i g u r e 3 L a n e 1 ) T h e p i xe l d e n si t i e s o f t h i s p r o t e i n i n e a ch cu l t u r e co n d i t i o n w e r e d e t e r m i n e d a n d e xp r e sse d p e r g D N A o f t h e cu l t u r e s. K e r a t o cyt e s p l a t e d a t h i g h d e n si t y a n d cu l t u r e d f o r 7 d a ys co n t a i n e d 1 8 t i m e s m o r e A L D H p e r g o f D N A t h a n ke r a t o cyt e s se e d e d a t l o w d e n si t y ( F i g u r e 4 ) T h e l e ve l s o f A L D H i n ke r a t o cyt e s p l a t e d a t l o w d e n si t y a n d c u l t u r e d i n t h e p r e se n ce o f g r o w t h f a ct o r s w a s n o t si g n i f i ca n t l y d i f f e r e n t t h a n t h e l e ve l s i n t h e co n t r o l cu l t u r e s ( F i g u r e 4 A o p e n b a r s ) b u t w a s sl i g h t l y r e d u ce d a t h i g h d e n si t y ( F i g u r e 4 A f i l l e d b a r s) K e r a t o cyt e s p l a t e d a t h i g h d e n si t y a n d cu l t u r e d i n t h e p r e se n ce o f F G F 2 co n t a i n e d si g n i f i ca n t l y l o w e r A L D H l e v e l s t h a n t h e co n t r o l ke r a t o cyt e s. K e r a t o cyt e s i n cu l t u r e n o r m a l l y d o n o t a ccu m u l a t e a n e xt r a c e l l u l a r m a t r i x a sso ci a t e d w i t h t h e ce l l s b u t se cr e t e p r o t e o g l yca n s i n t o t h e m e d i u m i n s t e a d ( 8 6 9 9 ) T h e ke r a t o ca n i n t h e m e d i u m a p p e a r s i n a W e st e r n b l o t a s a sm e a r o f a r o u n d 8 0 1 6 0 kD a ( F i g u r e 3 L a n e 2 ) D i g e st i o n o f t h e m e d i u m w i t h e n d o g a l a ct o si d a se d e g r a d e s t h e ke r a t a n su l f a t e ch a i n s a n d sh i f t s t h e sm e a r t o a si n g l e b a n d a t 5 1 kD a ( F i g u r e 3 L a n e 3 ) T h e p i xe l d e n si t i e s o f t h e 5 1 kD a co r e p r o t e i n f o r e a ch cu l t u r e co n d i t i o n w e r e d e t e r m i n e d a n d e x p r e sse d p e r g o f D N A ( F i g u r e 4 B ) K e r a t o cy t e s a t l o w d e n si t y a n d cu l t u r e d i n F G F 2 i n su l i n I T S a n d P D G F B B h a d h i g h e r ( 4 8 4 a n d 2 f o l d r e sp e ct i ve l y) ke r a t o ca n l e ve l s i n t h e m e d i u m b y d a y 7 ( F i g u r e 4 B o p e n b a r s) K e r a t o cy t e s a t h i g h d e n si t y a ccu m u l a t e d 6 0 f o l d m o r e ke r a t o ca n i n t h e m e d i u m t h a n ke r a t o cyt e s p l a t e d a t l o w d e n si t y. F u r t h e r m o r e i n co n t r a st t o l o w d e n si t y cu l t u r e s, t h e g r o w t h f a ct o r s

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9 0 d i d n o t si g n i f i ca n t l y c h a n g e ke r a t o ca n l e ve l s i n t h e m e d i u m ( F i g u r e 4 B f i l l e d b a r s) T h e 3 5 S O 4 r a d i o l a b e l e d p r o t e o g l yca n s c o l l e ct e d o n d a y 4 w e r e f r a ct i o n a t e d a cc o r d i n g t o si ze o n a S u p e r o s e 6 co l u m n T h e i n co r p o r a t e d 3 5 S O 4 f r o m ke r a t o cyt e s p l a t e d a t l o w d e n si t y a n d cu l t u r e d i n F G F 2 i n su l i n I T S a n d P D G F B B e l u t e d b e t w e e n f r a ct i o n s 1 6 a n d 2 3 ( F i g u r e 5 A ) cl o se t o t h e e l u t i o n p o si t i o n s f o r ke r a t o ca n a n d d e co r i n ( f r a ct i o n s 1 7 2 1 ) a s d e t e r m i n e d b y i m m u n o d o t b l o t ( d a t a n o t sh o w n ) M o s t o f t h e i n co r p o r a t e d 3 5 S O 4 f r o m ke r a t o cyt e s cu l t u r e d a t l o w d e n si t y i n D M E M a l o n e h o w e ve r e l u t e d b e t w e e n f r a ct i o n s 2 6 a n d 3 2 T h i s i s si m i l a r t o t h e e l u t i o n p o si t i o n f o r p r o st a g l a n d i n D syn t h a se ( P G D S ) ( f r a ct i o n s 2 8 3 0 ) a s d e t e r m i n e d b y i m m u n o d o t b l o t ( n o t sh o w n ) a n d t h e e l u t i o n p o si t i o n o f c o r n e a l ke r a t a n s u l f a t e ch a i n s. P a p a i n d i g e st i o n d i d n o t a l t e r t h e e l u t i o n p o si t i o n su g g e st i n g t h a t t h e i n co r p o r a t e d 3 5 S O 4 f r o m t h e ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n D M E M / F 1 2 w e r e n o t b o u n d t o a l a r g e co r e p r o t e i n ( n o t sh o w n ) W h e n ke r a t o cyt e s w e r e p l a t e d a t h i g h d e n si t y, h o w e ve r m o st o f t h e i r 3 5 S O 4 i n co r p o r a t e d p r o d u ct s e l u t e d b e t w e e n f r a ct i o n s 1 7 a n d 2 2 ( F i g u r e 5 B ) w h e t h e r o r n o t t h e ce l l s w e r e cu l t u r e d i n g r o w t h f a ct o r s. P h a se co n t r a st m i cr o sc o p y w a s u se d t o e xa m i n e t h e m o r p h o l o g y o f t h e cu l t u r e d ce l l s p r i o r t o h a r v e st i n g o n d a y 7 ( F i g u r e 6 ) C e l l s i n D M E M / F 1 2 r e t a i n t h e ch a r a ct e r i st i c d e n d r i t i c m o r p h o l o g y o f i n si t u ke r a t o cyt e s ( P a n e l A ) C e l l s cu l t u r e d i n F G F 2 h o w e ve r a p p e a r f i b r o b l a st i c, w i t h f l a t t e n e d sp i n d l e sh a p e d ce l l b o d i e s a n d l a ck t h e d e n d r i t i c p r o c e sse s ( p a n e l B ) ch a r a ct e r i st i c o f ke r a t o cyt e s. C e l l s cu l t u r e d i n i n su l i n a n d I T S a p p e a r f l a t t e n e d b u t st i l l r e t a i n t h e i r

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9 1 d e n d r i t i c p r o ce sse s ( P a n e l C a n d D r e s p e ct i ve l y) ye t t h e d e n d r i t e s o f c e l l s cu l t u r e d i n I T S a p p e a r l o n g e r j o i n w i t h o t h e r ce l l s. C e l l s cu l t u r e d i n P D G F B B a p p e a r f i b r o b l a s t i c, h a ve f l a t ce l l b o d i e s a n d a r e sp i n d l e sh a p e d ( P a n e l E ) D I S C U S S I O N T h e r e su l t s o f t h i s st u d y sh o w t h a t a l l t h e g r o w t h f a ct o r s t e st e d st i m u l a t e d 3 H t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n a n d i n cr e a s e d t h e D N A co n t e n t o f t h e cu l t u r e s o ve r t h e 6 d a y cu l t u r e p e r i o d C o m p a r i n g t h e r e s p o n se t o e a ch o f t h e d i f f e r e n t g r o w t h f a ct o r s, h o w e ve r sh o w e d t h a t o n l y i n su l i n st i m u l a t e d t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n si m i l a r l y d u r i n g t h e f i r st 3 d a y a n d t h e se co n d 3 d a y t i m e p e r i o d F u r t h e r m o r e o n l y t h e cu l t u r e s i n i n su l i n co n si st e n t l y i n cr e a se d i n D N A co n t e n t d u r i n g t h e 6 d a y cu l t u r e p e r i o d a n d a t t a i n e d t h e h i g h e st D N A co n t e n t a t t h e e n d o f t h e 6 d a y cu l t u r e p e r i o d f o r b o t h l o w a n d h i g h i n i t i a l p l a t i n g d e n si t i e s. E ve n w i t h t h i s e xt e n si ve p r o l i f e r a t i o n o ve r t h e 6 d a y t i m e p e r i o d ke r a t o cyt e s i n i n su l i n m a i n t a i n e d A L D H co n t e n t a n d ke r a t o c a n p r o d u ct i o n t h e t w o m a r ke r s o f t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e a s w e l l a s t h e i r d e n d r i t i c m o r p h o l o g y. T h e s e r e su l t s su g g e st t h a t i n su l i n m a y b e u se f u l i n e xp a n d i n g a p o p u l a t i o n o f k e r a t o cy t e s i n cu l t u r e w i t h o u t ch a n g i n g t h e i r p h e n o t yp e K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n F G F 2 a n d P D G F B B a l so sh o w e d i n cr e a se d i n co r p o r a t i o n o f 3 H t h ym i d i n e i n ke r a t o cyt e s p l a t e d a t l o w d e n si t y. T h e r a t e o f i n co r p o r a t i o n h o w e ve r w a s si g n i f i ca n t l y h i g h e r d u r i n g t h e se co n d 3 d a y t i m e p e r i o d t h a n d u r i n g t h e f i r st t i m e p e r i o d b u t t h e D N A co n t e n t o f t h e cu l t u r e s d i d n o t i n cr e a se f r o m d a y 4 t o d a y 7 T h i s s u g g e st s t h a t i n a d d i t i o n t o i n cr e a s e d ce l l

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9 2 p r o l i f e r a t i o n F G F 2 a n d P D G F B B m a y a l so b e ca u si n g ce l l d e a t h L i ke cu l t u r e i n i n su l i n A L D H a n d k e r a t o c a n p r o d u ct i o n w e r e m a i n t a i n e d b y cu l t u r e i n F G F 2 a n d P D G F B B U n l i ke i n su l i n h o w e v e r c u l t u r e i n F G F 2 a n d P D G F B B ca u se d t h e ke r a t o cyt e s t o b e co m e sp i n d l e sh a p e d o r f i b r o b l a st i c. T h i s su g g e st s t h a t ce l l m o r p h o l o g y a n d A L D H / ke r a t o ca n p r o d u ct i o n a r e n o t l i n ke d O ve r a l l t h e se r e su l t s w o u l d su g g e st t h a t t h e l o ss o f A L D H a n d ke r a t o ca n b y ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n m e d i u m co n t a i n i n g f e t a l b o vi n e se r u m ( 8 8 9 9 1 0 0 1 8 0 ) i s d u e t o f a ct o r s o t h e r t h a n t h e i n su l i n F G F 2 a n d P D G F B B p r e se n t i n t h e s e r u m T h e r e su l t s o f t h i s st u d y a l so sh o w t h a t p l a t i n g ke r a t o cyt e s a t l o w d e n si t y a n d i n t h e a b se n c e o f g r o w t h f a ct o r s r e su l t s i n t h e d e g r a d a t i o n o f t h e p r o t e o g l yc a n s se cr e t e d i n t o t h e m e d i u m T h e i n c o r p o r a t e d 3 5 S O 4 f r o m ke r a t o cyt e s a t l o w d e n si t y a n d i n t h e a b se n c e o f g r o w t h f a ct o r s e l u t e d b e t w e e n f r a ct i o n s 2 7 a n d 3 2 cl o se o r w i t h t h e e l u t i o n p o si t i o n o f P G D S ( f r a ct i o n s 2 8 3 0 ) a 2 9 kD a p r o d u ct ( 1 3 9 ) I n co n t r a s t t h e 3 5 S O 4 i n co r p o r a t e d b y ke r a t o cyt e s cu l t u r e d w i t h g r o w t h f a ct o r s e l u t e d i n o n e m a j o r p e a k b e t w e e n f r a ct i o n s 1 7 a n d 2 1 i n t h e e l u t i o n p o si t i o n o f ke r a t o ca n ( f r a c t i o n s 1 8 2 0 ) a n d d e co r i n ( f r a ct i o n s 1 7 2 1 ) K e r a t o ca n a n d d e co r i n a r e m e m b e r s o f t h e sm a l l l e u ci n e r i ch p r o t e i n f a m i l y. T h e se p r o t e i n s co n t a i n m u l t i p l e l e u c i n e r i ch r e p e a t s w h o se i n t e r a ct i o n r e su l t s i n t h e p r o t e i n a c q u i r i n g a h o r se s h o e s h a p e d t e r t i a r y st r u ct u r e K e r a t o c a n a 5 0 kD a p r o t e i n h a s 5 N l i n k e d g l yco syl a t i o n si t e s, b u t o n l y co n t a i n s 3 ke r a t a n su l f a t e ch a i n s o f ~ 1 4 kD a ( 1 8 1 ) D e co r i n a 4 0 kD a p r o t e i n h a s o n e O l i n ke d g l yco syl a t i o n si t e t h a t co n t a i n s t h e ch o n d r o i t i n su l f a t e ch a i n ( 1 8 2 ) A t h i g h d e n si t y, m o st o f t h e 3 5 S O 4 i n co r p o r a t e d b y ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n D M E M / F 1 2

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9 3 a l o n e e l u t e d b e t w e e n f r a c t i o n s 1 6 a n d 2 1 w i t h o n l y so m e o f t h e i n co r p o r a t e d 3 5 S O 4 e l u t i n g b e t w e e n f r a ct i o n s 2 6 3 1 T h i s s u g g e st s t h a t t h e p r e se n ce o f g r o w t h f a ct o r s i n t h e m e d i u m f o r ce l l s p l a t e d a t l o w d e n s i t y o r p l a t i n g ce l l s a t h i g h d e n si t y i s n e ce ssa r y t o p r e ve n t t h e d e g r a d a t i o n o f p r o t e o g l yca n s. T h i s m a y e xp l a i n w h y t h e ke r a t o c a n si g n a l w a s l o w e r i n l o w d e n si t y co n t r o l p l a t e d ke r a t o cyt e s t h a n k e r a t o cy t e s p l a t e d a t h i g h d e n si t y. T h e co r e p r o t e i n s o f t h e p r o t e o g l yc a n s m a y b e d e g r a d e d a n d n o t d e t e ct e d b y W e st e r n b l o t b u t t h e 3 5 S O 4 i n co r p o r a t e d i n t h e r e si d u a l G A G ch a i n s i s d e t e ct a b l e T h e g r o w t h f a ct o r s m a y b e p l a yi n g a r o l e i n p r o t e ct i n g t h e s e cr e t e d p r o t e o g l yca n s f r o m p r o t e o l ysi s o r st i m u l a t i n g t h e p r o d u ct i o n o f a ce l l p r o d u c t t h a t st a b i l i ze s p r o t e o g l yca n s. T h e p r o t e o g l yc a n s p r o d u ce d b y ke r a t o cyt e s p l a t e d a t h i g h d e n si t y a r e n o t d e g r a d e d i n t h e a b s e n ce o f g r o w t h f a ct o r s. T h i s su g g e st s t h a t p l a t i n g d e n si t y m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n p r o t e o g l yca n st a b i l i t y a n d a ccu m u l a t i o n I t i s p o ssi b l e t h a t ke r a t o cyt e s se cr e t e o t h e r E C M co m p o n e n t s t h a t i n t e r a ct w i t h t h e p r o t e o g l yca n s i n t h e m e d i u m a n d t h a t a t l o w d e n si t y t h e u n st i m u l a t e d ke r a t o cyt e s d o n o t se cr e t e e n o u g h E C M c o m p o n e n t s t o p r e v e n t t h e d e g r a d a t i o n I n su l i n a ct s t h r o u g h i t s t r a n sm e m b r a n e r e ce p t o r a n d m o d u l a t e s s e ve r a l m e t a b o l i c p r o c e sse s w i t h r e sp e ct t o g l u co s e l i p i d s a n d p r o t e i n s ( 1 6 9 ) I n su l i n s i n t e r a ct i o n w i t h i t s r e ce p t o r a l so a ct i va t e s m e m b e r s o f t h e M A P K f a m i l y a n d r e su l t s i n ce l l p r o l i f e r a t i o n a s w e l l ( 1 6 9 1 7 0 ) W e h a ve sh o w n t h a t ke r a t o cyt e s w i l l p r o l i f e r a t e i n D M E M / F 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h i n su l i n o r I T S w i t h o u t t h e l o ss o f t h e d e n d r i t i c m o r p h o l o g y o r t h e ke r a t o cyt e m a r ke r s A L D H a n d ke r a t o ca n T h i s su g g e st s t h a t k e r a t o cyt e s a r e e xp r e ssi n g t h e i n su l i n r e ce p t o r i n cu l t u r e I n su l i n i s

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9 4 a l so r e q u i r e d f o r t h e m a i n t e n a n ce o f t h e a d i p o cyt e p h e n o t yp e ( 1 8 3 ) a n d t h e a d d i t i o n o f i n s u l i n t o t h e m e d i u m o f a ct i v a t e d h e p a t i c st e l l e a t e ce l l s r e s u l t s i n t h e u p r e g u l a t i o n o f p u t a t i ve a d i p o g e n i c t r a n scr i p t i o n f a ct o r s r e s u l t i n g i n t h e ce l l s r e t u r n i n g t o t h e i r q u i e sce n t p r e m yo f i b r o b l a st i c st a t e ( 1 8 4 )

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9 5 F i g u r e 1 3 H T h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n b y k e r a t o c y t e s i n c u l t u r e K e r a t o cyt e s p l a t e d a t 5 0 0 0 c e l l s/ cm 2 w e r e r a d i o l a b e l e d f o r 7 2 h o u r s st a r t i n g o n d a ys 1 a n d 4 T h e ce l l l a ye r s w e r e h a r ve s t e d t h e D N A p r e ci p i t a t e d i n 1 0 % T C A u si n g B S A a s a ca r r i e r a n d i n co r p o r a t i o n d e t e r m i n e d p e r g o f D N A L e g e n d : O p e n b a r s: t h y m i d i n e i n c o r p o r a t e d f r o m d a y 1 t o d a y 4 ; f i l l e d b a r s: t h ym i d i n e i n co r p o r a t e d f r o m d a y 4 t o d a y 7

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9 6 F i g u r e 2 M e a s u r e m e n t o f D N A c o n t e n t o f k e r a t o c y t e c u l t u r e s C e l l l a ye r s o f ke r a t o cyt e s p l a t e d a t l o w ( 5 0 0 0 ce l l s/ cm 2 ) ( A ) a n d h i g h ( 2 0 0 0 0 ce l l s/ c m 2 ) ( B ) w e r e h a r ve st e d o n d a y 1 p r i o r t o g r o w t h f a c t o r t r e a t m e n t a n d t h e n a t 7 2 h o u r t i m e i n t e r v a l s a f t e r t h e g r o w t h f a ct o r s w e r e a d d e d o ve r t h e 6 d a y st u d y p e r i o d

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9 7 F i g u r e 3 R e p r e s e n t a t i v e W e s t e r n b l o t s o f k e r a t o c y t e s f o r A L D H a n d m e d i u m f o r k e r a t o c a n A l l sa m p l e s o b t a i n e d f r o m c o n t r o l c u l t u r e s a t h i g h d e n si t y. L a n e 1 cyt o so l i c A L D H i s d e t e ct e d a s a 5 3 kD a b a n d L a n e 2 ke r a t o ca n i n t h e m e d i u m i s d e t e ct e d b y t h e a n t i b o d y a s a s m e a r o f 8 0 1 6 0 kD a si ze L a n e 3 t h e m e d i u m i s d i g e st e d w i t h e n d o g a l a ct o si d a se a n d t h e c o r e p r o t e i n o f ke r a t o ca n i s d e t e ct e d a s a b a n d a t 5 1 kD a

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9 8 F i g u r e 4 P i x e l d e n s i t i e s o f A L D H c o n t e n t o f t h e c e l l l a y e r s ( A ) a n d k e r a t o c a n i n t h e m e d i u m ( B ) T h e W e s t e r n b l o t s u si n g a n t i b o d i e s a g a i n st A L D H ( A ) w e r e sca n n e d a n d t h e p i xe l d e n si t y o f e a ch b a n d d e t e r m i n e d T h e p i xe l d e n si t y va l u e w a s d i vi d e d b y t h e g o f D N A i n t h e cu l t u r e K e r a t o cy t e s p l a t e d a t l o w ( o p e n b a r s ) a n d h i g h ( f i l l e d b a r s) d e n si t y a n d cu l t u r e d f o r 7 d a ys ( B ) C e l l m e d i u m f o r ke r a t o cyt e s a t l o w a n d h i g h d e n si t y w e r e co l l e ct e d co n ce n t r a t e d 1 5 0 o r 5 0 f o l d ( l o w a n d h i g h d e n si t y, r e sp e ct i ve l y) t h e m e d i u m e q u i va l e n t t o 3 w e l l s ( l o w d e n si t y) o r h a l f a w e l l ( h i g h d e n si t y ) d i g e s t e d w i t h e n d o b g a l a ct o si d a se se p a r a t e d b y S D S P a g e a n d b l o t t e d a g a i n st ke r a t o ca n co r e p r o t e i n T h e b a n d s w e r e sca n n e d a n d t h e i r p i xe l d e n si t y d e t e r m i n e d T h e m e a su r e d p i xe l d e n si t y w a s t h e n d i vi d e d b y t h e D N A co n t e n t o f e a ch cu l t u r e A t l o w d e n si t y ( o p e n b a r s) i n su l i n I T S a n d P D G F B B st i m u l a t e ke r a t o ca n se cr e t i o n w h i l e a t h i g h d e n si t y ( f i l l e d b a r s ) ke r a t o ca n a ccu m u l a t e d i n t h e m e d i u m o f a l l cu l t u r e co n d i t i o n s. B a r r e p r e se n t s m e a n o f 3 d e t e r m i n a t i o n s p l u s S D ( f o r b o t h A a n d B )

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9 9 F i g u r e 4

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1 0 0 F i g u r e 5 S u p e r o s e 6 g e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f a c c u m u l a t e d p r o t e o g l y c a n s E l u t i o n p r o f i l e s o f i n c o r p o r a t e d 3 5 S O 4 i n t h e m e d i a a t d a y 4 o f l o w ( A ) a n d h i g h d e n si t y ( B ) ke r a t o cyt e cu l t u r e s. T h e e l u t i o n p o si t i o n s o f d e co r i n ( o p e n b a r ) ke r a t o ca n ( b l a ck b a r ) a n d P D G S a r e i n d i ca t e d T h e e l u t i o n p o si t i o n s w e r e d e t e r m i n e d b y i m m u n o d o t b l o t s ( d a t a n o t sh o w n )

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1 0 1 F i g u r e 6 M o r p h o l o g y o f k e r a t o c y t e s i n c u l t u r e K e r a t o cyt e s p l a t e d a t l o w d e n si t y w e r e p h o t o g r a p h e d a f t e r 7 d a ys i n cu l t u r e T h e m e d i u m w a s r e p l a c e d e ve r y 7 2 h o u r s. C o n t r o l ( A ) F G F 2 ( B ) i n su l i n ( C ) I T S ( D ) a n d P D G F B B ( E ) T h e co n t r o l ce l l s, a s w e l l a s ce l l s i n i n su l i n o r i n t h e i n su l i n c o n t a i n i n g m e d i u m I T S m a i n t a i n a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y, w h i l e ce l l s i n F G F 2 a n d P D G F B B a p p e a r f i b r o b l a st i c.

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1 0 2 P A P E R 3 : S T I M U L A T I O N O F C O L L A G E N S Y N T H E S I S B Y I N S U L I N A N D P R O T E O G L Y C A N A C C U M U L A T I O N B Y A S C O R B A T E I N B O V I N E K E R A T C Y T E S I N V I T R O K u r t M u s s e l m a n n B r a d l e y K a n e B r i d g e t t e A l e x a n d r o u a n d J o h n R H a s s e l l F r o m t h e D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r M e d i c i n e C o l l e g e o f M e d i c i n e U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a 1 2 9 0 1 B r u c e B D o w n s B o u l e v a r d M D C B o x 7 T a m p a F l o r i d a 3 3 6 1 2 A d d r e ss co r r e sp o n d e n ce t o Jo h n R H a sse l l T a m p a F L 3 3 6 1 2 T e l 8 1 3 9 7 4 7 8 8 1 E m a i l : j h a sse l l @ h e a l t h u sf e d u T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y a g r a n t f r o m t h e N a t i o n a l I n st i t u t e o f H e a l t h E Y 0 8 1 0 4 ( t o J. R H ) A C C E P T E D F O R P U B L I C A T I O N O N A U G U S T 1 1 T H 2 0 0 6

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1 0 3 S U M M A R Y P u r p o se : A sco r b a t e i s r e q u i r e d f o r t h e h y d r o x yl a t i o n o f co l l a g e n t h a t i s p r e s e n t i n t h e co r n e a l st r o m a T h e ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n s ( K S P G s) l u m i ca n a n d ke r a t o ca n a r e a l so p r e se n t a n d t h e y i n t e r a ct w i t h co l l a g e n a n d m o d u l a t e i t s a sse m b l y i n t o f i b r i l s. I n t h i s st u d y, a sco r b a t e w a s a d d e d t o a d e f i n e d m e d i u m co n t a i n i n g i n su l i n a n d i t s e f f e ct s o n t h e sy n t h e si s o f co l l a g e n a n d K S P G s b y ke r a t o cyt e s w a s d e t e r m i n e d M e t h o d s: C o l l a g e n a s e i so l a t e d ke r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d w i t h o r w i t h o u t i n su l i n w i t h o r w i t h o u t a sco r b a t e C o l l a g e n a n d g l yco sa m i n o g l yca n sy n t h e si s w e r e d e t e r m i n e d b y co l l a g e n a se d i g e st i o n o f i n co r p o r a t e d 3 H g l yci n e a n d b y ch o n d r o i t i n a se A B C o r e n d o g a l a c t o si d a se d i g e st i o n o f i n co r p o r a t e d 3 5 S O 4 K S P G s w e r e d e t e ct e d b y W e st e r n b l o t C o l l a g e n st a b i l i t y w a s d e t e r m i n e d b y p e p si n d i g e st i o n E t h yl 3 4 d i h y d r o xyb e n zo a t e ( E D B ) w a s u se d t o i n h i b i t co l l a g e n h yd r o xyl a t i o n R e su l t s: I n su l i n st i m u l a t e d t h e syn t h e si s o f co l l a g e n b u t d i d n o t a f f e ct t h e a ccu m u l a t i o n o f l u m i ca n a n d k e r a t o ca n I n su l i n p l u s a sco r b a t e h o w e ve r st i m u l a t e d t h e syn t h e si s o f co l l a g e n a n d i n cr e a se d t h e a ccu m u l a t i o n o f t h e se p r o t e o g l yc a n s. T h e a ccu m u l a t i o n o f P G D S a K S P G t h a t d o e s n o t i n t e r a ct w i t h co l l a g e n w a s n o t a f f e c t e d b y a sco r b a t e O n l y t h e co l l a g e n m a d e i n t h e p r e se n ce o f a sco r b a t e w a s p e p si n r e si st a n t E D B o ve r r o d e t h e e f f e ct s o f a sco r b a t e o n p e p si n r e si st a n ce a n d p r o t e o g l y ca n a ccu m u l a t i o n D i scu ssi o n : T h e r e su l t s o f t h i s st u d y i n d i ca t e t h a t t h e a ccu m u l a t i o n o f l u m i ca n a n d ke r a t o ca n d e p e n d s i n p a r t u p o n t h e l e ve l o f co l l a g e n syn t h e si s a n d i t s

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1 0 4 h yd r o xyl a t i o n T h e i n t e r a ct i o n o f l u m i ca n a n d k e r a t o ca n w i t h t h e s t a b l y f o l d e d t r i p l e h e l i x p r o vi d e d b y h yd r o xyl a t i o n m a y a l so se r ve t o st a b i l i ze t h e s e p r o t e o g l yc a n s. I N T R O D U C T I O N T h e co r n e a l st r o m a c o n t a i n s k e r a t o cyt e s i m b e d d e d i n a n e xt r a c e l l u l a r m a t r i x co n si st i n g p r i m a r i l y o f c o l l a g e n t y p e s I a n d V a n d o f p r o t e o g l yca n s t h a t co n t a i n e i t h e r ch o n d r o i t i n su l f a t e ( C S ) o r k e r a t a n su l f a t e ( K S ) ch a i n s. E l e ct r o n m i cr o sco p i c st u d i e s sh o w t h e co r n e a l st r o m a co n t a i n s co l l a g e n f i b r i l s o f sm a l l u n i f o r m d i a m e t e r t h a t a r e se p a r a t e d b y sm a l l u n i f o r m l y si ze d sp a ce s. T h e co l l a g e n f i b r i l s i n t h e co r n e a l st r o m a a r e h e t e r o f i b r i l s o f co l l a g e n t yp e s I a n d V ( 3 3 ) C o l l a g e n t yp e V i s e ss e n t i a l f o r t h e i n i t i a t i o n o f f i b r i l f o r m a t i o n ( 3 7 ) a n d t h e p r e se n ce o f co l l a g e n V i n t h e h e t e r o f i b r i l h a s b e e n sh o w n t o l i m i t t h e f i b r i l d i a m e t e r g r o w t h ( 3 4 ) T h e p r o t e o g l yca n s a r e i n t h e sp a ce s b e t w e e n t h e f i b r i l s i n vi vo ( 2 5 ) a n d i n vi t r o a ssa ys t h a t m e a s u r e c o l l a g e n f i b r i l a sse m b l y h a ve sh o w n t h a t t h e s e p r o t e o g l yc a n s m o d u l a t e co l l a g e n f i b r i l f o r m a t i o n ( 1 8 5 1 8 6 ) C o l l a g e n f i b r i l f o r m a t i o n i n t h e p r e se n ce o f C S a n d K S p r o t e o g l yca n s p u r i f i e d f r o m t h e co r n e a d e l a ye d f i b r i l f o r m a t i o n d e cr e a s e d t h e r a t e o f f i b r i l g r o w t h a n d r e su l t e d i n sm a l l e r co l l a g e n f i b r i l s ( 4 4 ) T h e r e m o va l o f t h e G A G si d e ch a i n s d i d n o t a f f e ct t h e a ct i vi t y o f t h e p r o t e o g l yc a n s, b u t r e d u ct i o n a n d a l kyl a t i o n a b o l i sh e d t h e a ct i vi t y. T h i s i n d i ca t e s t h a t t h e co r e p r o t e i n o f t h e se p r o t e o g l yca n s m o d u l a t e s co l l a g e n a sse m b l y i n t o f i b r i l s ( 4 4 1 8 0 ) T h e m a j o r p r o t e o g l yca n s o f t h e co r n e a l st r o m a a r e d e co r i n ( 1 8 7 ) l u m i ca n ( 1 8 8 1 8 9 ) a n d k e r a t o c a n ( 4 1 ) D e co r i n i s a C S

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1 0 5 p r o t e o g l yc a n w h e r e a s ke r a t o ca n a n d l u m i ca n a r e K S p r o t e o g l yca n s. K e r a t o ca n ( 5 2 1 5 7 ) a n d l u m i ca n ( 5 1 5 5 1 5 6 ) n u l l m i c e h a ve t h i n n e r co r n e a s, a n d t h e co l l a g e n f i b r i l s i n t h e st r o m a s a r e l a r g e r a n d l e ss o r g a n i ze d t h a n i n t h e st r o m a s o f n o r m a l m i ce co n f i r m i n g t h e i n vi t r o t u r b i d i m e t r y a n a l y si s o f co l l a g e n f i b r i l a sse m b l y. T a ke n t o g e t h e r t h e s e f i n d i n g s i n d i ca t e t h a t co l l a g e n t yp e I a sse m b l y i n t o f i b r i l s i s m o d u l a t e d b y b o t h co l l a g e n t yp e V a n d t h e ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yc a n s i n t h e st r o m a T h r e e p r o co l l a g e n p o l yp e p t i d e s co m e t o g e t h e r t o f o r m a l e f t h a n d e d t r i p l e h e l i x i m m e d i a t e l y a f t e r syn t h e si s ( 1 9 0 1 9 1 ) S t a b l e t r i p l e h e l i x f o r m a t i o n h o w e ve r ca n o n l y o ccu r i f ce r t a i n l ysi n e a n d p r o l i n e r e si d u e s i n t h e co l l a g e n m o l e cu l e a r e h yd r o xyl a t e d ( 1 9 2 ) T h i s p o st t r a n sl a t i o n a l h y d r o xyl a t i o n i s p e r f o r m e d b y e i t h e r l ysyl o r p r o l yl h y d r o xyl a se s ( 1 9 3 ) T h e se e n z ym e s a r e f o u n d i n t h e l u m e n o f t h e e n d o p l a sm i c r e t i cu l u m ( 1 9 1 ) a n d r e q u i r e a sco r b i c a ci d a s a co f a ct o r ( 1 9 4 ) A sco r b a t e d e f i ci e n cy i n ce l l cu l t u r e d o e s n o t a f f e ct co l l a g e n syn t h e si s b u t a f f e c t s f i b r i l f o r m a t i o n a n d t h e r a t e o f co l l a g e n se cr e t i o n ( 1 9 5 1 9 7 ) T h e u n h yd r o xyl a t e d co l l a g e n m o l e cu l e s d e n a t u r e a t a l o w e r t e m p e r a t u r e a n d i n l e ss st r i n g e n t e n vi r o n m e n t s t h a n p r o p e r l y h y d r o xyl a t e d co l l a g e n f i b r i l s ( 1 9 8 ) S yst e m i c a sco r b a t e d e f i ci e n cy l e a d s t o sc u r vy, a n d t h i s d e f i ci e n cy a f f e c t s w o u n d h e a l i n g S co r b u t i c w o u n d s a r e w e a ke r ( 1 9 9 ) t h a n n o n sco r b u t i c w o u n d s, p r o n e t o r e o p e n a n d co n t a i n a m a ss o f i r r e g u l a r u n o r g a n i ze d co l l a g e n f i b r i l s ( 2 0 0 ) T h e co r n e a a n d a n t e r i o r se g m e n t o f t h e e ye c o n t a i n h i g h l e ve l s o f a sc o r b a t e ( 2 0 1 ) w h e r e i t i s t h o u g h t t o f u n ct i o n a s a n a n t i o xi d a n t a n d p r o t e ct t h e c o r n e a f r o m r e a ct i ve o xyg e n sp e ci e s t h a t r e su l t f r o m U V i r r a d i a t i o n ( 2 0 2 2 0 3 ) T h e l e v e l s o f

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1 0 6 a sco r b a t e i n t h e a q u e o u s h u m o r a n d t h e c o r n e a d r o p f o l l o w i n g a n a l ka l i b u r n ( 2 0 4 ) r e su l t i n g i n t h e c o r n e a b e co m i n g sco r b u t i c. T h e ce l l s i n t h e s t r o m a sh o w ch a r a ct e r i st i cs o f sco r b u t i c t i ssu e su ch a s a s p a r se E R su g g e st i n g t h a t t h e y a r e n o t ve r y m e t a b o l i ca l l y a ct i ve ( 2 0 5 ) T o p i ca l a sco r b a t e h a s b e e n u se d s u cce ssf u l l y t o t r e a t c o r n e a l a l ka l i b u r n s a n d h a s b e e n p r o p o se d t o d o so b y i n cr e a si n g t h e syn t h e si s a n d s e cr e t i o n o f p r o p e r l y f o l d e d c o l l a g e n t o r e p l a ce t h e co l l a g e n d e n a t u r e d b y t h e b u r n ( 2 0 6 ) I n a d d i t i o n t o p i ca l a sco r b a t e h a s a l s o b e e n u se d p o st p h o t o r e f r a ct i ve ke r a t e ct o m y ( P R K ) w h e r e i t s u se d e c r e a se d t h e l a t e o n se t co r n e a l h a ze ( 2 0 7 ) A sco r b a t e co n ce n t r a t i o n i s h i g h e st i n t h e e p i t h e l i u m t h e l a ye r t h a t i s r e m o ve d p r i o r t o P R K W h i l e t h e e xa c t r e a so n f o r t h e l a t e o n se t co r n e a l h a ze i s n o t k n o w n i t i s p o ssi b l e t h a t r e m o va l o f p a r t o f t h e e p i t h e l i u m p r i o r t o P R K r e su l t s i n a d r o p i n a sco r b a t e l e ve l s i n t h e a n t e r i o r co r n e a l st r o m a a n d w e w o u l d f u r t h e r sp e cu l a t e t h a t t h i s d r o p m a y r e d u c e t h e se cr e t i o n o f p r o p e r l y f o l d e d co l l a g e n w h i ch co u l d r e s u l t i n t h e h a ze A sco r b i c a ci d h a s b e e n u s e d t o st u d y co l l a g e n syn t h e si s i n cu l t u r e ( 1 9 3 ) b u t i t i s e a si l y o xi d i ze d i n so l u t i o n a n d i t s m e t a b o l i c b y p r o d u ct s a r e cyt o t o xi c i n e xt e n d e d c e l l cu l t u r e ( 2 0 8 ) A st a b l e n o n t o xi c p h o sp h a t e d e r i v a t i ve o f a sc o r b i c a ci d ( 2 p h o sp h o L a sco r b i c a ci d ) w a s d e ve l o p e d ( 2 0 9 ) a n d h a s b e e n sh o w n t o st i m u l a t e co l l a g e n a ccu m u l a t i o n b y ski n f i b r o b l a st s i n cu l t u r e a n d a l s o t o e n h a n ce t h e se cr e t i o n o f t y p e I a n d t yp e I I I co l l a g e n p e p t i d e s b y r a b b i t ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n m e d i u m c o n t a i n i n g f e t a l b o vi n e se r u m ( 2 1 0 ) S e r u m h o w e ve r co n t a i n s m i t o g e n s a n d m o r p h o g e n s t h a t ca u se ke r a t o c yt e s i n cu l t u r e t o p r o l i f e r a t e a cq u i r e a f i b r o b l a st i c m o r p h o l o g y a n d ce a s e ke r a t o ca n e xp r e ssi o n ( 8 6 9 9 1 6 3 ) A

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1 0 7 ch e m i ca l l y d e f i n e d m e d i u m co n t a i n i n g i n s u l i n h a s b e e n p r e vi o u sl y s h o w n t o st i m u l a t e ke r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n w h i l e m a i n t a i n i n g t h e i r d e n d r i t i c m o r p h o l o g y a s w e l l a s ke r a t o c a n e xp r e ssi o n ( 2 1 1 ) I n t h i s st u d y, ke r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n t h i s d e f i n e d m e d i u m c o n t a i n i n g 2 p h o sp h o L a sc o r b i c a ci d t o d e t e r m i n e i t s e f f e ct s o n t h e syn t h e si s a n d a ccu m u l a t i o n o f co l l a g e n a n d K S p r o t e o g l yca n s M A T E R I A L S A N D M E T H O D S C h e m i c a l s C h e m i ca l s w e r e p u r ch a se d f r o m S i g m a ( S t L o u i s, M O ) u n l e s s o t h e r w i se i n d i ca t e d I so t o p e s w e r e o b t a i n e d f r o m P e r ki n E l m e r ( B o st o n M A ) I n vi t r o g e n ( C a r l sb a d C A ) g e l s, r e a g e n t s a n d e q u i p m e n t w e r e u se d t o se p a r a t e p r o t e i n s a n d f o r t r a n sf e r o n t o n i t r o ce l l u l o se C e l l C u l t u r e K e r a t o cyt e s w e r e i so l a t e d f r o m a d u l t b o vi n e c o r n e a s u si n g t w o se q u e n t i a l co l l a g e n a se d i g e st i o n s a s p r e vi o u sl y d e scr i b e d ( 1 3 9 ) C e l l s w e r e p l a t e d i n D M E M / F 1 2 a t h i g h d e n si t y ( 2 0 0 0 0 ce l l s/ cm 2 ) i n 6 w e l l p l a t e s ( C o st a r C a m b r i d g e M A ) a n d a l l o w e d t o a t t a c h o ve r n i g h t a t 3 7 C i n 5 % C O 2 T h e m e d i u m w a s c h a n g e d t h e n e xt d a y ( d a y 1 ) a n d o n d a ys 4 7 a n d 1 0 t o f r e s h D M E M o r D M E M s u p p l e m e n t e d w i t h i n su l i n ( 1 0 g / m l ) w i t h o r w i t h o u t 1 m M 2 p h o sp h o L a sco r b i c a ci d ( a sco r b a t e ) E t h yl 3 4 d i h yd r o xyb e n zo a t e ( E D B ) w a s a d d e d a t 0 0 8 m M a n d 0 4 m M f i n a l c o n ce n t r a t i o n o n d a y 1

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1 0 8 D N A q u a n t i t a t i o n C e l l l a ye r s w e r e h a r ve st e d o n d a ys 1 4 7 a n d 1 0 t o m e a su r e D N A co n t e n t u si n g C yq u a n t ( I n vi t r o g e n C a r l sb a d C A ) B r i e f l y, t h e ce l l l a ye r s w e r e r i n se d w i t h P B S f r o ze n t h a w e d a n d so l u b i l i ze d i n a l ysi s b u f f e r su p p l e m e n t e d w i t h a D N A b i n d i n g d ye T h e D N A co n t e n t w a s d e t e r m i n e d a t 4 8 0 / 5 3 5 n m b y m e a su r i n g 4 w e l l s i n t r i p l i ca t e a n d c o m p a r i n g t h e va l u e s t o a ca l f t h y m u s D N A st a n d a r d T h e D N A co n t e n t o f p a r a l l e l cu l t u r e s w a s m e a su r e d f o r e xp e r i m e n t s t h a t u t i l i ze d t h e ce l l l a ye r C e l l p r o l i f e r a t i o n C u l t u r e s w e r e r a d i o l a b e l e d w i t h 2 0 C i 3 H t h ym i d i n e / m l o f m e d i u m f o r 7 2 h b e g i n n i n g o n d a ys 1 a n d 4 T h e l a b e l e d m e d i u m w a s r e m o ve d u p o n h a r ve st i n g a n d t h e ce l l l a ye r s w a sh e d w i t h co l d P B S T h e ce l l l a ye r s w e r e p r o c e sse d a s d e s cr i b e d u n d e r D N A q u a n t i t a t i o n I n co r p o r a t i o n i n t o D N A w a s d e t e r m i n e d a s p r e vi o u sl y d e sc r i b e d ( 1 3 9 ) C o l l a g e n s y n t h e s i s T h e i n co r p o r a t i o n o f 3 H g l yci n e i n t o co l l a g e n w a s d e t e r m i n e d a s p r e vi o u sl y d e scr i b e d ( 2 1 2 2 1 4 ) I n su m m a r y, cu l t u r e s w e r e i n cu b a t e d f o r 7 2 h i n m e d i u m co n t a i n i n g 2 5 C i 3 H g l yci n e / m l b e g i n n i n g o n d a y 1 M e d i a w a s a d j u st e d t o 4 M g u a n i d i n e H C l a n d t h e ce l l l a ye r s e xt r a ct e d i n 4 M g u a n i d i n e H C l U n i n co r p o r a t e d i so t o p e i n m e d i a a n d ce l l l a ye r s w a s r e m o ve d b y ch r o m a t o g r a p h y o n P D 1 0 co l u m n s e q u i l i b r a t e d a n d e l u t e d w i t h 4 M g u a n i d i n e H C l ( G E H e a l t h ca r e

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1 0 9 P i sca t a w a y, N J ) F r a ct i o n s co n t a i n i n g i n co r p o r a t e d r a d i o a ct i vi t y w e r e p o o l e d d i a l yze d a g a i n s t w a t e r a n d 4 0 0 l a l i q u o t s i n cu b a t e d w i t h o r w i t h o u t 2 5 U n i t s co l l a g e n a se f o r m I I I ( A d va n ce d B i o f a ct u r e s, L yn b r o o k, N Y ) i n co l l a g e n a se d i g e st i o n m e d i u m ( 3 m M N e t h yl m a l e i m i d e 5 0 m M T r i s p H 7 5 1 5 0 m M N a C l a n d 5 m M C a C l 2 ) f o r 3 h o u r s a t 3 7 C U n d i g e st e d p r o t e i n s w e r e p r e ci p i t a t e d w i t h ca r r i e r B S A u si n g c o l d 1 0 % T C A co n t a i n i n g 0 5 % t a n n i c a ci d a n d r e l e a se d i n co r p o r a t e d co u n t s m e a su r e d b y l i q u i d sci n t i l l a t i o n T h e D N A co n t e n t w a s d e t e r m i n e d a s d e scr i b e d a b o ve C o l l a g e n h e l i x s t a b i l i t y M e d i u m f r o m ce l l s w a s a d j u st e d t o 0 5 M a c e t i c a ci d a n d co n ce n t r a t e d 8 f o l d u si n g A m i co n U l t r a sp i n co n ce n t r a t o r s M W C O 1 0 0 0 0 ( M i l l i p o r e C o r p B e d f o r d M A ) 5 0 l o f a 4 m g / m l p e p si n so l u t i o n ( i n 0 5 M a ce t i c a ci d ) p e r 3 m l w a s a d d e d a n d t h e sa m p l e s r o cke d o v e r n i g h t a t 4 C E a ch sa m p l e r e ce i ve d a se co n d 5 0 l a l i q u o t f r o m t h e p e p si n st o ck, a n d d i g e st i o n w a s a l l o w e d t o co n t i n u e f o r a n a d d i t i o n a l si x h o u r s a t 4 C T h e sa m p l e s w e r e t i t r a t e d w i t h 1 N N a O H t o p H 8 0 t o i n a ct i va t e t h e e n zym e d i a l yze d a g a i n st w a t e r o ve r n i g h t l yo p h i l i ze d r e co n st i t u t e d i n 1 X S D S r u n n i n g b u f f e r a n d s e p a r a t e d o n 1 0 % b i s t r i s g e l s u n d e r r e d u ci n g co n d i t i o n s. T h e g e l s w e r e st a i n e d w i t h S a f e st a i n f o l l o w i n g t h e m a n u f a ct u r e r s p r o t o co l

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1 1 0 P r o t e o g l y c a n s y n t h e s i s C u l t u r e s w e r e l a b e l e d w i t h 5 0 C i / m l o f 3 5 S O 4 f o r 7 2 h o u r s o n d a y 1 T h e m e d i u m w a s co l l e ct e d f r o ze n l yo p h i l i ze d a n d r e co n st i t u t e d i n 4 M g u a n i d i n e H C l U n i n co r p o r a t e d i so t o p e w a s r e m o ve d u si n g P D 1 0 co l u m n s. F r a ct i o n s co n t a i n i n g i n co r p o r a t e d 3 5 S O 4 w e r e co m b i n e d a n d co n ce n t r a t e d u si n g A m i c o n U l t r a sp i n co n ce n t r a t o r s. I n c o r p o r a t i o n i n t o C S a n d K S w a s d e t e r m i n e d b y d i g e st i o n w i t h ch o n d r o i t i n a se A B C o r e n d o g a l a ct o si d a s e ( S e i ka g a ku A sso ci a t e s o f C a p e C o d E F a l m o u t h M A ) a s p r e vi o u sl y d e s cr i b e d ( 2 1 1 ) A l i q u o t s co n t a i n i n g e q u i va l e n t i n co r p o r a t e d r a d i o a ct i vi t y w e r e f r a ct i o n a t e d u si n g a S u p e r o se 6 1 2 / 3 0 H R co l u m n ( G E H e a l t h ca r e P i sca t a w a y, N J ) e q u i l i b r a t e d a n d e l u t e d w i t h 4 M g u a n i d i n e H C l ( 0 0 5 N a A c, p H 6 5 ) a t 0 3 m l / m i n F r a ct i o n s ( 0 6 m l ) w e r e co l l e ct e d a n d i n co r p o r a t i o n m e a su r e d b y l i q u i d sci n t i l l a t i o n c o u n t i n g T h e l e v e l s o f C S a n d K S i n e a ch f r a ct i o n w e r e d e t e r m i n e d a s d e scr i b e d a b o ve W e s t e r n b l o t a n a l y s i s C o r e p r o t e i n a n d p r o t e i n l e ve l s i n t h e m e d i a w e r e m e a su r e d b y W e st e r n b l o t a s p r e vi o u sl y d e scr i b e d ( 2 1 1 ) I n b r i e f t h e cu l t u r e m e d i a w a s co l l e ct e d f r o m e a c h cu l t u r e co n d i t i o n c o n ce n t r a t e d b y sp i n f i l t r a t i o n t o o n e t e n t h o r o n e f i f t i e t h o f t h e o r i g i n a l vo l u m e T h e si ze o f t h e a l i q u o t n e e d e d f r o m e a ch s a m p l e t o p r o vi d e a si m i l a r si g n a l o n f i l m b y W e st e r n b l o t w a s e m p i r i ca l l y d e t e r m i n e d T h e m e a s u r e d p i xe l d e n si t y w a s t h e n d i vi d e d b y t h e D N A co n t e n t o f t h e cu l t u r e e q u i va l e n t t o t h e a m o u n t l o a d e d a n d e xp r e sse d a s p i x e l d e n si t y p e r g D N A B l o t s w e r e p r o b e d w i t h p o l ycl o n a l a n t i b o d i e s t o b o vi n e ke r a t o c a n o r l u m i ca n ( d i l u t e d 1 : 1 0 0 0 ) o r

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1 1 1 p r o st a g l a n d i n D sy n t h a se ( P G D S ) ( 1 : 2 0 0 0 0 ) T h e l u m i ca n a n d k e r a t o c a n a n t i b o d i e s a r e p e p t i d e a n t i b o d i e s r a i se d a g a i n st t h e co r e p r o t e i n ( 1 0 0 ) T h e r a b b i t a n t i se r u m t o b o vi n e P G D S w a s a g e n e r o u s g i f t o f G a r y J. K i l l i a n ( P e n n S t a t e U n i ve r si t y ) M e m b r a n e s w e r e r i n se d a n d i n cu b a t e d f o r 1 h o u r i n 1 : 1 0 0 0 0 h o r se r a d i sh p e r o xi d a s e ( H R P ) c o n j u g a t e d se co n d a r y I g G ( G E H e a l t h ca r e P i sca t a w a y, N J ) P r o t e i n b a n d s w e r e vi su a l i ze d u si n g E C L ( G E H e a l t h c a r e P i sca t a w a y, N J) o n K o d a k B i o M a x X A R X r a y f i l m B a n d d e n si t y w a s m e a su r e d u si n g a B i o R a d G S 7 1 0 C a l i b r a t e d I m a g i n g D e n si t o m e t e r ( B i o R a d H e r cu l e s, C A ) S t a t i s t i c a l A n a l y s i s S t a t i st i ca l a n a l ysi s w a s p e r f o r m e d u si n g S t a t vi e w ( S A S I n st i t u t e C a r y, N C ) S a m p l e s w e r e a n a l yze d u si n g a p a i r e d t t e s t S t a n d a r d e r r o r w a s u se d w h e n n > 3 a n d st a n d a r d d e vi a t i o n u se d w h e n n = 3 R E S U L T S T h e D N A co n t e n t o f t h e ke r a t o cyt e cu l t u r e s w a s m e a su r e d o ve r a 1 0 d a y cu l t u r e p e r i o d t o d e t e r m i n e i f a sco r b a t e st i m u l a t e d ce l l a ccu m u l a t i o n T h e ce l l s cu l t u r e d i n D M E M / F 1 2 o r D M E M / F 1 2 m e d i u m su p p l e m e n t e d w i t h a sco r b a t e d i d n o t i n cr e a se i n n u m b e r b u t ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h i n su l i n i n cr e a s e d i n n u m b e r o v e r t h e 1 0 d a y cu l t u r e p e r i o d ( F i g u r e 1 ) C e l l s cu l t u r e d i n i n su l i n p l u s a sco r b a t e sh o w a m o d e r a t e l y h i g h e r i n i t i a l a ccu m u l a t i o n r a t e t h a n ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n i n su l i n i n t h e a b se n ce o f a sco r b a t e a n d

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1 1 2 a ch i e ve d t h e sa m e d e n si t y o n d a y 7 a s ce l l s i n i n su l i n d i d o n d a y 1 0 T h e i n co r p o r a t i o n o f 3 H t h ym i d i n e i n t o D N A o n d a ys 1 4 a n d 4 7 r e f l e ct e d t h e ce l l a ccu m u l a t i o n r a t e s se e n f o r a l l 4 c u l t u r e c o n d i t i o n s ( d a t a n o t sh o w n ) T h e syn t h e si s o f co l l a g e n a n d p r o t e o g l yca n s w a s m e a su r e d o v e r 7 2 h b e g i n n i n g o n d a y 1 a n d e n d i n g o n d a y 4 a t i m e p e r i o d d u r i n g w h i ch t h e ce l l n u m b e r w a s r a p i d l y i n c r e a si n g i n t h e cu l t u r e s r e ce i vi n g i n su l i n 3 H g l yci n e i n co r p o r a t i o n i n t o co l l a g e n w a s d e t e r m i n e d b y se n si t i vi t y t o co l l a g e n a s e d i g e st i o n ( F i g u r e 2 ) C o m p a r e d t o co n t r o l k e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n a sco r b a t e syn t h e si ze d 4 0 % l e ss co l l a g e n ( p < 0 0 5 ) a n d t h i s d e cr e a se w a s i n t h e co l l a g e n a sso ci a t e d w i t h t h e ce l l l a ye r K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n i n su l i n syn t h e si ze d 4 f o l d m o r e co l l a g e n ( p < 0 0 1 ) w i t h i n cr e a s e s o f 5 f o l d i n t h e ce l l l a y e r ( p < 0 0 2 ) a n d 3 f o l d i n t h e m e d i u m ( p < 0 0 3 ) C e l l s cu l t u r e d i n b o t h i n su l i n a n d a sco r b a t e syn t h e si ze d 7 f o l d ( p = 0 0 0 0 4 ) m o r e co l l a g e n co m p a r e d t o co n t r o l s; a v a l u e 5 0 % g r e a t e r t h a n i n su l i n a l o n e ( p = 0 0 0 6 ) C o m p a r e d t o ke r a t o cy t e s cu l t u r e d i n i n su l i n a l o n e t h e m e d i u m o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n i n su l i n p l u s a sco r b a t e co n t a i n e d 4 f o l d m o r e co l l a g e n ( p < 0 0 0 1 ) b u t t h e ce l l l a y e r c o n t a i n e d 3 0 % l e ss c o l l a g e n ( p < 0 0 3 ) K e r a t o cyt e s c u l t u r e d i n a sco r b a t e p l u s i n s u l i n syn t h e si ze d 1 1 f o l d m o r e co l l a g e n t h a n ke r a t o cyt e cu l t u r e d i n a sco r b a t e a l o n e w i t h a 9 f o l d i n cr e a se ( p < 0 0 0 1 ) i n t h e ce l l l a ye r a n d a 1 2 f o l d i n cr e a s e ( p < 0 0 0 1 ) i n t h e m e d i u m T h i s d a t a su g g e st s t h a t i n su l i n st i m u l a t e s co l l a g e n syn t h e si s a n d t h a t a sco r b a t e i n c r e a se s t h e p r o p o r t i o n o f t h e co l l a g e n t h a t i s se c r e t e d i n t o t h e m e d i a T h e h yd r o xyl a t i o n o f p r o l i n e i n t h e p r o co l l a g e n m o l e cu l e i s a p o st t r a n sl a t i o n a l m o d i f i ca t i o n r e q u i r e d f o r t h e f o r m a t i o n o f a st a b l e t r i p l e h e l i x i n t h e

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1 1 3 e n d o p l a sm i c r e t i cu l u m P r o l yl h yd r o xy l a se s a r e t h e e n zy m e s r e q u i r e d f o r t h e h yd r o xyl a t i o n o f t h e 4 p o si t i o n o f p r o l i n e E t h yl 3 4 d i h y d r o xy b e n zo a t e ( E D B ) i s a se l e ct i ve i n h i b i t o r o f p r o l yl h yd r o xyl a s e ( 2 1 5 ) E D B i s n o t t o xi c t o t h e c e l l s a n d h a s b e e n p r e vi o u sl y sh o w n t o i n h i b i t co l l a g e n d e p o si t i o n i n a d o se d e p e n d e n t m a n n e r ( 2 1 5 2 1 7 ) S i n ce m o st o f t h e co l l a g e n m a d e b y ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n a sco r b a t e p l u s i n su l i n w a s i n t h e m e d i a ( F i g u r e 2 ) t h e co l l a g e n i n t h e m e d i a w a s a n a l yze d f o r st a b i l i t y b y r e si st a n ce t o p e p si n d i g e st i o n K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n i n s u l i n o r i n su l i n p l u s a sco r b a t e co n t a i n i n g m e d i u m w i t h o r w i t h o u t 0 4 m M E D B T h e m e d i u m o f t h e ce l l s w a s co l l e ct e d a d j u st e d t o 0 5 M a ce t i c a ci d d i g e st e d w i t h p e p si n a n d a n a l yze d b y S D S P A G E ( F i g u r e 3 ) T h e m e d i u m o f ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n i n su l i n p l u s a sc o r b a t e c o n t a i n e d p e p si n r e si st a n t co l l a g e n t yp e s I a n d V f i b r i l s, d e m o n st r a t e d b y t h e p r o m i n e n t b a n d s f o r 1 ( I ) a n d 2 ( I ) a s w e l l a s a cl e a r b a n d f o r 1 ( V ) b e t w e e n t h e 6 4 a n d 1 9 1 kD a m a r k e r s ( F i g u r e 3 l a n e I A ) T h e b a n d f o r 2 ( V ) p a r t i a l l y co m i g r a t e d w i t h 1 ( I ) b u t ca n b e o b se r ve d a s a f a i n t b a n d j u st a b o ve 1 ( I ) ( F i g u r e 3 r i g h t p a n e l e xp a n d e d vi e w o f l a n e I A ) T h e se b a n d s w e r e a b se n t i n t h e m e d i u m o f ce l l s cu l t u r e d i n i n su l i n a l o n e ( l a n e I ) a n d i n t h e m e d i u m o f ce l l s cu l t u r e d i n i n su l i n a sco r b a t e a n d 0 4 m M E D B ( l a n e I A E ) T h e se r e su l t s sh o w t h a t t h e 2 p h o sp h o L a sco r b i c a ci d d e r i va t i ve o f a sco r b a t e a ct s o n co l l a g e n t o p r o d u ce a st a b l y f o l d e d t r i p l e h e l i x. T h e a cc u m u l a t i o n o f l u m i ca n a n d k e r a t o ca n i n t h e cu l t u r e m e d i u m w a s d e t e r m i n e d b y W e st e r n b l o t T h e m e d i u m w a s d i g e st e d w i t h e n d o g a l a ct o si d a se t o r e m o ve t h e K S si d e ch a i n b e f o r e S D S P A G E t o f a ci l i t a t e t r a n sf e r i n W e st e r n b l o t A n t i b o d i e s t o t h e co r e p r o t e i n o f t h e p r o t e o g l yca n d e t e c t

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1 1 4 t h e co r e p r o t e i n a s a sh a r p b a n d i n a W e st e r n b l o t ( 2 1 1 ) a n d t h e p i xe l d e n si t y f o r e a ch b a n d w a s d e t e r m i n e d ( F i g u r e 4 ) T r e a t i n g ce l l s w i t h a sco r b a t e a l o n e i n cr e a se d ke r a t o ca n a n d l u m i ca n l e ve l s i n t h e m e d i u m 4 f o l d ( p < 0 0 0 5 ) b u t i n su l i n a l o n e h a d n o e f f e ct o n t h e l e v e l s o f t h e se p r o t e o g l yca n s. A 9 f o l d i n cr e a se i n b o t h l u m i ca n a n d ke r a t o ca n w a s o b se r ve d ( p < 0 0 0 5 f o r b o t h ) w h e n ce l l s w e r e cu l t u r e d w i t h i n su l i n p l u s a sco r b a t e P r o st a g l a n d i n D syn t h a se ( P G D S ) i s a l so syn t h e si ze d a s a K S P G b y ke r a t o cyt e s i n vi t r o ( 1 3 9 ) C o n se q u e n t l y, w e p e r f o r m e d W e st e r n b l o t s f o r P G D S a s w e l l a n d f o u n d t h a t n e i t h e r a sco r b a t e n o r i n su l i n a f f e ct e d P G D S l e ve l s. S i n ce o n l y ke r a t o ca n a n d l u m i ca n h a v e b e e n sh o w n t o i n t e r a ct w i t h co l l a g e n f i b r i l s ( 4 4 ) t h e se r e su l t s su g g e st t h a t t h e i n cr e a se d a ccu m u l a t i o n o f K S P G s i n t h e m e d i u m i s l i m i t e d t o t h o s e w i t h co r e p r o t e i n s t h a t i n t e r a ct w i t h c o l l a g e n H a vi n g sh o w n t h a t t h e a cc u m u l a t i o n o f l u m i ca n a n d ke r a t o ca n i n t h e m e d i u m i s i n cr e a s e d b y t h e a d d i t i o n o f a sco r b a t e w e t h e n t e st e d i f t h e st i m u l a t o r y a ct i vi t y o f i n s u l i n p l u s a sco r b a t e c o u l d b e i n h i b i t e d b y t h e a d d i t i o n o f E D B a t a l o w a n d h i g h d o se ( 0 0 8 m M a n d 0 4 m M r e s p e ct i ve l y) A s p r e vi o u sl y sh o w n t h e a d d i t i o n o f a sco r b a t e t o m e d i u m c o n t a i n i n g i n s u l i n i n cr e a se d l u m i ca n a n d ke r a t o c a n a ccu m u l a t i o n b u t t h e p r e s e n ce o f 0 0 8 m M E D B i n m e d i u m co n t a i n i n g i n s u l i n a n d a sco r b a t e r e d u ce d t h e a ccu m u l a t i o n o f b o t h l u m i ca n a n d ke r a t o ca n b y 1 9 a n d 2 8 % ( p < 0 0 1 ) r e s p e ct i ve l y a f t e r 7 2 h ( F i g u r e 5 ) E D B a t a h i g h d o se ( 0 4 m M ) r e d u ce d l u m i ca n a n d ke r a t o ca n ( p = 0 0 7 ) a ccu m u l a t i o n i n t h e m e d i u m t o l e ve l s b e l o w o f t h o se m e a su r e d i n i n su l i n a l o n e T h e l e v e l o f P G D S a l so d e cl i n e d b u t t h e d e c r e a se w a s n o t si g n i f i ca n t ( p = 0 5 ) T h e r e su l t s o f t h i s

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1 1 5 e xp e r i m e n t a l so co n f i r m a co r r e l a t i o n b e t w e e n h yd r o xyl a t i o n a n d i n cr e a se d l e ve l s o f l u m i ca n a n d ke r a t o ca n p r o d u ct i o n K e r a t o cyt e cu l t u r e s w e r e r a d i o l a b e l e d w i t h 3 5 S O 4 a n d t h e a m o u n t o f i n co r p o r a t e d r a d i o l a b e l i n t h e C S a n d K S se cr e t e d i n t o t h e m e d i a w a s d e t e r m i n e d b y d i g e st i o n w i t h ch o n d r o i t i n a se A B C a n d e n d o g a l a ct o si d a se t o d e t e r m i n e i f a sco r b a t e w o u l d a l so i n cr e a se t h e i n co r p o r a t i o n o f 3 5 S O 4 i n t o K S ( F i g u r e 6 ) C o m p a r e d t o co n t r o l t h e a d d i t i o n o f a sco r b a t e a l o n e d i d n o t i n cr e a se t h e i n co r p o r a t i o n o f 3 5 S O 4 i n t o e i t h e r C S o r K S a n d i n su l i n ca u s e d o n l y m i n o r ch a n g e s i n t h e i n co r p o r a t i o n o f 3 5 S O 4 i n t o t h e se g l yco sa m i n o g l yca n s C u l t u r e i n i n su l i n p l u s a sco r b a t e h o w e ve r i n cr e a se d 3 5 S O 4 i n co r p o r a t i o n i n t o b o t h C S a n d K S si g n i f i ca n t l y ( p < 0 0 1 ) b u t p r e f e r e n t i a l l y e n h a n ce d i n co r p o r a t i o n i n t o K S ( 1 1 f o l d f o r K S 6 f o l d f o r C S ) co m p a r e d t o co n t r o l W h i l e m o st o f t h e k e r a t a n su l f a t e m a d e b y ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e h a s b e e n sh o w n t o b e i n p r o t e o g l yca n s, a p o r t i o n a ccu m u l a t e s a s f r e e G A G i n t h e m e d i u m ( 2 1 1 ) T h e se G A G si d e ch a i n s m a y b e t h e r e su l t o f p r o t e o l yt i c d e g r a d a t i o n o f t h e co r e p r o t e i n s C o n se q u e n t l y, e q u i va l e n t co u n t s o f i n co r p o r a t e d 3 5 S O 4 p r e se n t i n t h e m e d i u m o f i n su l i n o r t h e m e d i u m o f i n s u l i n p l u s a sco r b a t e t r e a t e d c u l t u r e s w e r e f r a ct i o n a t e d o n S u p e r o se 6 t o se p a r a t e i n t a ct p r o t e o g l yca n s f r o m G A G s. T h e i n t a c t p r o t e o g l yca n s syn t h e s i ze d b y ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n i n su l i n o r i n i n su l i n p l u s a sc o r b a t e e l u t e d b e t w e e n f r a ct i o n s 1 5 a n d 2 3 ( F i g u r e 7 ) T h e r e w a s, h o w e ve r r e l a t i ve l y g r e a t e r i n co r p o r a t i o n i n f r a ct i o n s 1 9 t o 2 3 f o r ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n i n su l i n p l u s a sc o r b a t e F r a c t i o n s 1 5 2 3 w e r e d i g e st e d w i t h ch o n d r o i t i n a se A B C o r e n d o g a l a c t o si d a se t o d e t e r m i n e t h e

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1 1 6 g l yco sa m i n o g l yca n ch a i n co m p o si t i o n T h e i n l a y sh o w s t h a t o ve r 8 0 % o f t h e i n co r p o r a t e d co u n t s i n f r a ct i o n s 1 5 1 8 w e r e r e l e a se d b y ch o n d r o i t i n a se A B C d i g e st i o n w h e r e a s o ve r 6 0 % o f t h e i n co r p o r a t e d co u n t s i n f r a ct i o n s 1 9 2 3 w e r e r e l e a se d b y e n d o g a l a ct o si d a se d i g e st i o n T h i s d e m o n st r a t e s t h a t t h e K S co n t a i n i n g p r o t e o g l yca n s e l u t e p r i m a r i l y i n f r a ct i o n s 1 9 2 3 a n d f u r t h e r c o n f i r m s t h a t a sco r b i c a ci d p r e f e r e n t i a l l y s t i m u l a t e s t h e syn t h e si s o f K S co n t a i n i n g p r o t e o g l yc a n s. D I S C U S S I O N T h e r e su l t s o f t h i s st u d y i n d i ca t e t h a t a sco r b a t e a l o n e d o e s n o t i n cr e a se co l l a g e n syn t h e si s b y ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e T h e a d d i t i o n o f i n su l i n a l o n e h o w e ve r i n cr e a se d co l l a g e n syn t h e si s 4 f o l d a n d t h e p r e s e n ce o f a sco r b a t e i n m e d i u m co n t a i n i n g i n s u l i n f u r t h e r i n c r e a se d co l l a g e n syn t h e si s t o 7 f o l d T h e f u r t h e r i n cr e a s e i n t o t a l co l l a g e n syn t h e si s i s l i ke l y d u e t o t h e a sc o r b a t e m e d i a t e d h yd r o xyl a t i o n o f p r o l i n e s a n d l ysi n e s i n t h e c o l l a g e n m o l e c u l e t h a t st a b i l i ze s t h e t r i p l e h e l i x a n d t h e r e b y i n c r e a se s i t s se c r e t i o n a n d r e si st a n ce t o d e g r a d a t i o n I n su l i n h a s b e e n sh o w n t o st i m u l a t e co l l a g e n t yp e I syn t h e si s i n h u m a n l u n g f i b r o b l a st s a t b o t h t h e m R N A a n d p r o t e i n l e ve l s ( 2 1 8 ) a n d t o st i m u l a t e c o l l a g e n o u s p r o t e i n a ccu m u l a t i o n i n scl e r o d e r m a f i b r o b l a st s vi a t h e P K C g a m m a p a t h w a y ( 2 1 9 ) I n su l i n t h e r a p y h a s b e e n sh o w n t o i m p r o ve w o u n d h e a l i n g o f ski n b u r n s i n r a t s( 2 2 0 ) I n su l i n t r e a t m e n t h a s a l so b e e n sh o w n t o i m p r o v e t h e st r e n g t h o f h e a l e d t h r o u g h a n d t h r o u g h w o u n d s i n r a b b i t co r n e a s ( 2 2 1 ) S i n ce

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1 1 7 t i ssu e s d e r i ve t h e i r t e n si l e st r e n g t h f r o m co l l a g e n t h e i n cr e a se d st r e n g t h o f t h e co r n e a l w o u n d s t r e a t e d w i t h i n su l i n m a y b e d u e t o i n cr e a se d co l l a g e n syn t h e si s. T h e a d d i t i o n o f a sco r b a t e t o c u l t u r e m e d i u m co n t a i n i n g i n su l i n n o t o n l y st i m u l a t e d c o l l a g e n sy n t h e si s, b u t a l so i n cr e a se d ke r a t o ca n a n d l u m i ca n a ccu m u l a t i o n 9 f o l d a n d K S syn t h e si s 1 1 f o l d T h e i n c r e a se i n l u m i ca n a n d ke r a t o ca n a ccu m u l a t i o n co r r e l a t e s w i t h t h e i n cr e a se d syn t h e si s o f h y d r o xyl a t e d co l l a g e n C u l t u r e i n i n su l i n a l o n e st i m u l a t e d c o l l a g e n syn t h e si s, b u t d i d n o t a f f e ct l u m i ca n a n d ke r a t o ca n a cc u m u l a t i o n A l t h o u g h i n su l i n st i m u l a t e d co l l a g e n syn t h e si s i n t h e a b se n ce o f a sco r b a t e t h e co l l a g e n d i d n o t f o r m st a b l e t r i p l e h e l i ce s, a s sh o w n b y a g r e a t e r p r o p o r t i o n o f t h e t o t a l co l l a g e n m a d e a ccu m u l a t i n g w i t h t h e ce l l l a ye r o r p e r i ce l l u l a r l y ( 2 0 5 ) a n d b y t h e su sce p t i b i l i t y o f t h e co l l a g e n se cr e a t e d i n t o t h e m e d i u m t o d e g r a d a t i o n b y p e p si n W h e n a sco r b a t e w a s a d d e d t o t h e i n su l i n co n t a i n i n g m e d i u m a h i g h e r p r o p o r t i o n o f t h e t o t a l co l l a g e n m a d e w a s se c r e t e d i n t o t h e m e d i u m a n d t h e co l l a g e n s t yp e I a n d V p r e se n t i n t h e m e d i u m w e r e p e p si n r e si st a n t T h e e f f e ct o f a sco r b a t e o n st i m u l a t i n g l u m i ca n a n d ke r a t o ca n a ccu m u l a t i o n a n d p r o vi d i n g r e si st a n ce o f co l l a g e n t o p e p si n d i g e st i o n w a s a b o l i sh e d w h e n e t h yl 3 4 d i h yd r o xy b e n zo a t e ( E D B ) w a s a d d e d t o t h e cu l t u r e m e d i u m E D B i s a n a n a l o g u e o f a sco r b a t e a n d co m p e t i t i ve l y i n h i b i t s p r o l yl h yd r o xyl a se r e su l t i n g i n t h e syn t h e si s o f u n d e r h y d r o xyl a t e d co l l a g e n ( 2 1 7 ) T a k e n t o g e t h e r t h e se d a t a s u g g e st t h a t t h e syn t h e si s a n d a ccu m u l a t i o n o f l u m i ca n a n d ke r a t o ca n a r e l i n ke d t o t h e l e v e l o f co l l a g e n syn t h e si s a n d t o t h e st a b i l i za t i o n o f t h e co l l a g e n t r i p l e h e l i x b y h yd r o xyl a t i o n

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1 1 8 T h e a sco r b i c a ci d m e d i a t e d st i m u l a t i o n o f ke r a t a n s u l f a t e p r o t e o g l yca n a ccu m u l a t e d b y ke r a t o cyt e s w a s l i m i t e d t o ke r a t o ca n a n d l u m i c a n B o t h ke r a t o ca n a n d l u m i ca n h a ve co r e p r o t e i n s co n t a i n i n g l e u ci n e r i ch r e p e a t s ( L R R ) ( 2 2 2 2 2 3 ) H o m o l o g y m o d e l i n g o f p r o t e i n s w i t h L R R t o r i b o n u cl e a se i n h i b i t o r sh o w t h a t t h e se p r o t e i n s t o f o l d t o a so l e n o i d t e r t i a r y st r u ct u r e ( 4 7 1 8 9 2 2 2 2 2 3 ) t h a t i n t e r a ct s w i t h t h e co l l a g e n f i b r i l a n d r e g u l a t e s f i b r i l f o r m a t i o n a n d d i a m e t e r ( 4 4 ) P G D S i s m a d e a s a ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n b y ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e ( 1 3 9 ) b u t i t d o e s n o t co n t a i n L R R a n d d o e s n o t i n t e r a ct w i t h co l l a g e n U n l i ke ke r a t o ca n a n d l u m i ca n P G D S a ccu m u l a t i o n w a s n o t a f f e ct e d b y i n su l i n a sco r b a t e o r t h e co m b i n a t i o n o f b o t h O u r st u d i e s t h a t s h o w t h a t w h i l e i n su l i n st i m u l a t e d co l l a g e n syn t h e si s, m o st o f t h i s i n c r e a se w a s i n t h e co l l a g e n a ss o ci a t e d w i t h t h e c e l l l a ye r a n d t h a t w h e n a sco r b i c a ci d w a s i n cl u d e d w i t h i n su l i n m o st o f t h e i n cr e a s e w a s i n t h e co l l a g e n se cr e t e d i n t o t h e m e d i u m w h e r e t h e p r o t e o g l yca n s a r e a l so se cr e t e d P r o t e o g l yca n s su ch a s l u m i ca n a n d ke r a t o c a n t h a t i n t e r a c t w i t h co l l a g e n m a y d e p e n d o n t h e f o r m a t i o n o f a st a b l e co l l a g e n h e l i x f o r t h e i r o w n st a b i l i t y. T h e co r e p r o t e i n o f t h e se p r o t e o g l yca n s i n t e r a c t w i t h sp e ci f i c r e g i o n s o f t h e co l l a g e n f i b r i l ( 2 2 4 2 2 6 ) i n a m a n n e r si m i l a r t o t h e i n t e r a ct i o n o f co l l a g e n w i t h d e co r i n ( 2 2 7 ) T h e d e c r e a se d st a b i l i t y o f t h e co l l a g e n t r i p l e h e l i x t h a t f o r m s i n t h e a b se n c e o f a sco r b a t e w o u l d w e a ke n i f n o t a b o l i sh t h e i n t e r a ct i o n o f t h e co r e p r o t e i n w i t h t h e co l l a g e n T h e o t h e r p o s si b i l i t y i s t h a t t h e co r e p r o t e i n s f o r l u m i ca n a n d ke r a t o ca n a r e a l so h yd r o xyl a t e d a n d t h i s st a b i l i ze s t h e i r st r u ct u r e a n d p r e ve n t s p r o t e o l yt i c a t t a ck. I t m a y b e i n t e r e st i n g t o n o t e t h a t e l a st i n a n o t h e r e xt r a ce l l u l a r m a t r i x

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1 1 9 co m p o n e n t i s a l so h yd r o xyl a t e d i n t h e p r e s e n ce o f a sco r b a t e ( 2 2 8 ) T h e r e i s, h o w e ve r n o e vi d e n ce t h a t t h e p r o l i n e s o r l y si n e s i n l u m i ca n a n d ke r a t o ca n a r e h yd r o xyl a t e d a n d t h e i n cr e a se d syn t h e si s o f t h e se p r o t e o g l yca n s i n t h e p r e se n ce o f a sco r b i c a ci d i s m o r e l i ke l y d u e t o a p r o t e ct i ve e f f e ct t h e y r e c e i ve b y i n t e r a ct i o n w i t h a st a b l y f o l d e d c o l l a g e n O u r st u d y s h o w s t h a t a sco r b a t e b e si d e s st a b i l i zi n g t h e co l l a g e n t r i p l e h e l i x, a l so i n cr e a se s t h e a ccu m u l a t i o n o f l u m i ca n a n d ke r a t o ca n p r o t e o g l yca n s i n t h e m e d i u m T h i s d a t a su g g e s t s t h a t t h e p r o p h yl a ct i c a ct i o n o f a sco r b a t e i n a l ka l i w o u n d t r e a t m e n t ( 2 0 6 2 2 9 ) a n d i n t h e p r e ve n t i o n o f l a t e o n se t co r n e a l h a ze a f t e r P R K b y t h e u se o f t o p i c a l a sco r b a t e ( 2 0 7 ) m a y b e d u e t o t h e e f f e ct o f a sco r b a t e o n i n c r e a si n g t h e st a b i l i t y o f t h e t r i p l e h e l i x f o r co l l a g e n I a n d V w h i ch t h e n a ct s t o i n cr e a s e t h e s t a b i l i t y a n d t h e r e f o r e t h e a ccu m u l a t i o n o f t h e k e r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n s l u m i ca n a n d ke r a t o ca n T h e i n c r e a se d a ccu m u l a t i o n o f ke r a t a n s u l f a t e p r o t e o g l yca n s, i n t u r n m a y a c ce l e r a t e t h e r e s t o r a t i o n o f st r o m a l t r a n sp a r e n cy b y r e g u l a t i n g t h e a sse m b l y o f t h e st a b l y f o l d e d co l l a g e n t r i p l e h e l i ce s i n t o f i b r i l s o f t h e c o r r e ct d i a m e t e r I n s u l i n w h i ch w e a n d o t h e r s ( 2 1 9 ) h a ve sh o w n t o st i m u l a t e co l l a g e n syn t h e si s a n d w h i ch h a s b e e n sh o w n t o i m p r o ve w o u n d h e a l i n g ( 2 2 0 2 2 1 ) m a y f u r t h e r e n h a n ce w o u n d h e a l i n g i f u s e d i n co m b i n a t i o n w i t h a sco r b a t e p a r t i cu l a r l y i n h u m a n s, si n ce t h e y l a ck t h e a b i l i t y t o syn t h e si ze a sco r b a t e

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1 2 0 F i g u r e 1 K e r a t o c y t e p o p u l a t i o n g r o w t h i n c u l t u r e u s i n g d e f i n e d m e d i a L e g e n d : C o n t r o l f i l l e d sq u a r e s so l i d l i n e ; a sco r b a t e o p e n sq u a r e s d a sh e d l i n e ; i n su l i n f i l l e d t r i a n g l e s so l i d l i n e ; i n su l i n p l u s a sco r b a t e o p e n t r i a n g l e s d a sh e d l i n e T h e a d d i t i o n o f a sco r b a t e t o t h e c u l t u r e m e d i u m i n c r e a se s i n i t i a l g r o w t h r a t e w h e n i n su l i n i s p r e se n t i n t h e m e d i u m b u t d o e s n o t a f f e ct f i n a l ce l l d e n si t y o r g r o w t h i n t h e a b se n ce o f i n s u l i n n = 4

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1 2 1 F i g u r e 2 C o l l a g e n s y n t h e s i s a n d s e c r e t i o n i n d e f i n e d m e d i a C u l t u r e s w e r e i n cu b a t e d i n m e d i a c o n t a i n i n g 3 H g l yci n e f o r 7 2 h o u r s. R a d i o a ct i vi t y i n co r p o r a t e d i n t o co l l a g e n p r e s e n t i n t h e m e d i a ( b l a ck b a r ) a n d ce l l l a ye r ( o p e n b a r ) w a s d e t e r m i n e d u si n g a c o l l a g e n a se sp e ci f i c f o r f i b r i l l a r r e g i o n s o f co l l a g e n T h e a d d i t i o n o f a sco r b a t e a l o n e d i d n o t a l t e r t h e co l l a g e n sy n t h e si s. A d d i n g i n su l i n t o t h e c u l t u r e m e d i u m si g n i f i ca n t l y i n cr e a se d co l l a g e n i n b o t h t h e c e l l l a ye r a n d t h e m e d i u m I n su l i n p l u s a sco r b a t e s h o w a si g n i f i ca n t i n c r e a se c o l l a g e n i n se cr e t e d i n t o t h e m e d i u m a n d a si g n i f i ca n t d e cr e a se i n co l l a g e n i n t h e ce l l l a ye r co m p a r e d t o i n su l i n a l o n e n = 3

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1 2 2 F i g u r e 3 S D S P A G E a n a l y s i s o f m e d i u m d i g e s t e d w i t h p e p s i n T h e m e d i u m o f ce l l s cu l t u r e d i n i n su l i n ( I ) i n s u l i n p l u s a sc o r b a t e ( I A ) o r i n s u l i n a sco r b a t e a n d E D B ( 0 4 m M ) w a s co l l e ct e d c o n ce n t r a t e d a n d d i g e st e d w i t h p e p si n i n 0 5 M a ce t i c a ci d A l i q u o t s o f t h e d i g e st e d sa m p l e s a n d a p e p si n o n l y co n t r o l ( P ) w e r e se p a r a t e d o n 1 0 % b i s t r i s a n d st a i n e d f o r t o t a l p r o t e i n u si n g S a f e S t a i n O n l y t h e m e d i u m o f ce l l s cu l t u r e d i n i n s u l i n a n d a sco r b a t e h a d p e p si n r e si st a n t co l l a g e n T h e I A l a n e i s s h o w n e xp a n d e d t o t h e r i g h t a n d t h e m i g r a t i o n p o si t i o n s o f t h e ) Tj 50 0 0 50 1443 0 Tm ( ch a i n s f o r c o l l a g e n I a n d V a r e l a b e l e d

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1 2 3 F i g u r e 4 A c c u m u l a t i o n o f k e r a t a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s i n t h e m e d i u m M e d i u m w a s c o l l e ct e d o n d a y 4 d i g e st e d w i t h e n d o g a l a ct o si d a se se p a r a t e d b y S D S P A G E t r a n sf e r r e d t o n i t r o ce l l u l o se a n d p r o b e d w i t h a n t i b o d i e s t o ke r a t o ca n l u m i ca n o r P G D S T h e W e st e r n b l o t s u si n g a n t i b o d i e s a g a i n st ke r a t o ca n l u m i ca n a n d P G D S w e r e sc a n n e d t o d e t e r m i n e t h e i r p i xe l d e n si t y a n d t h e n e t p i xe l d e n si t y d i vi d e d b y t h e m i cr o g r a m s o f D N A i n e a ch cu l t u r e B a r s r e p r e se n t t h e m e a n o f 3 d e t e r m i n a t i o n s p l u s S D K e r a t o ca n a cc u m u l a t i o n i n m e d i u m co n t a i n i n g a sco r b a t e i n cr e a se d 4 f o l d ( p < 0 0 0 5 ) co m p a r e d t o co n t r o l M e d i u m co n t a i n i n g i n su l i n a n d a s co r b a t e co n t a i n e d 9 f o l d m o r e ke r a t o ca n a n d l u m i ca n ( p < 0 0 0 5 ) t h a n co n t r o l m e d i u m T h e a d d i t i o n o f a sco r b a t e d i d n o t h a ve a n e f f e ct o n P G D S l e ve l s w i t h o r w i t h o u t i n su l i n n = 3

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1 2 4 F i g u r e 5 A c c u m u l a t i o n o f k e r a t a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s i n c u l t u r e m e d i u m o f c e l l s t r e a t e d w i t h e t h y l 3 4 d i h y d r o x y b e n zo a t e ( E D B ) K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n m e d i u m co n t a i n i n g e i t h e r 0 0 8 m M o r 0 4 m M E D B i n i n su l i n co n t a i n i n g g r o w t h m e d i u m w i t h o r w i t h o u t a sco r b a t e S a m p l e s w e r e p r o ce ss e d a s d e scr i b e d i n F i g u r e 6 A d o se d e p e n d e n t si g n i f i ca n t d e cr e a se ( p < 0 0 1 ) a t 0 0 8 m M E D B w a s d e t e ct e d i n b o t h l u m i ca n a n d ke r a t o ca n a ccu m u l a t i o n b e t w e e n ce l l s cu l t u r e d i n i n su l i n + a sco r b a t e a n d i n su l i n + a sco r b a t e + E D B A t 0 4 m M l u m i ca n a n d ke r a t o ca n l e ve l s f e l l b e l o w t h e l e ve l s o f t h e i n s u l i n a l o n e c o n t r o l

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1 2 5 F i g u r e 6 I n c o r p o r a t i o n o f 3 5 S O 4 i n t o g l y c o s a m i n o g l y c a n s d u r i n g 7 2 h i n c u l t u r e C u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d i n m e d i u m c o n t a i n i n g 3 5 S O 4 f o r 7 2 h o u r s T h e cu l t u r e m e d i u m w a s co l l e ct e d s e n si t i vi t y o f i n co r p o r a t e d r a d i o a ct i vi t y t o ch o n d r o i t i n a se A B C ( o p e n b a r s ) a n d e n d o g a l a ct o si d a se ( so l i d b a r s) d i g e st i o n w a s u se d t o d e t e r m i n e i n co r p o r a t i o n o f 3 5 S O 4 i n t o ch o n d r o i t i n a n d ke r a t a n su l f a t e r e s p e ct i ve l y. C P M w a s e xp r e ss e d p e r g o f D N A B a r s r e p r e se n t m e a n p l u s S D n = 3

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1 2 6 F i g u r e 7 C h r o m a t o g r a p h y o f 3 5 S O 4 r a d i o l a b e l e d p r o t e o g l y c a n s o n S u p e r o s e 6 C u l t u r e m e d i u m f r o m ke r a t o cyt e s i n cu b a t e d w i t h 3 5 S O 4 f o r 7 2 h o u r s w a s h a r ve st e d a n d e q u a l a m o u n t s o f i n co r p o r a t e d r a d i o a ct i vi t y w a s f r a ct i o n a t e d o n S u p e r o se 6 t o d e t e r m i n e i n co r p o r a t i o n i n t o i n t a ct p r o t e o g l yca n s. L e g e n d : i n s u l i n : f i l l e d sq u a r e s, so l i d l i n e ; i n s u l i n p l u s a sco r b a t e : o p e n sq u a r e s d a sh e d l i n e I n l a y sh o w s p e r ce n t C S / K S o f f r a ct i o n s 1 5 t o 2 3 f r o m m e d i a o f i n su l i n p l u s a sco r b a t e t r e a t e d ce l l s. I n l a y l e g e n d : C S so l i d l i n e ; K S d a sh e d l i n e M o st o f t h e i n co r p o r a t e d r a d i o a ct i vi t y e l u t e s a t t h e p o si t i o n o f t h e i n t a ct p r o t e o g l yc a n s. A sco r b a t e p r e f e r e n t i a l l y st i m u l a t e s t h e i n c o r p o r a t i o n o f 3 5 S O 4 i n t o K S P G

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1 2 7 D I S C U S S I O N T h e st u d y o f ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e h a s c h a n g e d co n si d e r a b l y i n t h e l a st t e n ye a r s, m o st n o t a b l y si n ce t h e u se o f a se r u m f r e e m e d i u m ( S F M ) f o r cu l t u r i n g t h e se ce l l s ( 9 8 ) a n d i t s a d a p t a t i o n t o t h e b o v i n e ke r a t o cyt e cu l t u r e syst e m ( 9 8 ) P r e vi o u s w o r k sh o w e d t h a t F G F 2 st i m u l a t e d ke r a t o cyt e s t o g r o w f a st e r t h a n t h e y d o i n 1 0 % se r u m ( 1 7 8 ) K e r a t o cyt e cu l t u r e r e s e a r ch c o n d u ct e d a s p a r t o f t h i s d i sse r t a t i o n h o w e ve r f a i l e d t o r e p l i ca t e t h o se r e su l t s. C l o se r e xa m i n a t i o n sh o w e d t h a t t h i s st u d y h a d u se d l o w co n ce n t r a t i o n s o f se r u m ( 0 1 % ) i n t h e i r cu l t u r e m e d i u m su g g e st i n g t h a t t h e p r e se n c e o f se r u m w a s a f f e ct i n g t h e p o t e n cy o f t h e g r o w t h f a ct o r s. T h i s w a s t e st e d i n su p p l e m e n t t o p a p e r 1 f i g u r e 1 A l a r g e i n cr e a se i n t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n w a s o b s e r ve d w h e n se r u m w a s p r e se n t i n t h e p l a t i n g o r i n t h e cu l t u r e m e d i u m e ve n a t l o w co n c e n t r a t i o n s. K e r a t o cyt e s, p l a t e d i n m e d i u m co n t a i n i n g se r u m a n d c u l t u r e d i n 0 1 % P P H S i n co r p o r a t e d si g n i f i ca n t l y m o r e t h ym i d i n e t h a n ce l l s p l a t e d a n d cu l t u r e d i n S F M A si g n i f i ca n t i n cr e a se w a s a l so o b s e r ve d w h e n co m p a r i n g t h e s t i m u l a t i o n o f t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n ca u se d b y g r o w t h f a ct o r s a ct i n g o n ke r a t o cyt e s i n S F M o r ke r a t o cyt e s e xp o se d t o se r u m E ve n t h e st i m u l a t i o n o f t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n b y e xt r a ct i n cr e a se d w h e n ke r a t o cyt e s w e r e e xp o se d t o s e r u m a t p l a t i n g o r

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1 2 8 d u r i n g c u l t u r e I n s u m m a r y, e xp o su r e t o s e r u m a f f e ct e d t h e r e sp o n se o f t h e ke r a t o cyt e s t o g r o w t h f a ct o r s. V i e w i n g t h e r e su l t s f r o m p a p e r o n e t h e su p p l e m e n t a n d p a p e r t w o a s a w h o l e su g g e st s t h e f o l l o w i n g e xp l a n a t i o n f o r t h e se r e su l t s. C u l t u r e i n e xt r a ct st i m u l a t e s a l l ce l l s t o g r o w e q u a l l y ( p a p e r 1 f i g u r e 3 ) b u t F G F 2 a n d P D G F B B m a y st i m u l a t e o n l y so m e o f t h e c e l l s t o g r o w w h e n cu l t u r e d i n t h e a b se n ce o f se r u m ( p a p e r 2 f i g u r e s 1 a n d 2 ) T h e s e ce l l s t h r i ve i n cu l t u r e m e d i u m co n t a i n i n g F G F 2 o r P D G F B B p r o l i f e r a t e a n d b e co m e f i b r o b l a st i c, w h i l e t h e c e l l s i n e xt r a ct r e m a i n d e n d r i t i c. S u p p l e m e n t i n g t h e m e d i u m w i t h se r u m a t p l a t i n g t i m e o r d u r i n g cu l t u r e a f f e ct s t h e ce l l cycl e st a t e o f s o m e ke r a t o cyt e s a n d a l so e n h a n ce s t h e ce l l u l a r r e sp o n se t o F G F 2 a n d P D G F B B I t i s kn o w n t h a t e x p o su r e o f se r u m f o l l o w e d b y se r u m st a r va t i o n i n cr e a se s g r o w t h f a ct o r r e ce p t o r e x p r e ssi o n ( 2 3 0 ) I t i s p o ssi b l e t h e r e f o r e t h a t w h e n t h e se r u m p r e se n t a t p l a t i n g i s r e m o ve d ke r a t o cyt e s i n cr e a s e t h e e xp r e ssi o n o f r e ce p t o r s t o F G F 2 a n d P D G F a n d r e sp o n d st r o n g e r t o t h e se g r o w t h f a ct o r s A n o t h e r p o ssi b l e e xp l a n a t i o n f o r t h i s i s t h e f a ct t h a t se r u m i s a co m p l e x m e d i u m a n d co n t a i n s a m i xt u r e o f m i t o g e n s, m o r p h o g e n s, p r o t e i n s, l i p i d s, ca r b o h yd r a t e s a n d n u t r i e n t s. E ve n t h o u g h P P H S i s l e ss r i ch i n m i t o g e n s t h a n F B S i t l i ke l y st i l l c o n t a i n s o t h e r p r o t e i n s ( 2 3 1 2 3 3 ) t h a t a f f e ct ce l l s, a n d i n t h i s ca se ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e I n o u r l a b o r a t o r y, P P H S w a s o r i g i n a l l y a d d e d t o f a ci l i t a t e a n d sp e e d u p ce l l a t t a ch m e n t h o w e ve r i t w a s f o u n d t h a t ke r a t o cyt e s st a r t e d t o a t t a ch w i t h i n 1 5 m i n u t e s a n d t h i s w a s d e l a ye d i f P P H S w a s p r e se n t i n t h e cu l t u r e m e d i u m I n a d d i t i o n B e a l e s e t a l ( 9 9 ) sh o w e d t h a t p l a t i n g ke r a t o cy t e s i n 1 % P P H S a l t e r e d

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1 2 9 t h e i r C S / K S r a t i o B e r r yh i l l e t a l ( 1 0 0 ) a l so s h o w e d t h a t w h e n t h e st i m u l a t i o n b y 1 0 % se r u m w a s r e m o ve d t h e ce l l s o n l y p a r t i a l l y r e v e r t e d t o t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e A l l t h e se e xp e r i m e n t a l o b se r v a t i o n s su g g e st t h a t se r u m e i t h e r P P H S o r F B S e ve n a t l o w co n c e n t r a t i o n a f f e ct t h e w a y k e r a t o cy t e s r e sp o n d t o g r o w t h st i m u l i a l t h o u g h t h e y m a y st i l l m a i n t a i n a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y. F o l l o w i n g t h e se o b se r va t i o n s, t h e u s e o f 1 % P P H S a s a p l a t i n g su p p l e m e n t w a s d i sco n t i n u e d a n d o n l y S F M u se d t o p l a t e t h e ke r a t o cyt e s. A n u n e xp e ct e d r e s u l t o b t a i n e d i n t h e s e c o n d p a p e r w a s t h e 6 0 f o l d i n cr e a se i n ke r a t o c a n a ccu m u l a t e d i n t h e m e d i u m o f ke r a t o cy t e s p l a t e d a t h i g h d e n si t y w h e n co m p a r e d t o t h e m e d i u m o f ce l l s p l a t e d a t l o w d e n si t y. W h i l e t h i s r e su l t r a i se d t h e p o ssi b i l i t y t h a t p r o t e o g l yca n syn t h e si s w a s d e n si t y d e p e n d e n t t h e si ze e xcl u si o n ch r o m a t o g r a p h y p r o vi d e d a n e xp l a n a t i o n ( P a p e r 2 f i g u r e 6 ) I t i s n o w e vi d e n t t h a t ke r a t o cyt e s a t l o w d e n si t y d e g r a d e m o st o f t h e p r o t e o g l yc a n s t h e y se cr e t e T h i s d e g r a d a t i o n w a s p r e v e n t e d i f ke r a t o cyt e s w e r e p l a t e d a t h i g h d e n si t y, o r cu l t u r e d i n t h e p r e s e n ce o f g r o w t h f a ct o r s. I t i s kn o w n t h a t M M P 2 a co l l a g e n d e g r a d i n g p r o t e a s e i s p r e se n t i n t h e u n w o u n d e d c o r n e a a n d t h a t i t s syn t h e si s a n d a ct i vi t y i n cr e a se si g n i f i ca n t l y a f t e r co r n e a l w o u n d i n g ( 2 3 4 2 3 5 ) H o w e ve r t h i s M M P i s p r e se n t i n a n i n a ct i ve f o r m a n d i s a ct i va t e d a f t e r p r o t e o l yt i c cl e a va g e o f t h e p r o d o m a i n ( 2 3 6 ) C h a kr a va r t i e t a l h a ve sh o w n t h a t ke r a t o cyt e s p l a t e d i n S F M u p r e g u l a t e m R N A l e ve l s o f M M P 1 3 a n d M M P 3 p o ssi b l y vi a a n a u t o cr i n e l o o p i n vo l vi n g I L 1 a ( 2 3 7 ) I L 1 a h a s a l so b e e n sh o w n t o i n d u ce M T 1 M M P ( M M P 1 4 ) e x p r e ssi o n i n sm o o t h m u scl e ce l l cu l t u r e a s e a r l y a s 4 h o u r s a f t e r st i m u l a t i o n ( 2 3 6 ) M T 1

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1 3 0 M M P i s p r e se n t i n t h e co r n e a l st r o m a ( 2 3 8 ) a n d ca n a ct i va t e p r o M M P 2 t o t h e a ct i ve e n zym e ( 2 3 9 ) T h e r e f o r e i t i s p o ssi b l e t h a t ke r a t o cyt e s a t l o w d e n si t y i n cr e a se I L 1 a se cr e t i o n r e su l t i n g i n i n cr e a s e d M T 1 M M P syn t h e si s a n d M M P 2 a ct i va t i o n I n t h e p r e s e n ce o f g r o w t h f a ct o r s, I L 1 a s e cr e t i o n o r M M P a ct i va t i o n m a y b e d o w n r e g u l a t e d I n su l i n f o r i n st a n ce h a s b e e n sh o w n t o p r e ve n t e xce ssi ve p r o t e o l yt i c d e g r a d a t i o n o f t i ssu e s a f t e r b u r n w o u n d s ( 2 4 0 ) b u t t h i s m a y b e d u e t o t h e a n a b o l i c e f f e ct o f i n su l i n ( 2 4 1 ) a n d n o t t o t h e p r e ve n t i o n o f E C M d e g r a d a t i o n S t u d i e s h a ve a l so sh o w n t h a t t h e se g r o w t h f a ct o r s i n c r e a se t h e e xp r e ssi o n o f t i ssu e i n h i b i t o r s o f m e t a l l o p r o t e a se s ( T I M P ) i n a ce l l sp e ci f i c m a n n e r ( 2 4 2 ) K e r a t o cyt e s h a v e b e e n s h o w n t o se cr e t e T I M P 1 a n d T I M P 1 i s p r e se n t i n t h e co r n e a l st r o m a ( 2 4 3 ) I f T I M P s a r e u p r e g u l a t e d b y t h e s e g r o w t h f a ct o r s co u l d t h e r e f o r e p r o vi d e a p o ssi b l e e xp l a n a t i o n t o t h e d e cr e a se d d e g r a d a t i o n A p o ssi b l e e xp l a n a t i o n f o r t h e l a ck o f d e g r a d a t i o n o b se r ve d a t h i g h p l a t i n g d e n si t y i s t h a t a t u n d e r t h e s e co n d i t i o n s t h e ke r a t o cyt e s r e e st a b l i sh ce l l ce l l co n t a ct s vi a d e n d r i t i c p r o ce sse s, si m i l a r t o w h a t i s o b se r ve d i n t h e u n w o u n d e d st r o m a ( 5 8 ) T h i s m a y i n t u r n p r e ve n t t h e s e cr e t i o n o f I L 1 a t h e a ct i va t i o n o f M T 1 M M P vi a d o w n st r e a m si g n a l s ( 2 4 4 ) o r b o t h r e d u ci n g p r o t e a se a ct i vi t y. A t l o w p l a t i n g d e n si t y, ke r a t o cyt e s a r e n o t co n t a ct i n h i b i t e d i n a m a n n e r si m i l a r t o t h e o n e o b se r ve d a f t e r t h e a p o p t o t i c e ve n t f o l l o w i n g co r n e a l w o u n d i n g T h e ce l l vo i d sp a ce ( 6 4 ) t h a t r e su l t s f r o m a p o p t o si s st i l l co n t a i n s t h e i n t a ct E C M a n d t h i s d e n se st r o m a l E C M s h o u l d b e vi e w e d a s a n o b st a cl e f o r c e l l m i g r a t i o n

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1 3 1 R e g a r d l e ss, ke r a t o cyt e s r e p o p u l a t e t h e ce l l vo i d sp a ce w i t h i n a co u p l e o f d a ys a f t e r i n j u r y a n d d o so b y m i g r a t i n g t h r o u g h t h e E C M T h e ch a n g e s i n G A G si d e ch a i n si ze a n d i n c r e a se d C S co n t e n t ( 8 6 ) a f f e ct s t h e o r g a n i z a t i o n o f t h e st r o m a l E C M ( 1 2 7 ) a n d m a y m a ke i t e a si e r f o r t h e ce l l s t o m i g r a t e t h r o u g h i t b u t i t i s a l so p o ssi b l e t h a t ke r a t o cyt e s i n t h e m i g r a t o r y st a g e e xh i b i t t u m o r ce l l l i ke M T 1 M M P e xp r e ssi o n a n d t h i s a l l o w s t h e m t o d e g r a d e t h e E C M a t t h e l e a d i n g e d g e o f t h e m i g r a t i n g ce l l s. T h e u p r e g u l a t i o n o f m a t r i x d e g r a d i n g e n zy m e s su c h a s M T 1 M M P b y ke r a t o cyt e s m a y t h e r e f o r e b e a n i m p o r t a n t f a ct o r f o r t h e m i g r a t o r y p h a se o f t h e w o u n d h e a l i n g r e sp o n se I t i s a l so p o ssi b l e h o w e ve r t h a t ke r a t o cyt e s p r o d u ce a n d se cr e t e o t h e r p r o t e a se s i n t o t h e m e d i u m o r e n vi r o n m e n t a n d t h a t t h e se a r e r e sp o n si b l e f o r t h e d e g r a d a t i o n o b s e r ve d i n l o w d e n si t y cu l t u r e s T h e s e co u l d i n cl u d e m e m b e r s o f t h e ca t h e p si n p r o t e a se s ( 2 4 5 ) f a m i l y o r se r i n e p r o t e a se s l i ke u r o ki n a se w h i c h h a ve b e e n sh o w n t o b e a ct i va t e d d u r i n g w o u n d h e a l i n g i n t h e co r n e a ( 2 4 6 ) A s o n e o f t h e f u n ct i o n s o f t h e ke r a t o cyt e s i n si t u i s t o r e m o d e l t h e E C M i t i s p o ssi b l e t h a t t h e p r o t e o l yt i c a ct i o n o f t h e se ce l l s i s p a r t o f t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e I n cr e a se d d e g r a d a t i o n a s a r e su l t o f t h e l o ss o f ce l l ce l l co n t a ct s, m a y r e su l t i n t h e r e l e a se o f g r o w t h f a ct o r s se q u e st e r e d i n t h e E C M i n cr e a si n g t h e i r a va i l a b i l i t y. I n cr e a se d p r o t e o l yt i c a ct i vi t y, t h e r e f o r e m a y b e a r e su l t o f t h e a p o p t o t i c e ve n t i n cr e a si n g g r o w t h f a ct o r a va i l a b i l i t y a s w e l l a s ca u si n g l i m i t e d d e st a b i l i za t i o n o f t h e st r o m a l E C M t h a t w i l l a l l o w ke r a t o cyt e m i g r a t i o n i n t o t h e ce l l vo i d sp a ce U p o n r e f o r m a t i o n o f t h e ce l l ce l l co n t a ct s a n d t h e ke r a t o cyt e n e t w o r k, t h i s p r o t e o l yt i c a ct i vi t y m a y d e cr e a se a g a i n t o t h e p r e w o u n d h o u se ke e p i n g l e ve l s.

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1 3 2 T h e p r o p o sa l t h a t ke r a t o cyt e s p l a t e d a t l o w d e n si t y a r e m o r e p r o t e o l yt i ca l l y a ct i ve i s f u r t h e r s u p p o r t e d b y t h e i n cr e a s e d i n co r p o r a t i o n o f su l f a t e w h e n ke r a t o cyt e s a t l o w d e n si t y w e r e cu l t u r e d i n t h e p r e se n ce o f b o vi n e se r u m a l b u m i n ( B S A ) ( S u p p l e m e n t F i g u r e 2 A ) a n d t h e l a ck o f a p e a k co n t a i n i n g f r e e G A G si d e ch a i n s ( S u p p l e m e n t F i g u r e 2 B a n d P a p e r 2 F i g u r e 6 A ) i n l o w d e n si t y cu l t u r e s. B S A si g n i f i ca n t l y i n cr e a se d p r o t e o g l yc a n a ccu m u l a t i o n e ve n a t l o w co n ce n t r a t i o n s ( 0 0 0 1 % ) a n d i n cr e a si n g co n ce n t r a t i o n s o f B S A h a d l i t t l e e f f e ct o n t o t a l su l f a t e i n co r p o r a t i o n a t b o t h l o w a n d h i g h p l a t i n g d e n si t y. W h i l e B S A m a y st i m u l a t e u p t a ke o f r a d i o l a b e l e d s u l f a t e b y t h e ce l l s, t h e r e b y i n cr e a si n g i n co r p o r a t i o n i t i s a l so p o ssi b l e t h a t t h i s st i m u l a t i o n i s t h e r e su l t o f r e d u ce d d e g r a d a t i o n o f t h e r a d i o l a b e l e d p r o t e o g l yca n s T h e n e w l y syn t h e si ze d a n d r a d i o l a b e l e d p r o t e o g l yca n s a r e p r e se n t a t co n ce n t r a t i o n s t h a t a r e si g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h e B S A i n t h e m e d i u m a n d t h e r e f o r e sh i e l d e d f r o m p r o t e o l yt i c d e g r a d a t i o n b y t h e e xce ss o f B S A i n t h e m e d i u m S F M su p p l e m e n t e d w i t h 0 1 m g / m l B S A co n t a i n s a t o t a l p r o t e i n co n ce n t r a t i o n si m i l a r t o t h e o n e m e a s u r e d i n 1 0 % e xt r a ct ( 0 1 m g / m l ) E q u i va l e n t co u n t s o f syn t h e si ze d p r o t e o g l yca n s i n t h e m e d i u m o f ke r a t o cyt e s a t l o w ( B ) a n d h i g h ( C ) p l a t i n g d e n si t y w e r e f r a ct i o n a t e d u si n g S u p e r o se 6 ( S u p p l e m e n t f i g u r e 2 B a n d C ) a n d t h e r e su l t s sh o w t h a t t h e e l u t i o n p r o f i l e s o f su l f a t e i n co r p o r a t e d b y ce l l s cu l t u r e d i n e xt r a ct o r 0 1 m g / m l B S A a r e n e a r l y i d e n t i ca l a n d si g n i f i ca n t l y d i f f e r e n t t h a t t h e i n co r p o r a t i o n b y ke r a t o cyt e s a t l o w d e n si t y, w h e r e a l a r g e p e a k b e t w e e n f r a ct i o n s 2 8 3 2 ( f r e e G A G si d e ch a i n s ) i s d e t e ct e d A d d i t i o n a l l y, t h e st i m u l a t i o n o f su l f a t e i n co r p o r a t i o n w a s n o t l o st i f t h e

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1 3 3 e xt r a ct w a s d e n a t u r e d b y h e a t o r b y 4 M g u a n i d i n e a n d co r r e l a t e s t o t h e p r o t e i n co n t e n t s o f t h e e xt r a ct f r a ct i o n s ( d a t a n o t sh o w n ) F u r t h e r m o r e a 1 m g / m l o va l b u m i n so l u t i o n a l so st i m u l a t e d su l f a t e i n co r p o r a t i o n ( d a t a n o t sh o w n ) I t i s st i l l p o ssi b l e t h a t t h e B S A o r t h e m i t o g e n s p r e se n t i n t h e e xt r a ct d o st i m u l a t e su l f a t e i n co r p o r a t i o n b u t i t se e m s m o r e l i ke l y t h a t t h e p r e se n c e o f e xt r a ct o r B S A p r e ve n t s t h e d e g r a d a t i o n o f t h e n e w l y syn t h e si ze d r a d i o l a b e l e d m a t e r i a l b y sh i e l d i n g t h e m f r o m d e g r a d a t i o n A s t h e r e su l t s o f p a p e r 3 sh o w t h e a cc u m u l a t i o n o f p r o t e o g l yca n s se cr e t e d b y ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n m e d i u m co n t a i n i n g a sco r b a t e i s e n h a n ce d d u e t o t h e h yd r o xyl a t i o n o f co l l a g e n E xt r a ct d u e t o i t s o r i g i n co n t a i n s a sco r b a t e a s w e l l a s o t h e r p r o t e i n s e xt r a ct e d f r o m t h e p u l ve r i ze d st r o m a I t i s p o ssi b l e t h a t i t co n t a i n s co l l a g e n s, a n d t h a t t h e n e w l y syn t h e si ze d p r o t e o g l yca n s a r e i n t e r a ct i n g w i t h t h i s co l l a g e n i n so l u t i o n a n d a l so d u r i n g syn t h e si s. I t i s a l so p o ssi b l e t h a t t h e B S A a d d e d i n t e r a c t s w i t h t h e p r o t e o g l yca n s b e i n g se c r e t e d a n d st a b i l i ze t h e m i n so l u t i o n i n a m a n n e r si m i l a r t o t h e co l l a g e n p r o t e o g l yca n i n t e r a ct i o n s, t h e r e b y p r e ve n t i n g t h e i r d e g r a d a t i o n O n e o f t h e q u e st i o n s r e m a i n i n g t o b e a n sw e r e d i s t h e o r i g i n o f t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y o f t h e e xt r a ct I s t h i s a ct i vi t y o n l y f o u n d i n t h e st r o m a o r ca n i t b e f o u n d i n o t h e r p a r t s o f t h e e ye T o t e st w h e t h e r e xt r a c t f r o m o t h e r p a r t s o f t h e e ye a f f e ct e d k e r a t o cy t e g r o w t h e xt r a c t s f r o m l e n s, r e t i n a a n d vi t r e o u s h u m o r w e r e m a d e W i t h t h e e xce p t i o n o f t h e l e n s e xt r a ct n o n e o f t h e e xt r a ct s st i m u l a t e d t h y m i d i n e i n co r p o r a t i o n ( S u p p l e m e n t F i g u r e 3 ) A s d e scr i b e d i n t h e i n t r o d u ct i o n t h e co r n e a l e p i t h e l i u m o r i g i n a l l y f o r m s f r o m t h e sa m e ce l l s t h a t g i ve

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1 3 4 r i se t o t h e l e n s e p i t h e l i u m so i t i s p o ssi b l e t h a t t h e l e n s e p i t h e l i u m se c r e t e s g r o w t h f a ct o r s t h a t a f f e ct ke r a t o cyt e ce l l g r o w t h i n a m a n n e r si m i l a r t o g r o w t h f a ct o r s m a d e b y t h e co r n e a l e p i t h e l i u m I n t h e scr a p e w o u n d m o d e l d i scu sse d i n t h e i n t r o d u ct i o n ke r a t o cyt e s r e p o p u l a t e d t h e ce l l vo i d sp a ce w i t h i n 5 d a ys. K e r a t o cyt e s i n t h e s t r o m a a d j a ce n t t o t h e w o u n d m a r g i n a p p e a r e d K i 6 7 p o si t i ve a f t e r a r o u n d 1 6 h o u r s p o st scr a p e i n d i ca t i n g t h a t t h e se ce l l s h a ve l e f t G 0 a n d h a ve r e e n t e r e d t h e c e l l cycl e ( 6 4 ) O t h e r st u d i e s s h o w t h a t ke r a t o cyt e s r e e n t e r t h e ce l l cycl e 1 2 1 5 h o u r s p o st w o u n d i n g K e r a t o cyt e s c u l t u r e d i n e xt r a ct b e g i n i n co r p o r a t i n g t h ym i d i n e i n t o D N A 1 5 h o u r s a f t e r t h e i n i t i a l e xp o su r e T h i s su g g e st s t h a t t h e ke r a t o cy t e s r e l e a se d b y t h e d i g e s t i o n o f t h e co r n e a l st r o m a r e m a i n i n G 0 a n d a r e o n l y st i m u l a t e d t o e n t e r t h e ce l l cycl e i n t h e p r e se n ce o f g r o w t h f a ct o r s p r e s e n t i n e xt r a ct o r se r u m Z i e ske e t a l ( 6 4 ) h a ve sh o w n t h a t t h e ke r a t o cyt e s t h a t e n t e r t h e ce l l cycl e a r e t h o se i m m e d i a t e l y a d j a ce n t t o t h e c e l l vo i d sp a ce I n a cco r d a n c e w i t h W i l so n w h o h a s h yp o t h e si ze d t h a t a p o p t o si s i s t h e i n i t i a t i n g e ve n t o f t h e w o u n d h e a l i n g r e sp o n se ( 2 4 7 ) t h e y p r o p o se d a m o d e l i n w h i ch a p o p t o t i c ke r a t o cyt e s r e l e a se f a c t o r s i n t o t h e e xt r a ce l l u l a r e n vi r o n m e n t t h a t st i m u l a t e n e i g h b o r i n g ce l l s t o p r o l i f e r a t e ( 6 4 ) I n t h i s m o d e l t h e sa m e cyt o ki n e a t a h i g h co n ce n t r a t i o n w o u l d p r o d u ce a n a p o p t o t i c r e sp o n se a n d w h e n f o u n d i n a l o w co n ce n t r a t i o n a ct i v a t e ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e T o d e t e r m i n e i f t h e m i t o g e n i c a ct i o n o f t h e e xt r a ct w a s d u e t o a n a p o p t o t i c r e sp o n se d u r i n g e xt r a ct p r e p a r a t i o n t h e f r e sh l y i so l a t e d st r o m a s w e r e f r o ze n r a p i d l y o n d r y i ce p r i o r t o e xt r a ct i o n I t i s u n l i ke l y t h a t t h e ce l l s u n d e r g o a p o p t o t i c ce l l d e a t h i n t h e sh o r t

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1 3 5 p e r i o d o f t i m e b e t w e e n t h e i so l a t i o n o f t h e s t r o m a a n d t h e f r e e zi n g o n d r y i ce T h i s, h o w e ve r d i d n o t a f f e ct t h e p o t e n cy o f t h e e xt r a ct su g g e st i n g t h a t t h e m i t o g e n s a r e a l r e a d y p r e se n t i n t h e st r o m a a n d a r e n o t t h e r e su l t o f t h e h o m o g e n i za t i o n p r o ce d u r e T h i s o b se r va t i o n r e su l t e d i n a n o p t i m i ze d m e t h o d t o p r e p a r e st r o m a l e xt r a ct ( p r e se n t e d i n t h e a p p e n d i x) F u r t h e r m o r e t h e p r o ce ss b y w h i ch ce l l s a r e i so l a t e d f r o m t h e c o r n e a l st r o m a sh o u l d i n d u ce so m e ke r a t o cyt e s t o u n d e r g o a p o p t o t i c ce l l d e a t h I f ke r a t o cyt e s a r e a ct i va t e d b y t h i s a p o p t o t i c e ve n t t h e n t h e p l a t e d ce l l s s h o u l d p r o l i f e r a t e a t l e a st i n i t i a l l y, i n cu l t u r e Y e t t h i s i s n o t o b se r ve d K e r a t o cyt e s p l a t e d o u t i n D M E M / F 1 2 r e m a i n e d q u i e s ce n t a n d i n co r p o r a t e d n e g l i g i b l e a m o u n t s o f t h ym i d i n e ( S u p p l e m e n t F i g u r e 1 ) W h e n ke r a t o cyt e s w e r e p l a t e d a t l o w d e n si t y a n d cu l t u r e d i n t h e st r o m a l e xt r a ct t h e m i t o g e n i c r e s p o n se o f t h e ce l l s w a s e q u i va l e n t t o t h e r e sp o n s e o b s e r ve d i n se r u m b u t a si g n i f i ca n t r e d u ct i o n i n t h e m i t o g e n i c p o t e n cy o f t h e e xt r a ct w a s o b s e r ve d w h e n ce l l s w e r e p l a t e d a t i n t e r m e d i a t e o r h i g h d e n si t i e s A d d i t i o n a l l y, t h e B r d U i n co r p o r a t i o n st u d y sh o w s t h a t i n t h e m i cr o m a ss cu l t u r e s m o st i f n o t a l l t h e i n co r p o r a t i o n t a ke s p l a ce a t t h e p e r i p h e r y o f t h e cu l t u r e a n a r e a i n w h i ch t h e ke r a t o cyt e s a r e n o t i n cl o se co n t a ct w i t h o t h e r ce l l s. F u r t h e r m o r e ce l l cu l t u r e d a t a s h o w t h a t ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a ct g r o w t o a l o w e r f i n a l d e n si t y t h a n ce l l s cu l t u r e d i n se r u m e ve n t h o u g h t h e ce l l s a r e m a i n t a i n e d i n e xt r a ct a n d a r e st i l l e xp o se d t o t h e m i t o g e n T h e se r e su l t s i n d i ca t e t h a t k e r a t o cyt e s o n l y u n d e r g o m i t o si s i n e xt r a ct i f t h e y a r e n o t co n t a ct i n h i b i t e d b y o t h e r ce l l s. A l l t h i s e vi d e n ce su g g e st s t h a t i t i s t h e l o ss o f ce l l c e l l co n t a ct s a s a r e su l t o f ke r a t o cyt e a p o p t o si s t h a t

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1 3 6 a ct i va t e s t h e su r vi vi n g ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e a n d n o t t h e a ct u a l a p o p t o t i c e v e n t K e r a t o cyt e s i n t h e st r o m a a r e i n t e r co n n e ct e d b y l a m e l l i p o d i a b o t h w i t h i n t h e sa m e l a m e l l a e a n d t h r o u g h t h e l a m e l l a e I t i s t h e r e f o r e p o ssi b l e t h a t a f t e r w o u n d i n g d a m a g e d n e r ve c e l l s, o r e p i t h e l i a l ce l l s r e l e a se a n i n i t i a t o r o f a p o p t o si s, w h i ch a f f e ct s t h e n e i g h b o r i n g ke r a t o cyt e s. T h i s a p o p t o t i c si g n a l t h e n t r a ve l s t h r o u g h t h e st r o m a f r o m k e r a t o cy t e t o ke r a t o cyt e a w a y f r o m t h e i n j u r y si t e K e r a t o cyt e s e xp o se d t o a si g n a l l e ve l r e l e a se d f r o m t h e d yi n g ce l l s o ve r a t r e sh o l d l i m i t u n d e r g o a p o p t o t i c ce l l d e a t h A s t h e ce l l d e n si t y o f t h e a n t e r i o r st r o m a i s h i g h e r t h a n i n t h e m i d d l e a n d p o s t e r i o r st r o m a t h e su r f a ce i n su l t t o t h e co r n e a w o u l d r e s u l t i n a l a r g e r n u m b e r o f a n t e r i o r ke r a t o cyt e s u n d e r g o i n g a p o p t o si s. A s t h i s si g n a l t r a ve l s i n t o t h e m i d d l e a n d p o st e r i o r st r o m a t h e st r e n g t h o f t h e si g n a l w o u l d d e cr e a s e d u e t o t h e d e c r e a se i n ke r a t o cyt e d e n si t y i n t h e se p a r t s o f t h e st r o m a r e su l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f t h e b o w l sh a p e d ce l l vo i d sp a ce d e t e ct e d a f t e r w o u n d i n g W h e n t h e si g n a l i s t o o d i l u t e t o c a u se ce l l d e a t h t h e k e r a t o cyt e s a d j a ce n t t o t h i s sp a c e h a ve l o st t h e i r n e i g h b o r s a n d a r e n o l o n g e r co n t a ct i n h i b i t e d T h i s l e a d s t o t h e f o l l o w i n g m o d e l f o r ke r a t o cyt e a ct i va t i o n ( D i scu ssi o n F i g u r e 1 ) : C o r n e a l w o u n d i n g ca u se s t h e f o r m a t i o n o f a c e l l vo i d sp a c e b y n e cr o si s a n d / o r a p o p t o si s. T h e l o ss o f ke r a t o cyt e s n e a r t h e i n j u r y a r e a r e su l t s i n t h e l o ss o f ce l l ce l l co n t a ct s o f t h e ce l l s f l a n ki n g t h e w o u n d m a r g i n a n d i n co n se q u e n c e t h e l o ss o f co n t a ct i n h i b i t i o n T h e se ce l l s ca n n o w r e sp o n d t o t h e m i t o g e n s a l r e a d y p r e se n t i n t h e st r o m a T h e y b e co m e a ct i va t e d r e e n t e r t h e c e l l cycl e b e co m e m i g r a t o r y a n d u n d e r g o o n e r o u n d o f d i vi si o n S o m e o f t h e

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1 3 7 d a u g h t e r ce l l s w i l l b e co n t a ct i n h i b i t e d b y n e i g h b o r i n g ce l l s, a n d e xi t t h e ce l l cycl e T h e ce l l s a t t h e n e w ce l l u l a r m a r g i n h o w e ve r r e m a i n r e sp o n si ve t o t h e m i t o g e n s a n d co n t i n u e t o p r o l i f e r a t e a n d m i g r a t e T h i s p r o ce ss co n t i n u e s u n t i l t h e a d va n ci n g ce l l f r o n t s m e e t a t w h i ch p o i n t co n t a ct i n h i b i t i o n f o r c e s t h e c e l l s t o e xi t t h e ce l l cycl e a n d b e co m e q u i e sce n t a g a i n I f t h e m i t o g e n s f o u n d i n t h e st r o m a l e xt r a ct a r e i n d e e d t h e m i t o g e n s t h a t a ct i va t e ke r a t o cyt e s i n t h e i n i t i a l st a g e o f w o u n d h e a l i n g t h e n c u l t u r e i n t h e e xt r a ct w o u l d b e e xp e ct e d t o ca u se ch a n g e s si m i l a r t o t h o se o b s e r ve d d u r i n g co r n e a l w o u n d h e a l i n g T h e st r o m a s o f w o u n d e d co r n e a s d u r i n g t h e i n i t i a l p h a s e o f r e p a i r co n t a i n m o r e ch o n d r o i t i n su l f a t e t h a n ke r a t a n su l f a t e I f t h e m i t o g e n s p r e se n t i n t h e e xt r a ct a r e i n d e e d t h e m i t o g e n s t h a t a ct i va t e ke r a t o cyt e s i n vi v o ch o n d r o i t i n su l f a t e sy n t h e si s sh o u l d i n cr e a s e co m p a r a t i ve l y t o k e r a t a n su l f a t e syn t h e si s. A d d i n g e xt r a ct t o ke r a t o cyt e s st i m u l a t e d t o t a l su l f a t e i n co r p o r a t i o n p e r ce l l 1 1 f o l d w h e n co m p a r e d t o D M E M a l o n e ( S u p p l e m e n t F i g u r e 4 l e f t p a n e l ) M o st o f t h e i n co r p o r a t e d su l f a t e w a s se n si t i ve t o ch o n d r o i t i n a se A B C su g g e st i n g

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1 3 8 t h a t t h e i n cr e a se w a s i n ch o n d r o i t i n su l f a t e G A G s ( S u p p l e m e n t F i g u r e 4 r i g h t p a n e l ) W e st e r n b l o t s o f e xt r a ct o r t h e m e d i u m o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a ct d i d n o t d e t e ct b i g l yca n ( n o t sh o w n ) su g g e st i n g t h a t t h e i n c r e a se i s i n d e co r i n e xp r e ssi o n I t i s p o ssi b l e t h a t t h i s i n cr e a se i s d u e t o i n cr e a se d su l f a t i o n o f t h e G A G si d e ch a i n o r a n o ve r a l l i n cr e a se i n co r e p r o t e i n syn t h e si s. H o w e ve r i t i s a l so p o ssi b l e t h a t t h e d e t e r m i n a t i o n o f ke r a t a n su l f a t e c o n t e n t o f t h e c e l l s i n e xt r a ct i s t o o l o w a s t h e ke r a t a n su l f a t e a cc u m u l a t e d d u r i n g t h e w o u n d h e a l i n g r e sp o n se i s l e ss su l f a t e d ( 8 6 ) A ct i va t e d ke r a t o cyt e s co n t a i n si g n i f i ca n t l y l e ss A L D H w h e n co m p a r e d t o ke r a t o cyt e s a n d r e f l e ct m o r e l i g h t ( 8 5 ) i n cr e a si n g st r o m a l h a ze T h i s d e cr e a se i n cyt o so l i c A L D H co u l d b e t h e c o m b i n a t i o n o f b o t h d i l u t i o n o f t h e p r o t e i n a f t e r e a ch r o u n d o f d i vi si o n a n d d e g r a d a t i o n o f t h e A L D H vi a t h e u b i q u i t i n p a t h w a y ( 8 7 ) A co m p l e t e l o ss i n t h e l e ve l s o f c yt o so l i c A L D H w a s d e t e ct e d a f t e r e xt e n d e d c u l t u r e i n e xt r a c t C o m p a r e d t o t h e cyt o so l o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n D M E M a l o n e f o r 8 d a ys, t h e cyt o so l o f c e l l s cu l t u r e d i n e xt r a ct co n t a i n n o d e t e ct a b l e A L D H b a n d ( S u p p l e m e n t F i g u r e 5 B ) T h e i n t e n si t y o f t h e A L D H b a n d o f ce l l s cu l t u r e d i n e xt r a ct h a d d e c r e a se d co n si d e r a b l y b y d a y 4 a n d w a s g o n e b y d a y 8 I n h e a l e d co r n e a l w o u n d s, ke r a t o cyt e r e f l e ct i vi t y d e cr e a s e s o ve r t i m e a s h a ze su b si d e s, su g g e st i n g t h a t t h e i n t r a ce l l u l a r l e ve l s o f A L D H sh o u l d i n cr e a se o n ce ce l l s h a ve r e a ch e d co n f l u e n cy H o w e ve r st r o m a l h a ze i s a t t i m e s st i l l p r e se n t se ve r a l m o n t h s a f t e r co r n e a l w o u n d i n g su g g e st i n g t h a t t h i s r e co ve r y i s sl o w a n d m a y t a ke se ve r a l m o n t h s. T h e i n cr e a se d r e f l e ct i vi t y o f t h e ke r a t o cyt e s a f t e r w o u n d i n g e xp l a i n s t h e h a l o e f f e ct e xp e r i e n ce d a f t e r r e f r a ct i ve su r g e r y a n d

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1 3 9 t h a t e ve n t u a l l y su b si d e s. T h e i n vi vo w o u n d h e a l i n g o b se r va t i o n s su g g e st t h a t A L D H l e ve l s sh o u l d i n cr e a se i n t h e ce l l s cu l t u r e d i n e xt r a c t a f t e r t h e se ce l l s h a ve r e a ch e d c o n f l u e n c e b u t t h i s w a s n o t t e st e d b e yo n d t w o w e e ks I t i s kn o w n t h a t t h e a ct i va t e d ke r a t o cyt e s c a n b e co m e m yo f i b r o b l a st i c b y t h e a ct i o n o f T G F b b o t h i n vi vo a n d i n v i t r o ( 8 9 9 8 2 4 8 2 4 9 ) K e r a t o cyt e s a ct i va t e d b y e xt r a ct w e r e i n c u b a t e d i n t h e p r e se n ce o f e xt r a ct w i t h o r w i t h o u t 5 n g / m l T G F b f o r 8 d a ys. A ch a n g e i n m o r p h o l o g y b y t h e a ct i va t e d ke r a t o cyt e s w a s e vi d e n t b y d a y 4 ( S u p p l e m e n t f i g u r e 5 A ) I n st e a d o f m a i n t a i n i n g a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y a n d i n t e r c e l l u l a r sp a ci n g t h e se ce l l s a p p e a r e d m y o f i b r o b l a st i c a n d co ve r e d t h e cu l t u r e d i sh W e s t e r n b l o t s f o r t h e f i b r o t i c m a r ke r s f i b r o n e ct i n S P A R C a n d a S M A co n f i r m e d t h e p r e se n c e o f t h e se p r o t e i n s i n t h e s e cu l t u r e s a n d a l so t h e a b se n ce o f cyt o so l i c A L D H ( S u p p l e m e n t F i g u r e 5 B ) T G F b i s n o t u su a l l y p r e se n t i n t h e co r n e a l st r o m a b u t e n t e r s t h e st r o m a a f t e r d a m a g e t o t h e co r n e a l e p i t h e l i u m a n d d i s r u p t i o n o f t h e b a s e m e n t m e m b r a n e ( 2 5 0 ) E ye si g h t co r r e ct i ve su r g e r i e s i n vo l vi n g t h e a b l a t i o n o f t h e b a se m e n t m e m b r a n e l i ke p h o t o r e f r a ct i ve ke r a t e ct o m y ( P R K ) o f t e n a r e f o l l o w e d b y t h e d e ve l o p m e n t o f st r o m a l h a ze i n t h e p h o t o a b l a t e d a r e a ( 2 4 8 ) d u e t o t h e p r e se n ce o f m yo f i b r o b l a st i c ke r a t o cyt e s i n t h i s a r e a ( 9 5 ) I n co n t r a st m yo f i b r o b l a st i c ke r a t o cyt e s a f t e r l a s e r a ssi st e d ke r a t o m i l e u si s ( L A S I K ) su r g e r y, i f a t a l l p r e se n t a r e u su a l l y l i m i t e d t o t h e a r e a w h e r e t h e m i cr o ke r a t o m e cu t t h r o u g h t h e e p i t h e l i u m a n d t h e b a s e m e n t m e m b r a n e ( 1 0 4 ) w i t h n o n e b e i n g p r e s e n t i n t h e p h o t o a b l a t e d p o r t i o n o f t h e co r n e a ( 9 5 ) T h i s i n d i ca t e s t h a t t h e m yo f i b r o b l a st i c d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e a ct i va t e d ke r a t o cyt e s i s b r o u g h t o n b y t h e d i sr u p t i o n o f t h e

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1 4 0 b a se m e n t m e m b r a n e a n d t h e r e l e a se o f cyt o ki n e s f r o m t h e d a m a g e d e p i t h e l i u m T h i s d i sr u p t i o n a l l o w s t h e s e g r o w t h f a ct o r s t o e n t e r t h e st r o m a a ct o n t h e a ct i va t e d ke r a t o cyt e s a n d ca u se s t h e m t o a d o p t t h e m yo f i b r o b l a st i c p h e n o t yp e ( D i scu ssi o n F i g u r e 2 ) T h e m i t o g e n i c a ct i vi t y i n t h e e xt r a ct f r a ct i o n a t e d u n d e r p h ysi o l o g i c sa l t co n d i t i o n s b y g e l f i l t r a t i o n e l u t e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e T h e m o l e cu l a r w e i g h t o f m o st kn o w n g r o w t h f a ct o r s r a n g e b e t w e e n 6 3 0 kD b u t t h e m i t o g e n s i n t h e e xt r a ct e l u t e d a t o ve r 2 0 0 kD T h e e a se o f e xt r a ct i o n s u g g e st e d t h a t t h e m i t o g e n s w o u l d n o t b e ve r y t i g h t l y b o u n d i n t h e st r o m a a n d t h e r e f o r e sh o u l d b e a b l e t o d i f f u se t h r o u g h o u t t h e m a t r i x. T o t e st i f t h e m i t o g e n s w e r e p a r t o f a l a r g e r p r o t e i n c o m p l e x, t h e st r o m a l e x t r a ct w a s e x p o se d t o b o t h st r o n g d e n a t u r a n t s a n d N a C l a t i n c r e a si n g co n ce n t r a t i o n s. T h e p r e s e n ce o f h i g h sa l t sh i f t e d t h e e l u t i o n o f t h e m i t o g e n s b y o n e f r a ct i o n a n d b r o a d e n e d t h e p e a k ( S u p p l e m e n t F i g u r e 6 A ) su g g e st i n g t h a t m i t o g e n i c a ct i vi t y i n t h e e xt r a ct w a s p a r t o f a co m p l e x a n d w a s h e l d t o g e t h e r p a r t i a l l y b y ch a r g e ch a r g e i n t e r a ct i o n s. W h e n st r o n g d e n a t u r a n t s l i ke 4 M g u a n i d i n e o r 8 M u r e a w e r e u se d d u r i n g t h e

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1 4 1 f r a ct i o n a t i o n m o s t o f t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y o f t h e e x t r a ct w a s l o st a n d n o t r e co ve r e d ( n o t sh o w n ) T h i s s u g g e st s t h a t t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y o f t h e e xt r a ct i s i n p a r t d u e t o t h e co n ce r t e d a c t i o n o f t h e c o m p o n e n t s o f t h e co m p l e x. A d d i n g m i l d d e n a t u r i n g co n d i t i o n s a n d d e t e r g e n t t o p h ysi o l o g i c s a l t f i r st r e s u l t e d i n a si g n i f i ca n t b r o a d e n i n g o f t h e e l u t i o n p o si t i o n o f t h e m i t o g e n s, b u t i n cr e a si n g t h e sa l t co n ce n t r a t i o n e ve n t u a l l y r e so l v e d t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y i n t o t w o p e a ks ( F i g u r e 6 B ) T h e d i sso ci a t i o n o f t h e m i t o g e n i c co m p l e x i n 1 M u r e a su g g e st s t h a t t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t c o m p l e x co n t a i n i n g t h e m i t o g e n s i s a l s o h e l d t o g e t h e r b y p r o t e i n p r o t e i n i n t e r a c t i o n s. T h e p r o p o s a l t h a t t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y i n t h e e xt r a ct i s p a r t o f a l a r g e r co m p l e x i s f u r t h e r co n f i r m e d w h e n t h e e xt r a c t w a s f r a ct i o n a t e d b y h e r p a r i n se p h a r o se ( F i g u r e 7 ) W h e n n e a t e xt r a ct w a s f r a ct i o n a t e d o n t h e co l u m n m o st o f t h e a ct i vi t y d i d n o t t o b i n d t o t h e c o l u m n a n d e l u t e w i t h t h e p a ss t h r o u g h ( P T ) T h e f r a ct i o n s e l u t e d w i t h 0 5 M N a C l ( l o w sa l t L S ) o r t h e 2 M N a C l ( h i g h s a l t H S ) h a d l i t t l e st i m u l a t o r y a ct i vi t y o n t h e i r o w n W h e n co m b i n e d h o w e ve r t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n i n cr e a se d 7 f o l d o ve r t h e H S e l u a t e a n d 2 0 f o l d o ve r t h e L S e l u a t e i n d i ca t i n g a syn e r g i st i c e f f e ct i n cr e a s e o n a ct i vi t y. T h i s su g g e st s t h a t so m e o f t h e r e q u i r e d co m p o n e n t s o f t h e co m p l e x w e r e se p a r a t e d a n d e l u t e d i n t h e L S f r a ct i o n a n d i n t h e H S f r a ct i o n a n d t h a t t h e se co m p o n e n t s n e e d t o b e t o g e t h e r t o st i m u l a t e ce l l g r o w t h N o ch a n g e i n t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n w a s d e t e ct e d w h e n t h e f r a ct i o n e l u t e d i n L S w a s a d d e d t o t h e P T H o w e v e r w h e n t h e P T L S a n d H S f r a ct i o n s w e r e c o m b i n e d t h e co m b i n e d f r a ct i o n s st i m u l a t e d t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n m o r e t h a n 2 f o l d co m p a r e d t o t h e P T a l o n e a n d a t l e a s t 8 0 % m o r e t h a n t h e su m o f t h e P T L S a n d

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1 4 2 H S f r a ct i o n s ( a n d 5 0 % o ve r t h e su m o f t h e P T p l u s t h e L S + H S co m p l e x) su g g e st i n g t h a t co m p o n e n t s i n a l l t h r e e f r a ct i o n s a r e i m p o r t a n t a n d a c t syn e r g i st i ca l l y t o st i m u l a t e c e l l g r o w t h T a ki n g a l l ch r o m a t o g r a p h y d a t a o f t h e e xt r a ct t o g e t h e r su g g e st t h e f o l l o w i n g h yp o t h e si s. T h e co m p l e x co n t a i n i n g m i t o g e n i c a c t i vi t y i n t h e st r o m a l e xt r a ct i n t e r a ct s w i t h o t h e r co m p o n e n t s o f t h e m a t r i x vi a ch a r g e c h a r g e a n d p r o t e i n p r o t e i n i n t e r a ct i o n s. G i ve n t h e h i g h l e ve l s o f su l f a t e d G A G s i n t h e st r o m a i t i s p l a u si b l e t h a t t h e co m p l e x co n t a i n i n g t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y i s b o u n d t o p r o t e o g l yca n s. T h e s e p r o t e o g l yca n s d o n o t b i n d h e p a r i n a n d t h e r e f o r e a r e f o u n d i n t h e P T f r a ct i o n T h e b i n d i n g b y p a r t s o f t h e c o m p l e x t o t h e G A G si d e ch a i n s i s l i ke l y w e a k a n d ca n b e a f f e ct e d b y u si n g u r e a o r h i g h co n ce n t r a t i o n o f sa l t T h e r e f o r e I p r o p o se t h a t a t l e a st a p a r t o f t h i s co m p l e x ca n d i f f u se t h r o u g h t h e st r o m a b i n d i n g G A G si d e ch a i n s. T o su m m a r i ze t h e p r e se n ce o f a l l co m p o n e n t s o f t h e co m p l e x a n d t h e i r p r o p e r f o l d i n g a r e i m p o r t a n t f o r t h e ce l l u l a r i n t e r a ct i o n a n d l i ke l y d e t e r m i n e t h e m i t o g e n i c p o t e n cy o f t h e e xt r a ct a n d d i sr u p t i o n o f t h e c o m p l e x, o r o f i t s f o l d i n g a f f e ct s t h e ce l l u l a r r e sp o n se F G F 2 a n d P D G F B B h a ve b e e n sh o w n t o st i m u l a t e ke r a t o cyt e c e l l g r o w t h N e u t r a l i za t i o n st u d i e s, u si n g a n t i b o d i e s t o t h e se g r o w t h f a ct o r s w e r e p e r f o r m e d t o t e st w h e t h e r t h e se g r o w t h f a ct o r s w e r e r e sp o n si b l e f o r t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y f o u n d i n t h e e xt r a ct ( S u p p l e m e n t F i g u r e 8 ) T h e i n c u b a t i o n o f e xt r a ct w i t h n e u t r a l i zi n g a n t i b o d i e s t o F G F 2 o r P D G F B B d i d n o t a f f e ct t h e m i t o g e n i c p o t e n cy o f t h e e xt r a c t T h e se r e su l t s, co m b i n e d w i t h t h e m o r p h o l o g i ca l d a t a p u b l i sh e d i n t h e se co n d m a n u scr i p t su g g e st t h a t t h e a c t i vi t y

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1 4 3 i n e xt r a ct i s n o t d u e t o e i t h e r F G F 2 o r P D G F I m m u n o st a i n i n g h a s sh o w n t h a t t h e r e c e p t o r s f o r b o t h i n su l i n a n d I G F I a r e f o u n d i n t h e c o r n e a l st r o m a ( 1 7 1 2 5 1 ) W h i l e t h e i n su l i n r e ce p t o r i s sp e ci f i c, t h e I G F 1 r e ce p t o r b i n d s I G F I I G F I I a n d i n su l i n b u t w i t h va r yi n g a f f i n i t i e s C o n se q u e n t l y, i n su l i n a n d I G F I w e r e a l so t e st e d L i ke F G F 2 a n d P D G F B B I G F I w a s n o t d e t e ct e d i n t h e e xt r a ct b y W e st e r n b l o t n o r n e u t r a l i ze d b y i t s a n t i b o d y. T h e i n su l i n a n t i b o d y u se d i d n o t n e u t r a l i ze t h e a ct i vi t y o f p u r i f i e d i n su l i n a n d t h e a l t e r n a t i ve m e t h o d u se d t o d e t e r m i n e t h e i n su l i n co n t e n t s o f t h e e x t r a ct d i d n o t d e t e ct a n y ( d a t a n o t sh o w n ) A p o ssi b l e e xp l a n a t i o n f o r t h e n e g a t i ve r e su l t s o f t h e I G F I n e u t r a l i za t i o n i s t h e f a ct t h a t m e m b e r s o f t h e I G F f a m i l y a r e n o t u su a l l y f o u n d f r e e i n so l u t i o n T h e y b i n d s t r o n g l y t o o n e o f si x b i n d i n g p r o t e i n s ( I G F B P 1 6 ) a n d t h e se b i n d i n g p r o t e i n s b o t h st a b i l i ze a n d se q u e st e r t h e I G F s i n so l u t i o n ( 2 5 2 ) W h i l e t h e b i n d i n g o f I G F t o t h e b i n d i n g p r o t e i n ca n r e d u ce i t s m i t o g e n i c a ct i vi t y, so m e I G F B P s h a ve b e e n sh o w n t o e n h a n ce t h e a ct i vi t y o f I G F b y f a ci l i t a t i n g t h e b i n d i n g o f t h e m i t o g e n t o i t s r e c e p t o r ( 2 5 3 ) I G F B P 2 m R N A h a s b e e n d e t e ct e d i n t h e d e v e l o p i n g e ye ( 2 5 4 ) b u t n o t i n t h e m a t u r e co r n e a ( 2 5 2 2 5 5 ) H o w e ve r a r e ce n t st u d y sh o w s t h a t t h e e xp r e ssi o n o f I G F B P 3 i s i n cr e a se d d u r i n g t h e co r n e a l w o u n d h e a l i n g r e sp o n se ( 2 5 6 ) T h e e xi st e n ce o f a n I G F B P 3 r e ce p t o r h a s b e e n d e scr i b e d ( 2 5 3 ) b u t t h i s h a s n o t b e e n t e st e d i n ke r a t o cyt e s. B e ca u se o f t h e i r h i g h a f f i n i t y f o r e a c h o t h e r i t sh o u l d b e a ssu m e d t h a t i f I G F s w e r e p r e se n t i n t h e e xt r a ct t h e y w o u l d a l so b e b o u n d t o I G F B P s. T h i s b i n d i n g m a y h a ve i n t e r f e r e d w i t h t h e b i n d i n g o f t h e a n t i b o d y i n t h e n e u t r a l i zi n g st u d y. T h e

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1 4 4 b i n d i n g o f I G F s t o I G F B P s ca n r e s u l t i n t h e f o r m a t i o n o f h i g h m o l e cu l a r w e i g h t co m p l e xe s ( ~ 1 4 0 kD ) a n d i t h a s b e e n sh o w n t h a t I G F B P s ca n b i n d t o g l yco sa m i n o g l yca n s ( 2 5 7 ) T h i s o b s e r va t i o n w o u l d f i t t h e r e su l t s p r e se n t e d i n p a p e r 1 a n d a l s o i n t h e s u p p l e m e n t I d e n t i f i c a t i o n o f o n e o f t h e m i t o g e n s i n e x t r a c t I t i s kn o w n t h a t i n su l i n b e si d e s i n t e r a ct i n g w i t h i t s o w n i n su l i n r e ce p t o r h a s a f f i n i t y t o t h e I G F 1 R a l b e i t w i t h a l o w e r sp e ci f i ci t y t h a n I G F I o r I I D u e t o t h e h i g h co n ce n t r a t i o n s o f i n su l i n u se d i n t h e ce l l cu l t u r e m e d i u m i n p a p e r s 2 a n d 3 i t i s p o ssi b l e t h a t t h e a ct i vi t y o f i n su l i n i s t h e r e su l t o f a co m b i n e d a c t i va t i o n o f b o t h t h e i n su l i n r e c e p t o r a n d I G F 1 R E ve n t h o u g h t h e i n i t i a l W e st e r n b l o t f o r I G F I w a s n e g a t i ve a n d t h e I G F I a n t i b o d y d i d n o t n e u t r a l i ze t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y o f t h e e xt r a ct t h e e xt r a c t w a s r e e xa m i n e d f o r t h e p r e se n ce o f I G F I a n d I G F I I N e w a n t i b o d i e s t o I G F I a n d I G F I I w e r e o b t a i n e d a n d t h e W e st e r n b l o t s r e p e a t e d T h e W e st e r n b l o t u si n g a n t i b o d i e s t o I G F I w a s n e g a t i ve ( n o t sh o w n ) h o w e ve r t h e b l o t u si n g a n t i b o d i e s t o I G F I I s h o w e d t h a t I G F I I i s p r e se n t i n t h e e xt r a ct ( D i scu ssi o n F i g u r e 3 A ) F u r t h e r m o r e t h ym i d i n e i n c o r p o r a t i o n st u d i e s sh o w t h a t ke r a t o cyt e s a r e st i m u l a t e d b y I G F I I t o i n co r p o r a t e t h y m i d i n e i n a m a n n e r si m i l a r t o e xt r a ct ( D i scu ssi o n F i g u r e 3 B )

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1 4 5 N e xt t h e S 3 0 0 f r a ct i o n s co n t a i n i n g m i t o g e n i c a ct i vi t y w e r e a n a l yze d f o r I G F I I b y W e st e r n b l o t t i n g a n d t h e l a t e r e l u t i n g p e a k t h a t st i m u l a t e d t h y m i d i n e i n co r p o r a t i o n w a s p o si t i ve f o r I G F I I ( D i scu ss i o n F i g u r e 4 ) H o w e ve r n o I G F I I w a s d e t e ct e d i n t h e e a r l y e l u t i n g p e a k a n d t h e r e f o r e i t i s l i ke l y t h a t t h e se f r a ct i o n s co n t a i n d i f f e r e n t m i t o g e n s. T h e se r e s u l t s su g g e st s t h a t t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y, p r e se n t i n t h e st r o m a i s d u e t o a t l e a st t w o d i st i n ct m i t o g e n s, o n e o f w h i ch i s I G F I I

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1 4 6 I G F I I e xp r e ssi o n i n t h e co r n e a h o w e ve r w a s p r e vi o u sl y sh o w n t o o n l y t a ke p l a ce d u r i n g c o r n e a l d e ve l o p m e n t a n d n o t b y m a t u r e k e r a t o c y t e s. M a t u r e ke r a t o cyt e s, h o w e ve r e x p r e ss I G F B P s a s a r e su l t o f co r n e a l w o u n d i n g T h e o r i g i n o f t h e I G F I I i n t h e co r n e a l st r o m a t h e r e f o r e st i l l r e m a i n s u n k n o w n L e n s e p i t h e l i a l ce l l s h a ve b e e n sh o w n t o p r o d u ce I G F B P 2 ( 2 5 8 ) a n d I G F B P 2 i s p r e se n t i n t h e a q u e o u s h u m o r C e l l s i n t h e ci l i a r y b o d y h a v e a l so b e e n sh o w n t o m a ke I G F B P 2 a n d m a y a l so se cr e t e I G F I I i n t o t h e a q u e o u s h u m o r ( 2 5 4 ) A s t h e co r n e a i s a va sc u l a r a n d b e ca u se o f t h e l e a ky n a t u r e o f t h e e n d o t h e l i u m i t i s p o ssi b l e t h a t b o t h t h e I G F B P 2 a n d I G F I I f o u n d i n t h e st r o m a a r e o f l e n s o r ci l i a r y

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1 4 7 b o d y o r i g i n a n d a r e d i f f u si n g i n t o t h e s t r o m a f r o m t h e a q u e o u s. T h i s w o u l d e xp l a i n w h y t h e l e n s e xt r a ct h a d a st i m u l a t o r y e f f e ct o n k e r a t o cyt e s ( S u p p l e m e n t F i g u r e 3 ) A r e ce n t p u b l i ca t i o n h a s sh o w n t h a t d e co r i n b i n d s I G F I ( 2 5 9 ) b u t i t i s n o t kn o w n w h e t h e r i t ca n a l so b i n d I G F I I T h e I G F I I p r e se n t i n t h e st r o m a w o u l d l i ke l y b e b o u n d t o I G F B P s i n t h e st r o m a a n d t h i s c o m p l e x m a y b e a sso ci a t e d w i t h t h e G A G s i n t h e st r o m a S u ch a n a sso ci a t i o n w o u l d e xp l a i n t h e h i g h a p p a r e n t m o l e cu l a r w e i g h t o f t h e e xt r a ct e d m i t o g e n u n d e r n o n d i sso ci a t i n g co n d i t i o n s. C h r o m a t o g r a p h y i n b u f f e r c o n t a i n i n g h i g h sa l t o r m i l d d e n a t u r i n g co n d i t i o n s w o u l d r e su l t i n t h e p a r t i a l d i sso ci a t i o n o f t h e co m p l e x, e xp l a i n i n g t h e sh i f t i n t h e e l u t i o n p o si t i o n o f t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y. A t st r o n g d e n a t u r i n g co n d i t i o n s, t h e co m p l e x r e s p o n si b l e f o r t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y w o u l d n o t o n l y b e co m p l e t e l y d i sso ci a t e d b u t a l so i r r e ve r si b l y d e n a t u r e d a n d n o t a b l e t o st i m u l a t e t h ym i d i n e i n c o r p o r a t i o n T h i s w o u l d i n h i b i t t h e f o r m a t i o n o f t h e c o m p l e x, e ve n a f t e r d i a l ysi s a n d t h e r e f o r e i n h i b i t b i n d i n g t o p o ssi b l e su r f a ce r e ce p t o r s a n d a b o l i sh i t s m i t o g e n i c a ct i vi t y. I G F I I i s a g r o w t h f a ct o r u su a l l y a sso ci a t e d w i t h f e t a l d e ve l o p m e n t a n d h a s b e e n i d e n t i f i e d i n t h e co r n e a l st r o m a e a r l y i n d e ve l o p m e n t T h e e xp r e ssi o n o f I G F I I m R N A d e cr e a s e s a s t h e m e se n ch ym a l ce l l s b e co m e ke r a t o cyt e s ( 2 6 0 2 6 1 ) a n d n o e xp r e ssi o n i s f o u n d b y ke r a t o cyt e s i n t h e m a t u r e co r n e a U n l i ke o t h e r w o u n d s i n t h e b o d y, w h i ch u su a l l y r e su l t i n sca r t i ssu e m a n y co r n e a l w o u n d s r e c o ve r a d e g r e e o f o r g a n i za t i o n a f t e r w o u n d i n g t h a t i s si m i l a r t o t h e E C M p r i o r t o t h e w o u n d i n g e ve n t a n d l i t t l e e vi d e n ce o f a sca r r e m a i n s ( 4 3 1 2 7 ) C i n t r o n e t a l a l so o b se r ve d t h a t d u r i n g t h e h e a l i n g o f a f u l l t h i ckn e ss

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1 4 8 w o u n d i n a yo u n g r a b b i t t h e e ve n t s t a ki n g p l a ce i n t h e st r o m a a p p e a r t o r e cr e a t e t h e e ve n t s o f e a r l y co r n e a l d e ve l o p m e n t a n d t h e g e n e r a t i o n o f co r n e a l t r a n sp a r e n cy ( 3 4 3 1 2 7 ) I t i s t h e r e f o r e i n t e r e st i n g t o h a v e i d e n t i f i e d t h a t t h e co r n e a co n t a i n s a g r o w t h f a ct o r t h a t i s n o r m a l l y i n vo l ve d i n t h e d e ve l o p m e n t o f t h e e ye a n d t h a t i n t h e a d u l t t i ssu e m a y b e r e sp o n si b l e f o r t h e i n i t i a t i o n o f t h e w o u n d h e a l i n g r e sp o n se I G F I I i s a m e m b e r o f t h e i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r f a m i l y ( 2 6 2 ) I t h a s a m o l e cu l a r w e i g h t o f ~ 7 5 kD a a n d sh a r e s ~ 7 5 % se q u e n ce h o m o l o g y w i t h I G F I ( 2 6 3 ) I G F I I ca n b i n d t o t h r e e e xt r a ce l l u l a r r e ce p t o r s ( 2 6 2 2 6 4 ) I t b i n d s t o b o t h t h e I G F 1 R a n d a sp e ci f i c sp l i ce va r i a n t o f t h e i n su l i n r e ce p t o r ( 2 6 4 ) I G F I I a l s o i n t e r a ct s w i t h a t h i r d r e ce p t o r t h e m a n n o se 6 p h o sp h a t e r e ce p t o r / I G F I I r e ce p t o r h o w e ve r t h i s r e ce p t o r a ct s o n l y a s a cl e a r a n ce r e ce p t o r r e m o vi n g I G F I I f r o m t h e e xt r a ce l l u l a r e n vi r o n m e n t a n d d o e s n o t p a r t i ci p a t e i n g r o w t h f a ct o r si g n a l i n g ( 2 6 2 ) B o t h t h e I G F 1 R a n d t h e i n su l i n r e ce p t o r s a r e t yr o si n e ki n a se r e ce p t o r s co m p o se d o f t w o i d e n t i c a l a a n d b s u b u n i t s ( 2 6 5 ) U p o n b i n d i n g o f I G F I I t o t h e I G F 1 R t h e t r a n s m e m b r a n e b s u b u n i t s a u t o p h o sp h o r yl a t e a n d t h e n se r ve a s d o cki n g si t e s f o r i n su l i n r e ce p t o r su b st r a t e ( 2 6 2 ) a n d S h c a d a p t o r p r o t e i n s ( 2 6 4 ) T h e I G F s r e g u l a t e m a n y d i f f e r e n t si g n a l i n g p a t h w a ys, f o r e xa m p l e t h e y ca n r e cr u i t p h o sp h a t yd i l i n o si t o l 3 ki n a se ( P I 3 ki n a se ) ( 2 6 5 ) w h i ch w o u l d t h e n a ct i va t e t h e m i t o g e n a ct i va t e d p r o t e i n ki n a se ( M A P ki n a se ) a n d P I 3 ki n a se ca sca d e s ( 2 6 5 ) e ve n t u a l l y l e a d i n g t o t h e t r a n scr i p t i o n o f s p e ci f i c g e n e s i m p o r t a n t f o r c e l l su r vi va l d i f f e r e n t i a t i o n o r p r o l i f e r a t i o n ( 2 6 2 2 6 4 2 6 5 )

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1 4 9 C O N C L U D I N G R E M A R K S T h r e e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e s h a v e b e e n o b se r ve d i n vi v o T h e i n si t u q u i e sce n t ke r a t o cyt e t h e a ct i va t e d ke r a t o c yt e i n vo l ve d i n t h e i n i t i a l st a g e o f w o u n d h e a l i n g a n d t h e m yo f i b r o b l a st i c ke r a t o cyt e r e sp o n si b l e f o r t h e d e p o si t i o n o f t h e f i b r o t i c E C M T h e a i m s o f t h i s d i sse r t a t i o n w e r e t o d e ve l o p cu l t u r e m e d i a t h a t w o u l d a l l o w t h e st u d y o f t h e se p h e n o t yp e s. I n t h e co u r se o f t h i s st u d y t h r e e m a j o r f i n d i n g s w e r e m a d e T h e f i r st f i n d i n g i s t h a t t h e p r e se n ce o f se r u m a t p l a t i n g o r d u r i n g cu l t u r e a l t e r s t h e r e sp o n se o f ke r a t o cyt e s t o g r o w t h f a ct o r s, w i t h o u t a f f e ct i n g t h e ce l l u l a r m o r p h o l o g y. C o n se q u e n t l y, t h e p r e se n c e o f se r u m e ve n a t l o w co n ce n t r a t i o n s m o d i f i e s t h e ce l l u l a r r e sp o n se t o cyt o ki n e s a n d t h e r e f o r e sh o u l d n o t b e u se d t o cu l t u r e ke r a t o cyt e s. I L 1 w h i ch w a s sh o w n t o i n d u ce a p o p t o si s o f co r n e a l f i b r o b l a st s ( ke r a t o cyt e s i n se r u m ) ( 1 0 7 ) f a i l s t o d o so i n a n d a ct u a l l y st i m u l a t e s g r o w t h o f q u i e sce n t ke r a t o cyt e s ( 1 6 2 ) T h e se co n d f i n d i n g i s t h a t t h e co r n e a l st r o m a i s p r e l o a d e d w i t h m i t o g e n s a n d t h a t t h e se m i t o g e n s a r e n o t se cr e t e d b y ke r a t o cy t e s d u r i n g a p o p t o si s. T h e se m i t o g e n s a r e p r o t e i n s, ca n d i f f u se t h r o u g h o u t t h e st r o m a a r e d i f f e r e n t f r o m t h e m i t o g e n s f o u n d i n se r u m a n d a r e p a r t o f a l a r g e co m p l e x a t p h ysi o l o g i ca l sa l t c o n ce n t r a t i o n s. T h i s c o m p l e x i s p a r t i a l l y h e l d t o g e t h e r b y i o n i c

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1 5 0 i n t e r a ct i o n s, su g g e s t i n g t h a t i t ca n b i n d t o G A G s i n t h e st r o m a a n d a l so h e l d t o g e t h e r b y p r o t e i n p r o t e i n i n t e r a ct i o n s C u l t u r e o f ke r a t o cyt e s w i t h t h e st r o m a l e xt r a ct r e p l i ca t e s t h e ch a n g e s o b se r ve d i n k e r a t o cyt e s b o t h i n vi vo a n d i n vi t r o d u r i n g t h e a ct i va t i o n p r o ce ss. T h e se m i t o g e n s st i m u l a t e su l f a t e i n co r p o r a t i o n b u t so m e o f t h e i n c r e a se i n su l f a t e syn t h e si s m a y b e d u e t o t h e p r e s e n ce o f B S A o r p r o t e i n s i n t h e e xt r a ct sh i e l d i n g t h e n e w l y syn t h e si ze d p r o t e i n s f r o m d e g r a d a t i o n I G F I I a m e m b e r o f t h e i n s u l i n l i ke g r o w t h f a ct o r f a m i l y, w a s d e t e ct e d i n o n e o f t h e h i g h m o l e cu l a r w e i g h t p e a ks co n t a i n i n g a ct i vi t y i n t h e e xt r a ct I t w a s n o t h o w e ve r f o u n d i n t h e f i r s t p e a k, su g g e st i n g t h a t t h e co r n e a l st r o m a m a y co n t a i n m o r e t h a n o n e m i t o g e n r e sp o n si b l e f o r t h e a ct i va t i o n o f t h e ke r a t o cyt e s a f t e r w o u n d i n g K e r a t o cyt e s o n l y e xp r e ss I G F I I d u r i n g t h e e a r l y d e ve l o p m e n t o f t h e co r n e a a n d n o t a t m a t u r i t y ( 2 6 1 ) so t h e I G F I I d e t e ct e d i n st r o m a l e xt r a ct m a y h a ve b e e n m a d e e a r l i e r T h e t h i r d f i n d i n g i s t h a t m e d i u m co n t a i n i n g i n su l i n su p p l e m e n t e d w i t h a sco r b a t e ca n b e u se d t o g r o w ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e a n d m a i n t a i n t h e i r n o r m a l p h e n o t yp e I n su l i n st i m u l a t e d t h e syn t h e si s o f co l l a g e n a n d a sco r b a t e i s n e ce ssa r y f o r p r o p e r co l l a g e n f o l d i n g w h i ch i n t u r n i n cr e a se d t h e a ccu m u l a t i o n o f t h e K S P G s t h a t a ccu m u l a t e w i t h c o l l a g e n a s w e l l I n h i b i t i n g co l l a g e n h yd r o xyl a t i o n e l i m i n a t e d b o t h i n c r e a se s, i n d i ca t i n g t h a t f o r m a t i o n o f a st a b l e t r i p l e h e l i x b y co l l a g e n s i s i m p o r t a n t f o r t h e syn t h e si s a n d st a b i l i t y o f co l l a g e n s a n d o f t h e se p r o t e o g l yca n s. K e r a t a n s u l f a t e p r o t e o g l yc a n s a r e i m p o r t a n t f o r t h e p r o p e r a sse m b l y o f co l l a g e n i n t o f i b r i l s n e e d e d f o r t h e m a i n t e n a n ce o f st r o m a l t r a n sp a r e n cy.

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1 5 1 T h i s r e se a r ch sh o w s t h a t ke r a t o cyt e s ca n b e g r o w n i n cu l t u r e m e d i u m su p p l e m e n t e d w i t h i n su l i n a n d a sco r b a t e a n d m a i n t a i n t h e i r p h e n o t yp e C u l t u r e i n m e d i u m co n t a i n i n g st r o m a l e xt r a ct r e cr e a t e s i n vi t r o t h e p h e n o t yp e s o b s e r ve d i n vi vo i n t h e i n i t i a l p h a se o f t h e w o u n d h e a l i n g r e sp o n se a n d e xt r a ct su p p l e m e n t e d w i t h T G F B r e cr e a t e s t h e m y o f i b r o b l a st i c p h e n o t yp e A l t h o u g h I G F I I w a s i d e n t i f i e d a s o n e o f t h e m i t o g e n s i n t h e st r o m a l e xt r a c t i t i s l i ke l y t h a t o t h e r m i t o g e n s a r e st i l l p r e se n t I G F I I h o w e ve r ca n n o w b e r e c o g n i ze d a s o n e o f t h e n a t u r a l m i t o g e n s i n t h e co r n e a a n d i t s a ct i o n o n ke r a t o cyt e s b e st u d i e d i n cu l t u r e S t r o m a l e xt r a ct l i ke se r u m i s a co m p l e x m e d i u m b u t d u e t o t h e n a t u r e o f i t s o r i g i n co n t a i n s t h e co m p o n e n t s o f t h e l i q u i d s t h a t b a t h e t h e k e r a t o cyt e s i n si t u T h e r e f o r e i t sh o u l d b e u se d p r e f e r e n t i a l l y t o F B S t o a ct i va t e ke r a t o cyt e s i n vi t r o T h e r e su l t s o b t a i n e d b y cu l t u r e i n e xt r a ct a l so su g g e st t h a t u n l i ke A L D H a n d ke r a t o ca n a n d co n t r a r y t o w h a t h a s b e e n r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e ke r a t o cyt e m o r p h o l o g y sh o u l d n o t b e co n si d e r e d a m a r ke r so l e l y f o r t h e q u i e sce n t p h e n o t yp e F u t u r e d i r e c t i o n s T h e r e se a r ch p r e se n t e d i n t h i s d i sse r t a t i o n i s o n l y i n i t s i n i t i a l p h a se s. S e ve r a l q u e s t i o n s r e m a i n o p e n a n d o u g h t t o b e st u d i e d f u r t h e r T h e e xa ct n a t u r e a n d t h e c e l l u l a r o r i g i n o f t h e co m p l e x co n t a i n i n g t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y i n t h e st r o m a i s n o t kn o w n T h e i d e n t i f i ca t i o n o f t h e co m p o n e n t s o f t h e co m p l e x, b y p r o t e o m i c, ch r o m a t o g r a p h i c o r o t h e r m e t h o d s i s i m p o r t a n t a n d w i l l p r o vi d e r e se a r ch e r s w i t h a p o ssi b l e e xp l a n a t i o n f o r i t s o r i g i n a n d i t s m e ch a n i sm o f a ct i o n

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1 5 2 T h e a ct i va t i o n o f ke r a t o cyt e s d u r i n g t h e w o u n d h e a l i n g r e s p o n se h a s b e e n e xt e n si ve l y r e p o r t e d a n d st u d i e d i n vi t r o T h e m e ch a n i sm a n d t h e m i t o g e n s i n vo l ve d i n t h e a ct i v a t i o n h o w e ve r a r e n o t kn o w n a s o f t h i s w r i t i n g T h e i d e n t i f i ca t i o n o f I G F I I a s o n e o f t h e m i t o g e n s p r e se n t i n t h e st r o m a i s e n co u r a g i n g a s I G F I I w a s sh o w n t o r e p l i ca t e t h e p r o l i f e r a t i o n o b se r v e d i n e xt r a ct b u t t h e f a i l u r e t o d e t e ct I G F I I i n t h e f i r st p e a k, co n t a i n i n g m o st o f t h e m i t o g e n i c a ct i vi t y i n d i ca t e s t h a t o t h e r m i t o g e n s p l a y a r o l e O n ce t h e m i t o g e n s, a n d t h e co m p o n e n t s o f t h e c o m p l e x a r e i d e n t i f i e d t h e n t h e d i sse ct i o n o f t h e a ct u a l m e c h a n i sm o f a ct i o n ca n b e g i n W h a t a r e t h e ce l l u l a r o r i g i n s o f t h e co m p o n e n t s o f t h e m i t o g e n i c co m p l e x? A r e ke r a t o cyt e s i n t e r a ct i n g w i t h t h e m i t o g e n i c co m p l e x co n st a n t l y, a n d p r e ve n t e d f r o m r e sp o n d i n g t o i t b y t h e d o w n r e g u l a t i o n o f s i g n a l i n g i n t e r m e d i a t e s b e ca u s e o f co n t a ct i n h i b i t i o n ? I t i s l i ke l y t h a t t h e q u i e sce n ce o f t h e ke r a t o cyt e s o b se r ve d i n t h e u n w o u n d e d st r o m a i s j u st t h e r e su l t o f t h e n e t w o r k o f ce l l s r e su l t i n g i n co n t a ct i n h i b i t i o n O n ce t h e co m p o n e n t s o f t h e c o m p l e x h a ve b e e n i d e n t i f i e d t h e n i m m u n o h i st o ch e m i st r y st u d i e s co u l d sh o w w h e r e t h e c o m p l e x i s l o ca t e d i n t h e st r o m a a n d w h a t i t s r e l a t i o n t o t h e ke r a t o cyt e s i s. C o u l d t h e co m p l e x r e q u i r e p r o t e o l yt i c cl e a va g e b y ke r a t o cyt e s t o b e co m e f u l l y a ct i ve ? T h i s w o u l d b e e s p e ci a l l y i n t e r e st i n g a s t h e r e s e a r ch p r e se n t e d i n t h i s d i sse r t a t i o n h a s sh o w n t h a t ke r a t o cyt e s d e g r a d e t h e p r o t e o g l yca n s t h e y se cr e t e w h e n p l a t e d a t l o w d e n si t y. T h e a ct i vi t y o f t h e e xt r a ct i s b o t h d o se d e p e n d e n t a n d ce l l d e n si t y d e p e n d e n t A g a i n t h e i d e n t i f i ca t i o n o f t h e co m p o n e n t s o f t h e e x t r a ct i s i m p o r t a n t t o d e t e r m i n e i f t h i s m a y b e g o i n g o n

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1 5 3 H o w e ve r p r e l i m i n a r y st u d i e s u si n g e xt r a ct s o n ce l l s i so l a t e d f r o m ca r t i l a g e sh o w e d t h a t m i t o g e n s i n e xt r a ct a l so st i m u l a t e d ce l l u l a r p r o l i f e r a t i o n i n so m e o f t h o se ce l l s. T h i s p r o l i f e r a t i o n m a y b e d u e t o t h e a ct i vi t y o f I G F I I a n d n o t o f t h e o t h e r m i t o g e n s p r e se n t i n e xt r a ct K e r a t o cyt e s c o n t a i n f a ct i n f i l a m e n t s, w h i ch a r e r e o r g a n i ze d a s t h e r e su l t o f a ct i va t i o n I m m u n o f l u o r e sce n ce st u d i e s st a i n i n g f o r f o ca l a d h e si o n s a n d f a ct i n w o u l d sh o w i f t h i s i s o ccu r r i n g i n t h e ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a ct o r i n su l i n A ct i va t e d ke r a t o cyt e s b e si d e s b e i n g p r o l i f e r a t i ve a r e m i g r a t o r y. K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e xt r a ct e xp r e ss t h e a 5 b 1 i n t e g r i n i m p o r t a n t f o r t h e m i g r a t i o n o f c e l l s o n a f i b r o n e ct i n m a t r i x. W i t h a p r o p e r e xp e r i m e n t a l se t u p i t w o u l d b e p o ssi b l e t o d e t e ct a n d m e a su r e ce l l m i g r a t i o n i n t h e p r e se n c e o f e xt r a ct w i t h o u t h a vi n g t o u se m e t h o d s t h a t b l o ck c e l l p r o l i f e r a t i o n O n ce a p r o p e r e xp e r i m e n t a l m e t h o d i s d e ve l o p e d i t w i l l b e p o ssi b l e t o d e t e ct w h e t h e r t h e m i g r a t i n g ke r a t o cyt e s e xp r e ss p r o t e o l yt i c e n zym e s su ch a s M T 1 M M P a t t h e l e a d i n g e d g e I G F I I w a s i d e n t i f i e d a s o n e o f t h e m i t o g e n s i n t h e e xt r a ct T h e d a t a su g g e st h o w e ve r t h a t a n o t h e r m i t o g e n m a y b e p r e se n t i n t h e st r o m a l e xt r a ct a s w e l l T h i s d i sco ve r y i s r a t h e r n e w a n d st i l l n e e d s t o b e e xa m i n e d i n m o r e d e t a i l I t i s p o ssi b l e t h a t I G F I I m a y o n l y st i m u l a t e t h e ce l l s t o p r o l i f e r a t e a n d n o t r e s u l t i n t h e o t h e r p h e n o t yp i c ch a n g e s o b se r ve d i n a ct i va t e d ke r a t o cyt e s. I f t h i s w e r e t h e ca se t h e n m e d i u m co n t a i n i n g I G F I I a s w e l l a s a sc o r b a t e i n st e a d o f m e d i u m co n t a i n i n g i n su l i n a n d a sc o r b a t e sh o u l d b e u s e d t o e xp a n d ke r a t o cyt e p o p u l a t i o n s i n vi t r o

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1 5 4 A n i m p o r t a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e g r o w t h i n e xt r a ct a n d t h e g r o w t h i n t h e p u r i f i e d g r o w t h f a ct o r s i s t h a t t h e ce l l s i n e xt r a ct g r o w a t a ve r y f a st r a t e K e r a t o cyt e s c u l t u r e d i n g r o w t h f a ct o r s, i n c o n t r a st g r o w a t a sl o w e r co n st a n t r a t e I s t h e m a i n t e n a n ce o f t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e d e p e n d e n t o n t h e r a t e o f g r o w t h ? I t co u l d b e a r g u e d t h a t t h e r a p i d r e p o p u l a t i o n o f t h e st r o m a a f t e r w o u n d i n g i s a n i m p o r t a n t e v o l u t i o n a r y ch a r a ct e r i st i c. A sl o w e r r a t e o f g r o w t h w i t h t h e m a i n t e n a n c e o f t h e ke r a t o cyt e m a r k e r s, m a y b e m o r e i m p o r t a n t i n t h e r e p o p u l a t i o n o f t h e st r o m a d u e t o l e sse r ce l l d e a t h T h i s n e e d s t o b e f u r t h e r st u d i e d a n d i f d e t e r m i n e d m a y si g n i f i ca n t l y m o ve f o r w a r d t h e d e ve l o p m e n t o f a r t i f i ci a l t i ssu e T h e ce l l s, f o r e xa m p l e co u l d b e g r o w n i n m e d i u m co n t a i n i n g e xt r a ct i n t h e i n i t i a l p h a se a n d t h e n t h e m e d i u m sl o w l y e xch a n g e d w i t h m e d i u m co n t a i n i n g i n s u l i n a n d a sco r b a t e ( o r I G F I I a n d a sco r b a t e ) T h i s w o u l d t h e n st i m u l a t e t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e e v e n t h o u g h t h e ce l l s w o u l d st i l l b e d i vi d i n g a l b e i t a t a sl o w e r r a t e T h e e x a ct m e ch a n i sm o f a sco r b a t e i n d u ce d K S P G syn t h e si s r e q u i r e s f u r t h e r e l u ci d a t i o n O u r e xp e r i m e n t a l se t u p d o e s n o t p r o vi d e a se q u e n ce o f e ve n t s f o r t h i s u p r e g u l a t i o n I t i s p o ssi b l e t h a t t h e p r o p e r l y f o l d e d co l l a g e n i s se cr e t e d i n t o t h e m e d i u m b i n d s t o i n t e g r i n r e ce p t o r s o n t h e ce l l u l a r su r f a ce a n d t h e n u p r e g u l a t e s K S P G syn t h e si s. I t i s a l so p l a u si b l e t h a t t h e n e w l y syn t h e si ze d p r o t e o g l yc a n s a r e i n t e r a ct i n g w i t h t h e n a sce n t p r o co l l a g e n ch a i n s i n t h e E R a n d a r e p r o t e ct e d f r o m i n t r a ce l l u l a r d e g r a d a t i o n b y t h i s i n t e r a ct i o n F u t u r e st u d i e s m a y se e k t o f o cu s o n t h e se o b se r v a t i o n s, a n d d e t e r m i n e t h e se q u e n c e o f e v e n t s.

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1 5 5 R e ce n t st u d i e s h a ve sh o w n t h a t p r i m a r y ke r a t o cyt e s ca n b e g r o w n i n p e l l e t cu l t u r e s ( 2 6 6 2 6 7 ) a n d d o n o t l o se t h e e xp r e ssi o n o f ke r a t o ca n e ve n i f g r o w n i n t h e p r e s e n ce o f se r u m I n t h e p e l l e t cu l t u r e s, t h e c e l l s se cr e t e a n d f o r m a n e xt r a c e l l u l a r m a t r i x. D a t a p r e se n t e d a t F u n d e r b u r g h e t a l ( 2 6 8 ) a t t h e A sso ci a t i o n f o r R e se a r ch i n V i si o n a n d O p h t h a l m o l o g y h e l d i n F o r t L a u d e r d a l e i n 2 0 0 6 sh o w t h a t t h e co l l a g e n f i b r i l s a ccu m u l a t e d b y ke r a t o cyt e s a p p e a r t o f o r m l a m e l l a e i n vi t r o F u t u r e st u d i e s sh o u l d t r y t o b l e n d ke r a t o cyt e cu l t u r e i n ce l l p e l l e t s w i t h t h e a sco r b a t e su p p l e m e n t e d g r o w t h m e d i u m h e r e d e v e l o p e d A m n i o t i c m e m b r a n e h a s a l so b e e n u se d t o g r o w ke r a t o cyt e s i n vi t r o a n d m a i n t a i n t h e i r p h e n o t y p e ( 2 6 9 ) A s t h e a m n i o t i c m e m b r a n e s u r r o u n d s t h e d e ve l o p i n g f e t u s, i t m a y co n t a i n I G F I I a n d a s co n t a i n s a n e xt r a c e l l u l a r m a t r i x, w h i ch m a y co n t a i n o t h e r co m p o n e n t s t h a t a r e i m p o r t a n t f o r t h e p r o p e r co n f o r m a t i o n o f t h e a ct i v e f a ct o r s i n e xt r a ct

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1 5 6 R E F E R E N C E S 1 H a y, E D ( 1 9 7 9 ) D e ve l o p m e n t o f t h e v e r t e b r a t e co r n e a I n t R e v C yt o l 6 3 2 6 3 3 2 2 2 Z i e ske J. D ( 2 0 0 4 ) C o r n e a l d e v e l o p m e n t a ss o ci a t e d w i t h e ye l i d o p e n i n g I n t J D e v B i o l 4 8 ( 8 9 ) 9 0 3 9 1 1 3 C i n t r o n C S za m i e r R B H a ssi n g e r L C a n d K u b l i n C L ( 1 9 8 2 ) S ca n n i n g e l e ct r o n m i cr o sco p y o f r a b b i t co r n e a l sca r s I n ve s t O p h t h a l m o l V i s S ci 2 3 ( 1 ) 5 0 6 3 4 C o n r a d G W ( 1 9 7 0 ) C o l l a g e n a n d m u co p o l y sa cch a r i d e b i o syn t h e si s i n t h e d e ve l o p i n g ch i ck co r n e a D e v B i o l 2 1 ( 3 ) 2 9 2 3 1 7 5 C h a kr a va r t i S M a g n u so n T L a ss, J. H Je p se n K J. L a M a n t i a C a n d C a r r o l l H ( 1 9 9 8 ) L u m i ca n r e g u l a t e s co l l a g e n f i b r i l a ss e m b l y: ski n f r a g i l i t y a n d c o r n e a l o p a ci t y i n t h e a b s e n ce o f l u m i ca n J C e l l B i o l 1 4 1 ( 5 ) 1 2 7 7 1 2 8 6 6 S o n g J. L e e Y G H o u st o n J. P e t r o l l W M C h a kr a va r t i S C a va n a g h H D a n d J e st e r J V ( 2 0 0 3 ) N e o n a t a l co r n e a l st r o m a l d e ve l o p m e n t i n t h e n o r m a l a n d l u m i ca n d e f i ci e n t m o u s e I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 4 ( 2 ) 5 4 8 5 5 7 7 B e e ch e r N C h a kr a va r t i S Jo yce S M e e k, K M a n d Q u a n t o ck, A J. ( 2 0 0 6 ) N e o n a t a l d e ve l o p m e n t o f t h e c o r n e a l s t r o m a i n w i l d t yp e a n d l u m i ca n n u l l m i ce I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 7 ( 1 ) 1 4 6 1 5 0 8 D u n l e vy, J. R B e a l e s, M P B e r r y h i l l B L C o r n u e t P K a n d H a sse l l J. R ( 2 0 0 0 ) E xp r e ssi o n o f t h e ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yc a n s l u m i ca n ke r a t o ca n a n d o s t e o g l yci n / m i m e ca n d u r i n g ch i ck co r n e a l d e ve l o p m e n t E xp E ye R e s 7 0 ( 3 ) 3 4 9 3 6 2 9 F u n d e r b u r g h J. L C a t e r s o n B a n d C o n r a d G W ( 1 9 8 6 ) K e r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n d u r i n g e m b r yo n i c d e ve l o p m e n t o f t h e ch i cke n co r n e a D e v B i o l 1 1 6 ( 2 ) 2 6 7 2 7 7

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1 5 7 1 0 I m a n i sh i J. K a m i ya m a K I g u ch i I K i t a M S o t o zo n o C a n d K i n o sh i t a S ( 2 0 0 0 ) G r o w t h f a ct o r s: i m p o r t a n ce i n w o u n d h e a l i n g a n d m a i n t e n a n ce o f t r a n sp a r e n cy o f t h e c o r n e a P r o g R e t i n E ye R e s 1 9 ( 1 ) 1 1 3 1 2 9 1 1 C o u r vi l l e C B S m o l e k, M K a n d K l yce S D ( 2 0 0 4 ) C o n t r i b u t i o n o f t h e o cu l a r su r f a ce t o vi su a l o p t i cs E x p E ye R e s 7 8 ( 3 ) 4 1 7 4 2 5 1 2 L e m p M A a n d B l a ckm a n H J. ( 1 9 8 1 ) O cu l a r su r f a ce d e f e n se m e ch a n i sm s A n n O p h t h a l m o l 1 3 ( 1 ) 6 1 6 3 1 3 V a n n a s, A H o g a n M J. a n d W o o d I ( 1 9 7 5 ) S a l zm a n n s n o d u l a r d e g e n e r a t i o n o f t h e co r n e a A m J O p h t h a l m o l 7 9 ( 2 ) 2 1 1 2 1 9 1 4 K i n n e a r F B ( 2 0 0 4 ) A ca n t h a m o e b a p a t h o g e n i ci t y f o r co r n e a l ce l l s J I n f e ct 4 9 ( 4 ) 3 1 0 3 1 6 1 5 K u r p a ku s W h e a t e r M K e r n a cki K A a n d H a zl e t t L D ( 2 0 0 1 ) M a i n t a i n i n g c o r n e a l i n t e g r i t y h o w t h e w i n d o w st a ys cl e a r P r o g H i st o ch e m C yt o ch e m 3 6 ( 3 ) 1 8 5 2 5 9 1 6 S a sa ki H Y a m a m u r a K M u ka i T N i sh i d a K N a ka m u r a J. N a ka sh i m a M a n d I ch i ka w a M ( 1 9 9 9 ) E n h a n ce m e n t o f o cu l a r d r u g p e n e t r a t i o n C r i t R e v T h e r D r u g C a r r i e r S yst 1 6 ( 1 ) 8 5 1 4 6 1 7 L u L R e i n a ch P S a n d K a o W W ( 2 0 0 1 ) C o r n e a l e p i t h e l i a l w o u n d h e a l i n g E xp B i o l M e d ( M a yw o o d ) 2 2 6 ( 7 ) 6 5 3 6 6 4 1 8 D u a H S a n d A zu a r a B l a n co A ( 2 0 0 0 ) L i m b a l st e m ce l l s o f t h e co r n e a l e p i t h e l i u m S u r v O p h t h a l m o l 4 4 ( 5 ) 4 1 5 4 2 5 1 9 G o r d o n M K F o l e y, J. W B i r k, D E F i t ch J. M a n d L i n se n m a ye r T F ( 1 9 9 4 ) T yp e V co l l a g e n a n d B o w m a n s m e m b r a n e Q u a n t i t a t i o n o f m R N A i n co r n e a l e p i t h e l i u m a n d st r o m a J B i o l C h e m 2 6 9 ( 4 0 ) 2 4 9 5 9 2 4 9 6 6 2 0 W i l so n S E a n d H o n g J W ( 2 0 0 0 ) B o w m a n s l a ye r s t r u ct u r e a n d f u n ct i o n : cr i t i c a l o r d i s p e n sa b l e t o co r n e a l f u n ct i o n ? A h yp o t h e si s C o r n e a 1 9 ( 4 ) 4 1 7 4 2 0 2 1 D a n i e l s, J. T G e e r l i n g G A l e xa n d e r R A M u r p h y, G K h a w P T a n d S a a r i a l h o K e r e U ( 2 0 0 3 ) T e m p o r a l a n d sp a t i a l e xp r e ssi o n o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a se s d u r i n g w o u n d h e a l i n g o f h u m a n co r n e a l t i ssu e E xp E ye R e s 7 7 ( 6 ) 6 5 3 6 6 4

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1 5 8 2 2 H a d d a d A ( 2 0 0 0 ) R e n e w a l o f t h e r a b b i t co r n e a l e p i t h e l i u m a s i n ve st i g a t e d b y a u t o r a d i o g r a p h y a f t e r i n t r a vi t r e a l i n j e ct i o n o f 3 H t h y m i d i n e C o r n e a 1 9 ( 3 ) 3 7 8 3 8 3 2 3 A d a m i s, A P M e kl i r B a n d Jo yce N C ( 1 9 9 1 ) I n si t u i n j u r y i n d u ce d r e l e a se o f b a si c f i b r o b l a st g r o w t h f a ct o r f r o m co r n e a l e p i t h e l i a l ce l l s A m J P a t h o l 1 3 9 ( 5 ) 9 6 1 9 6 7 2 4 S o u b r a n e G Je r d a n J. K a r p o u z a s, I F a ye i n N A G l a se r B C o sca s, G C o u r t o i s, Y a n d Je a n n y, J. C ( 1 9 9 0 ) B i n d i n g o f b a si c f i b r o b l a s t g r o w t h f a ct o r t o n o r m a l a n d n e o va sc u l a r i ze d r a b b i t co r n e a I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 3 1 ( 2 ) 3 2 3 3 3 3 2 5 M u l l e r L J. P e l s, E S ch u r m a n s, L R a n d V r e n se n G F ( 2 0 0 4 ) A n e w t h r e e d i m e n si o n a l m o d e l o f t h e o r g a n i za t i o n o f p r o t e o g l yca n s a n d co l l a g e n f i b r i l s i n t h e h u m a n c o r n e a l st r o m a E xp E ye R e s 7 8 ( 3 ) 4 9 3 5 0 1 2 6 R i ca r d B l u m S a n d R u g g i e r o F ( 2 0 0 5 ) T h e co l l a g e n su p e r f a m i l y: f r o m t h e e xt r a c e l l u l a r m a t r i x t o t h e ce l l m e m b r a n e P a t h o l B i o l ( P a r i s) 5 3 ( 7 ) 4 3 0 4 4 2 2 7 R a d d a T M M e n ze l E J. F r e yl e r H a n d G n a d H D ( 1 9 8 2 ) C o l l a g e n t yp e s i n ke r a t o co n u s G r a e f e s A r ch C l i n E xp O p h t h a l m o l 2 1 8 ( 5 ) 2 6 2 2 6 4 2 8 M cL a u g h l i n J. S L i n se n m a ye r T F a n d B i r k, D E ( 1 9 8 9 ) T yp e V co l l a g e n syn t h e si s a n d d e p o si t i o n b y ch i ck e n e m b r yo c o r n e a l f i b r o b l a st s i n vi t r o J C e l l S ci 9 4 ( P t 2 ) 3 7 1 3 7 9 2 9 T a ka h a sh i T C h o H I K u b l i n C L a n d C i n t r o n C ( 1 9 9 3 ) K e r a t a n su l f a t e a n d d e r m a t a n s u l f a t e p r o t e o g l yca n s a s so ci a t e w i t h t yp e V I co l l a g e n i n f e t a l r a b b i t co r n e a J H i st o c h e m C yt o ch e m 4 1 ( 1 0 ) 1 4 4 7 1 4 5 7 3 0 L i n se n m a ye r T F B r u n s, R R M e n t ze r A a n d M a y n e R ( 1 9 8 6 ) T yp e V I co l l a g e n : i m m u n o h i st o c h e m i ca l i d e n t i f i ca t i o n a s a f i l a m e n t o u s co m p o n e n t o f t h e e xt r a ce l l u l a r m a t r i x o f t h e d e ve l o p i n g a vi a n co r n e a l st r o m a D e v B i o l 1 1 8 ( 2 ) 4 2 5 4 3 1 3 1 L i n se n m a ye r T F M e n t ze r A I r w i n M H W a l d r e p N K a n d M a y n e R ( 1 9 8 6 ) A vi a n t yp e V I co l l a g e n M o n o cl o n a l a n t i b o d y p r o d u ct i o n a n d i m m u n o h i st o ch e m i ca l i d e n t i f i ca t i o n a s a m a j o r co n n e ct i ve t i ssu e co m p o n e n t o f co r n e a a n d sk e l e t a l m u scl e E xp C e l l R e s 1 6 5 ( 2 ) 5 1 8 5 2 9 3 2 W h i t e J. W e r km e i st e r J A R a m sh a w J. A a n d B i r k, D E ( 1 9 9 7 ) O r g a n i za t i o n o f f i b r i l l a r co l l a g e n i n t h e h u m a n a n d b o vi n e c o r n e a : co l l a g e n t yp e s V a n d I I I C o n n e ct T i ssu e R e s 3 6 ( 3 ) 1 6 5 1 7 4

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1 5 9 3 3 B i r k, D E F i t ch J. M a n d L i n se n m a ye r T F ( 1 9 8 6 ) O r g a n i za t i o n o f co l l a g e n t yp e s I a n d V i n t h e e m b r yo n i c c h i ck e n co r n e a I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 2 7 ( 1 0 ) 1 4 7 0 1 4 7 7 3 4 B i r k, D E ( 2 0 0 1 ) T yp e V co l l a g e n : h e t e r o t yp i c t yp e I / V co l l a g e n i n t e r a ct i o n s i n t h e r e g u l a t i o n o f f i b r i l a sse m b l y M i cr o n 3 2 ( 3 ) 2 2 3 2 3 7 3 5 M o r a d i A m e l i M R o u sse a u J C K l e m a n J P C h a m p l i a u d M F B o u t i l l o n M M B e r n i l l o n J. W a l l a ch J. a n d V a n d e r R e st M ( 1 9 9 4 ) D i ve r si t y i n t h e p r o ce ssi n g e ve n t s a t t h e N t e r m i n u s o f t yp e V co l l a g e n E u r J B i o ch e m 2 2 1 ( 3 ) 9 8 7 9 9 5 3 6 W e n st r u p R J. F l o r e r J B C o l e W G W i l l i n g M C a n d B i r k, D E ( 2 0 0 4 ) R e d u ce d t yp e I c o l l a g e n u t i l i za t i o n : a p a t h o g e n i c m e ch a n i s m i n C O L 5 A 1 h a p l o i n s u f f i ci e n t E h l e r s D a n l o s sy n d r o m e J C e l l B i o ch e m 9 2 ( 1 ) 1 1 3 1 2 4 3 7 W e n st r u p R J. F l o r e r J B B r u n ski l l E W B e l l S M C h e r vo n e va I a n d B i r k, D E ( 2 0 0 4 ) T yp e V co l l a g e n co n t r o l s t h e i n i t i a t i o n o f co l l a g e n f i b r i l a sse m b l y J B i o l C h e m 2 7 9 ( 5 1 ) 5 3 3 3 1 5 3 3 3 7 3 8 B i r k, D E F i t ch J. M B a b i a r z, J. P D o a n e K J. a n d L i n s e n m a ye r T F ( 1 9 9 0 ) C o l l a g e n f i b r i l l o g e n e si s i n vi t r o : i n t e r a ct i o n o f t yp e s I a n d V co l l a g e n r e g u l a t e s f i b r i l d i a m e t e r J C e l l S ci 9 5 ( P t 4 ) 6 4 9 6 5 7 3 9 M a r ch a n t J. K H a h n R A L i n se n m a ye r T F a n d B i r k D E ( 1 9 9 6 ) R e d u ct i o n o f t yp e V co l l a g e n u si n g a d o m i n a n t n e g a t i ve st r a t e g y a l t e r s t h e r e g u l a t i o n o f f i b r i l l o g e n e si s a n d r e s u l t s i n t h e l o ss o f co r n e a l sp e ci f i c f i b r i l m o r p h o l o g y J C e l l B i o l 1 3 5 ( 5 ) 1 4 1 5 1 4 2 6 4 0 H a sse l l J. R S ch r e ce n g o st P K R a d a J. A S u n d a r R a j N S o ssi G a n d T h o f t R A ( 1 9 9 2 ) B i o syn t h e si s o f s t r o m a l m a t r i x p r o t e o g l yca n s a n d b a se m e n t m e m b r a n e co m p o n e n t s b y h u m a n co r n e a l f i b r o b l a st s I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 3 3 ( 3 ) 5 4 7 5 5 7 4 1 C o r p u z, L M F u n d e r b u r g h J. L F u n d e r b u r g h M L B o t t o m l e y, G S P r a ka sh S a n d C o n r a d G W ( 1 9 9 6 ) M o l e c u l a r cl o n i n g a n d t i ssu e d i st r i b u t i o n o f ke r a t o ca n B o vi n e co r n e a l ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n 3 7 A J B i o l C h e m 2 7 1 ( 1 6 ) 9 7 5 9 9 7 6 3 4 2 B l o ch b e r g e r T C V e r g n e s, J. P H e m p e l J a n d H a sse l l J. R ( 1 9 9 2 ) cD N A t o ch i ck l u m i ca n ( c o r n e a l ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n ) r e ve a l s h o m o l o g y t o t h e s m a l l i n t e r st i t i a l p r o t e o g l yca n g e n e f a m i l y a n d e x p r e ssi o n i n m u scl e a n d i n t e st i n e J B i o l C h e m 2 6 7 ( 1 ) 3 4 7 3 5 2

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1 6 0 4 3 H a sse l l J. R C i n t r o n C K u b l i n C a n d N e w so m e D A ( 1 9 8 3 ) P r o t e o g l yca n ch a n g e s d u r i n g r e st o r a t i o n o f t r a n sp a r e n cy i n co r n e a l sca r s A r ch B i o ch e m B i o p h ys 2 2 2 ( 2 ) 3 6 2 3 6 9 4 4 R a d a J. A C o r n u e t P K a n d H a sse l l J. R ( 1 9 9 3 ) R e g u l a t i o n o f co r n e a l co l l a g e n f i b r i l l o g e n e si s i n vi t r o b y c o r n e a l p r o t e o g l yca n ( l u m i ca n a n d d e co r i n ) co r e p r o t e i n s E xp E ye R e s 5 6 ( 6 ) 6 3 5 6 4 8 4 5 F u n d e r b u r g h J. L C o r p u z, L M R o t h M R F u n d e r b u r g h M L T a sh e va E S a n d C o n r a d G W ( 1 9 9 7 ) M i m e ca n t h e 2 5 kD a co r n e a l ke r a t a n s u l f a t e p r o t e o g l yca n i s a p r o d u ct o f t h e g e n e p r o d u ci n g o st e o g l yci n J B i o l C h e m 2 7 2 ( 4 4 ) 2 8 0 8 9 2 8 0 9 5 4 6 F u n d e r b u r g h J. ( 2 0 0 0 ) C o r n e a l P r o t e o g l yca n s. I n : I o zzo R V ( e d ) P r o t e o g l yca n s : st r u ct u r e b i o l o g y, a n d m o l e c u l a r i n t e r a ct i o n s M a r ce l D e kke r N e w Y o r k 4 7 W e b e r I T H a r r i so n R W a n d I o zzo R V ( 1 9 9 6 ) M o d e l st r u ct u r e o f d e co r i n a n d i m p l i ca t i o n s f o r co l l a g e n f i b r i l l o g e n e si s J B i o l C h e m 2 7 1 ( 5 0 ) 3 1 7 6 7 3 1 7 7 0 4 8 I o zzo R V ( 2 0 0 0 ) P r o t e o g l yca n s : st r u ct u r e b i o l o g y, a n d m o l e cu l a r i n t e r a ct i o n s M a r c e l D e kke r N e w Y o r k 4 9 A xe l sso n I a n d H e i n e g a r d D ( 1 9 7 5 ) F r a ct i o n a t i o n o f p r o t e o g l yca n s f r o m b o vi n e co r n e a l st r o m a B i o ch e m J 1 4 5 ( 3 ) 4 9 1 5 0 0 5 0 N e a m e P J. K a y, C J M cQ u i l l a n D J. B e a l e s, M P a n d H a sse l l J. R ( 2 0 0 0 ) I n d e p e n d e n t m o d u l a t i o n o f co l l a g e n f i b r i l l o g e n e si s b y d e co r i n a n d l u m i ca n C e l l M o l L i f e S ci 5 7 ( 5 ) 8 5 9 8 6 3 5 1 V o g e l K G P a u l sso n M a n d H e i n e g a r d D ( 1 9 8 4 ) S p e ci f i c i n h i b i t i o n o f t yp e I a n d t yp e I I c o l l a g e n f i b r i l l o g e n e si s b y t h e sm a l l p r o t e o g l yca n o f t e n d o n B i o c h e m J 2 2 3 ( 3 ) 5 8 7 5 9 7 5 2 M e e k, K M Q u a n t o ck, A J. B o o t e C L i u C Y a n d K a o W W ( 2 0 0 3 ) A n X r a y sca t t e r i n g i n ve st i g a t i o n o f co r n e a l st r u ct u r e i n k e r a t o c a n d e f i ci e n t m i ce M a t r i x B i o l 2 2 ( 6 ) 4 6 7 4 7 5 5 3 K l i n t w o r t h G K M e ye r R D e n n i s, R H e w i t t A T S t o ck, E L L e n z, M E H a sse l l J. R S t a r k, W J. J r K u e t t n e r K E a n d T h o n a r E J. ( 1 9 8 6 ) M a cu l a r co r n e a l d yst r o p h y. L a ck o f k e r a t a n su l f a t e i n se r u m a n d co r n e a O p h t h a l m i c P a e d i a t r G e n e t 7 ( 3 ) 1 3 9 1 4 3 5 4 H a sse l l J. R N e w so m e D A K r a ch m e r J. H a n d R o d r i g u e s, M M ( 1 9 8 0 ) M a cu l a r co r n e a l d yst r o p h y: f a i l u r e t o s yn t h e si ze a m a t u r e ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n P r o c N a t l A ca d S ci U S A 7 7 ( 6 ) 3 7 0 5 3 7 0 9

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1 6 1 5 5 B o u r n e W M ( 2 0 0 3 ) B i o l o g y o f t h e c o r n e a l e n d o t h e l i u m i n h e a l t h a n d d i se a se E ye 1 7 ( 8 ) 9 1 2 9 1 8 5 6 R o b e r t L L e g e a i s, J. M R o b e r t A M a n d R e n a r d G ( 2 0 0 1 ) C o r n e a l co l l a g e n s P a t h o l B i o l ( P a r i s) 4 9 ( 4 ) 3 5 3 3 6 3 5 7 O j e d a J. L V e n t o sa J. A a n d P i e d r a S ( 2 0 0 1 ) T h e t h r e e d i m e n si o n a l m i cr o a n a t o m y o f t h e r a b b i t a n d h u m a n co r n e a A ch e m i ca l a n d m e ch a n i ca l m i cr o d i sse ct i o n S E M a p p r o a ch J A n a t 1 9 9 ( P t 5 ) 5 6 7 5 7 6 5 8 P o o l e C A B r o o ke s, N H a n d C l o v e r G M ( 1 9 9 3 ) K e r a t o cyt e n e t w o r ks vi su a l i se d i n t h e l i vi n g co r n e a u si n g vi t a l d ye s J C e l l S ci 1 0 6 ( P t 2 ) 6 8 5 6 9 1 5 9 P o o l e C A B r o o ke s, N H a n d C l o v e r G M ( 2 0 0 3 ) C o n f o ca l i m a g i n g o f t h e h u m a n ke r a t o cyt e n e t w o r k u si n g t h e vi t a l d ye 5 ch l o r o m e t h yl f l u o r e s ce i n d i a ce t a t e C l i n E xp e r i m e n t O p h t h a l m o l 3 1 ( 2 ) 1 4 7 1 5 4 6 0 K a n g G M a n d K o M K ( 2 0 0 5 ) M o r p h o l o g i ca l ch a r a ct e r i st i cs a n d i n t e r ce l l u l a r c o n n e ct i o n s o f co r n e a l k e r a t o cy t e s K o r e a n J O p h t h a l m o l 1 9 ( 3 ) 2 1 3 2 1 8 6 1 W a t sky, M A ( 1 9 9 5 ) K e r a t o cyt e g a p j u n c t i o n a l co m m u n i c a t i o n i n n o r m a l a n d w o u n d e d r a b b i t co r n e a s a n d h u m a n co r n e a s I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 3 6 ( 1 3 ) 2 5 6 8 2 5 7 6 6 2 P o o l e C A B r o o ke s, N H a n d C l o v e r ( 1 9 9 6 ) C o n f o ca l i m a g i n g o f t h e ke r a t o cyt e n e t w o r k i n p o r ci n e co r n e a u si n g t h e f i xa b l e vi t a l d ye 5 ch l o r o m e t h yl f l u o r e s ce i n d i a ce t a t e C u r r E ye R e s 1 5 ( 2 ) 1 6 5 1 7 4 6 3 F r a n ce sc o n i C M H u t ch e o n A E C h u n g E H D a l b o n e A C Jo yc e N C a n d Z i e ske J. D ( 2 0 0 0 ) E xp r e ssi o n p a t t e r n s o f r e t i n o b l a st o m a a n d E 2 F f a m i l y p r o t e i n s d u r i n g c o r n e a l d e ve l o p m e n t I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 1 ( 5 ) 1 0 5 4 1 0 6 2 6 4 Z i e ske J. D G u i m a r a e s, S R a n d H u t ch e o n A E ( 2 0 0 1 ) K i n e t i cs o f ke r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n i n r e sp o n se t o e p i t h e l i a l d e b r i d e m e n t E xp E ye R e s 7 2 ( 1 ) 3 3 3 9 6 5 S n yd e r M C B e r g m a n so n J. P a n d D o u g h t y, M J. ( 1 9 9 8 ) K e r a t o cyt e s: n o m o r e t h e q u i e t ce l l s J A m O p t o m A sso c 6 9 ( 3 ) 1 8 0 1 8 7 6 6 Je st e r J. V M o l l e r P e d e r se n T H u a n g J S a x, C M K a ys, W T C a va n g h H D P e t r o l l W M a n d P i a t i g o r sk y, J. ( 1 9 9 9 ) T h e ce l l u l a r b a si s o f co r n e a l t r a n sp a r e n cy: e vi d e n ce f o r c o r n e a l cr ys t a l l i n s' J C e l l S ci 1 1 2 ( P t 5 ) 6 1 3 6 2 2

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1 6 2 6 7 C o o p e r D L I so l a N R S t e ve n so n K a n d B a p t i st E W ( 1 9 9 3 ) M e m b e r s o f t h e A L D H g e n e f a m i l y a r e l e n s a n d co r n e a l cr yst a l l i n s A d v E xp M e d B i o l 3 2 8 1 6 9 1 7 9 6 8 P a p p a A C h e n C K o u t a l o s, Y T o w n se n d A J. a n d V a si l i o u V ( 2 0 0 3 ) A l d h 3 a 1 p r o t e ct s h u m a n co r n e a l e p i t h e l i a l ce l l s f r o m u l t r a vi o l e t a n d 4 h y d r o xy 2 n o n e n a l i n d u ce d o xi d a t i ve d a m a g e F r e e R a d i c B i o l M e d 3 4 ( 9 ) 1 1 7 8 1 1 8 9 6 9 P a p p a A E st e y, T M a n z e r R B r o w n D a n d V a si l i o u V ( 2 0 0 3 ) H u m a n a l d e h yd e d e h yd r o g e n a se 3 A 1 ( A L D H 3 A 1 ) : b i o ch e m i ca l ch a r a ct e r i za t i o n a n d i m m u n o h i st o c h e m i ca l l o c a l i za t i o n i n t h e co r n e a B i o ch e m J 3 7 6 ( P t 3 ) 6 1 5 6 2 3 7 0 B o e sch J. S L e e C a n d L i n d a h l R G ( 1 9 9 6 ) C o n st i t u t i ve e xp r e ssi o n o f cl a ss 3 a l d e h yd e d e h yd r o g e n a se i n cu l t u r e d r a t co r n e a l e p i t h e l i u m J B i o l C h e m 2 7 1 ( 9 ) 5 1 5 0 5 1 5 7 7 1 Je st e r J. V B u d g e A F i s h e r S a n d H u a n g J. ( 2 0 0 5 ) C o r n e a l ke r a t o cyt e s: p h e n o t yp i c a n d sp e ci e s d i f f e r e n c e s i n a b u n d a n t p r o t e i n e xp r e ssi o n a n d i n vi t r o l i g h t sca t t e r i n g I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 6 ( 7 ) 2 3 6 9 2 3 7 8 7 2 P i a t i g o r sky, J. ( 2 0 0 1 ) E n i g m a o f t h e a b u n d a n t w a t e r so l u b l e cyt o p l a s m i c p r o t e i n s o f t h e co r n e a : t h e r e f r a ct o n h yp o t h e si s C o r n e a 2 0 ( 8 ) 8 5 3 8 5 8 7 3 G o n d h o w i a r d j o T D va n H a e r i n g e n N J. a n d K i j l st r a A ( 1 9 9 2 ) M o l e cu l a r w e i g h t f o r m s o f co r n e a l a l d e h y d e d e h yd r o g e n a se C u r r E ye R e s 1 1 ( 4 ) 3 7 7 3 8 1 7 4 X u Y S K a n t o r o w M D a vi s, J. a n d P i a t i g o r sky, J. ( 2 0 0 0 ) E vi d e n ce f o r g e l so l i n a s a co r n e a l c r yst a l l i n i n ze b r a f i sh J B i o l C h e m 2 7 5 ( 3 2 ) 2 4 6 4 5 2 4 6 5 2 7 5 G r a w J. ( 1 9 9 7 ) T h e cr yst a l l i n s: g e n e s, p r o t e i n s a n d d i se a s e s B i o l C h e m 3 7 8 ( 1 1 ) 1 3 3 1 1 3 4 8 7 6 Ja e n i cke R ( 1 9 9 4 ) E ye l e n s p r o t e i n s: st r u ct u r e su p e r st r u ct u r e s t a b i l i t y, g e n e t i cs N a t u r w i sse n sch a f t e n 8 1 ( 1 0 ) 4 2 3 4 2 9 7 7 P i a t i g o r sky, J. ( 1 9 9 3 ) P u zzl e o f cr yst a l l i n d i ve r si t y i n e ye l e n s e s D e v D yn 1 9 6 ( 4 ) 2 6 7 2 7 2 7 8 P i a t i g o r sky, J. ( 1 9 9 8 ) M u l t i f u n c t i o n a l l e n s c r ys t a l l i n s a n d co r n e a l e n zym e s. M o r e t h a n m e e t s t h e e ye A n n N Y A ca d S ci 8 4 2 7 1 5

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1 6 3 7 9 Jo h n se n S ( 2 0 0 1 ) H i d d e n i n p l a i n si g h t : t h e e co l o g y a n d p h ysi o l o g y o f o r g a n i sm a l t r a n s p a r e n cy B i o l B u l l 2 0 1 ( 3 ) 3 0 1 3 1 8 8 0 M a su r S K C h e u n g J. K a n d A n t o h i S ( 1 9 9 3 ) I d e n t i f i ca t i o n o f i n t e g r i n s i n c u l t u r e d co r n e a l f i b r o b l a st s a n d i n i so l a t e d ke r a t o cyt e s I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 3 4 ( 9 ) 2 6 9 0 2 6 9 8 8 1 L a u w e r yn s, B v a n d e n O o r d J. J V o l p e s R F o e t s, B a n d M i sso t t e n L ( 1 9 9 1 ) D i st r i b u t i o n o f v e r y l a t e a ct i va t i o n i n t e g r i n s i n t h e h u m a n co r n e a A n i m m u n o h i st o ch e m i ca l st u d y u si n g m o n o cl o n a l a n t i b o d i e s I n ve s t O p h t h a l m o l V i s S ci 3 2 ( 7 ) 2 0 7 9 2 0 8 5 8 2 T o t i P T o si G M T r a ve r si C S ch u r f e l d K C a r d o n e C a n d C a p o r o ssi A ( 2 0 0 2 ) C D 3 4 st r o m a l e xp r e ssi o n p a t t e r n i n n o r m a l a n d a l t e r e d h u m a n c o r n e a s O p h t h a l m o l o g y 1 0 9 ( 6 ) 1 1 6 7 1 1 7 1 8 3 S t r a m e r B M K w o k, M G F a r t h i n g N a ya k, P J. Ju n g J. C F i n i M E a n d N a ya k, R C ( 2 0 0 4 ) M o n o cl o n a l a n t i b o d y ( 3 G 5 ) d e f i n e d g a n g l i o si d e : ce l l s u r f a ce m a r k e r o f co r n e a l ke r a t o cyt e s I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 5 ( 3 ) 8 0 7 8 1 2 8 4 Je st e r J. V B a r r y, P A L i n d G J. P e t r o l l W M G a r a n a R a n d C a va n a g h H D ( 1 9 9 4 ) C o r n e a l ke r a t o cyt e s: i n si t u a n d i n vi t r o o r g a n i za t i o n o f cyt o sk e l e t a l co n t r a ct i l e p r o t e i n s I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 3 5 ( 2 ) 7 3 0 7 4 3 8 5 M o l l e r P e d e r se n T ( 2 0 0 4 ) K e r a t o cy t e r e f l e ct i vi t y a n d co r n e a l h a z e E xp E ye R e s 7 8 ( 3 ) 5 5 3 5 6 0 8 6 F u n d e r b u r g h J. L M a n n M M a n d F u n d e r b u r g h M L ( 2 0 0 3 ) K e r a t o cyt e p h e n o t yp e m e d i a t e s p r o t e o g l yca n st r u ct u r e : a r o l e f o r f i b r o b l a st s i n c o r n e a l f i b r o si s J B i o l C h e m 2 7 8 ( 4 6 ) 4 5 6 2 9 4 5 6 3 7 8 7 S t r a m e r B M C o o k, J R F i n i M E T a yl o r A a n d O b i n M ( 2 0 0 1 ) I n d u ct i o n o f t h e u b i q u i t i n p r o t e a so m e p a t h w a y d u r i n g t h e ke r a t o cyt e t r a n si t i o n t o t h e r e p a i r f i b r o b l a st p h e n o t yp e I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 2 ( 8 ) 1 6 9 8 1 7 0 6 8 8 Je st e r J. V P e t r o l l W M a n d C a va n a g h H D ( 1 9 9 9 ) C o r n e a l st r o m a l w o u n d h e a l i n g i n r e f r a ct i ve s u r g e r y : t h e r o l e o f m yo f i b r o b l a st s P r o g R e t i n E ye R e s 1 8 ( 3 ) 3 1 1 3 5 6 8 9 Je st e r J. V B a r r y L a n e P A P e t r o l l W M O l se n D R a n d C a va n a g h H D ( 1 9 9 7 ) I n h i b i t i o n o f co r n e a l f i b r o si s b y t o p i ca l a p p l i ca t i o n o f b l o cki n g a n t i b o d i e s t o T G F b e t a i n t h e r a b b i t C o r n e a 1 6 ( 2 ) 1 7 7 1 8 7

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1 6 4 9 0 M ye r s, J. S G o m e s, J. A S i e p se r S B R a p u a n o C J. E a g l e R C Jr a n d T h o m S B ( 1 9 9 7 ) E f f e ct o f t r a n sf o r m i n g g r o w t h f a ct o r b e t a 1 o n st r o m a l h a ze f o l l o w i n g e xci m e r l a se r p h o t o r e f r a ct i ve ke r a t e ct o m y i n r a b b i t s J R e f r a ct S u r g 1 3 ( 4 ) 3 5 6 3 6 1 9 1 Je st e r J. V H u a n g J. P e t r o l l W M a n d C a va n a g h H D ( 2 0 0 2 ) T G F b e t a i n d u c e d m yo f i b r o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n o f r a b b i t ke r a t o cyt e s r e q u i r e s syn e r g i st i c T G F b e t a P D G F a n d i n t e g r i n si g n a l i n g E xp E ye R e s 7 5 ( 6 ) 6 4 5 6 5 7 9 2 K a y, E P L e e M S S e o n g G J. a n d L e e Y G ( 1 9 9 8 ) T G F b e t a s st i m u l a t e ce l l p r o l i f e r a t i o n vi a a n a u t o c r i n e p r o d u ct i o n o f F G F 2 i n co r n e a l st r o m a l f i b r o b l a st s C u r r E ye R e s 1 7 ( 3 ) 2 8 6 2 9 3 9 3 S u n d a r r a j N F i t e D B e l a k, R S u n d a r r a j S R a d a J. O k a m o t o S a n d H a sse l l J. ( 1 9 9 8 ) P r o t e o g l yca n d i st r i b u t i o n d u r i n g h e a l i n g o f co r n e a l st r o m a l w o u n d s i n ch i ck E xp E ye R e s 6 7 ( 4 ) 4 3 3 4 4 2 9 4 B e r r yh i l l B L K a n e B S t r a m e r B M F i n i M E a n d H a ss e l l J. R ( 2 0 0 3 ) I n cr e a se d S P A R C a ccu m u l a t i o n d u r i n g co r n e a l r e p a i r E xp E ye R e s 7 7 ( 1 ) 8 5 9 2 9 5 M o h a n R R H u t ch e o n A E C h o i R H o n g J. L e e J. M o h a n R R A m b r o si o R J r Z i e ske J. D a n d W i l so n S E ( 2 0 0 3 ) A p o p t o si s, n e cr o si s, p r o l i f e r a t i o n a n d m yo f i b r o b l a st g e n e r a t i o n i n t h e st r o m a f o l l o w i n g L A S I K a n d P R K E xp E ye R e s 7 6 ( 1 ) 7 1 8 7 9 6 M o h a n R R L i a n g Q K i m W J. H e l e n a M C B a e r ve l d t F a n d W i l so n S E ( 1 9 9 7 ) A p o p t o si s i n t h e co r n e a : f u r t h e r ch a r a c t e r i za t i o n o f F a s/ F a s l i g a n d syst e m E xp E ye R e s 6 5 ( 4 ) 5 7 5 5 8 9 9 7 G a t l i n J. M e l k u s, M W P a d g e t t A P e t r o l l W M C a va n a g h H D G a r ci a J. V a n d Je st e r J. V ( 2 0 0 3 ) I n vi vo f l u o r e sce n t l a b e l i n g o f co r n e a l w o u n d h e a l i n g f i b r o b l a st s E xp E ye R e s 7 6 ( 3 ) 3 6 1 3 7 1 9 8 Je st e r J. V B a r r y L a n e P A C a va n a g h H D a n d P e t r o l l W M ( 1 9 9 6 ) I n d u ct i o n o f a l p h a s m o o t h m u scl e a ct i n e xp r e ssi o n a n d m yo f i b r o b l a st t r a n sf o r m a t i o n i n cu l t u r e d co r n e a l ke r a t o cyt e s C o r n e a 1 5 ( 5 ) 5 0 5 5 1 6 9 9 B e a l e s, M P F u n d e r b u r g h J. L Je st e r J. V a n d H a sse l l J. R ( 1 9 9 9 ) P r o t e o g l yca n syn t h e si s b y b o vi n e ke r a t o cyt e s a n d co r n e a l f i b r o b l a st s: m a i n t e n a n ce o f t h e ke r a t o cyt e p h e n o t y p e i n c u l t u r e I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 0 ( 8 ) 1 6 5 8 1 6 6 3

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1 6 5 1 0 0 B e r r yh i l l B L K a d e r R K a n e B B i r k, D E F e n g J a n d H a sse l l J. R ( 2 0 0 2 ) P a r t i a l r e st o r a t i o n o f t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e t o b o vi n e ke r a t o cyt e s m a d e f i b r o b l a st i c b y se r u m I n ve s t O p h t h a l m o l V i s S ci 4 3 ( 1 1 ) 3 4 1 6 3 4 2 1 1 0 1 Je st e r J. V H u a n g J. B a r r y L a n e P A K a o W W P e t r o l l W M a n d C a va n a g h H D ( 1 9 9 9 ) T r a n sf o r m i n g g r o w t h f a ct o r ( b e t a ) m e d i a t e d co r n e a l m y o f i b r o b l a st d i f f e r e n t i a t i o n r e q u i r e s a ct i n a n d f i b r o n e ct i n a sse m b l y I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 0 ( 9 ) 1 9 5 9 1 9 6 7 1 0 2 M a su r S K D e w a l H S D i n h T T E r e n b u r g I a n d P e t r i d o u S ( 1 9 9 6 ) M yo f i b r o b l a st s d i f f e r e n t i a t e f r o m f i b r o b l a st s w h e n p l a t e d a t l o w d e n si t y P r o c N a t l A ca d S ci U S A 9 3 ( 9 ) 4 2 1 9 4 2 2 3 1 0 3 M a l t se va O F o l g e r P Z e ka r i a D P e t r i d o u S a n d M a s u r S K ( 2 0 0 1 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a ct o r r e ve r sa l o f t h e co r n e a l m yo f i b r o b l a st p h e n o t yp e I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 2 ( 1 1 ) 2 4 9 0 2 4 9 5 1 0 4 I va r se n A L a u r b e r g T a n d M o l l e r P e d e r se n T ( 2 0 0 4 ) R o l e o f ke r a t o cyt e l o ss o n co r n e a l w o u n d r e p a i r a f t e r L A S I K I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 5 ( 1 0 ) 3 4 9 9 3 5 0 6 1 0 5 W i l so n S E L i u J. J a n d M o h a n R R ( 1 9 9 9 ) S t r o m a l e p i t h e l i a l i n t e r a ct i o n s i n t h e co r n e a P r o g R e t i n E ye R e s 1 8 ( 3 ) 2 9 3 3 0 9 1 0 6 W i l so n S E ( 1 9 9 8 ) E ve r e t t K i n se y L e ct u r e K e r a t o cyt e a p o p t o si s i n r e f r a ct i ve su r g e r y C l a o J 2 4 ( 3 ) 1 8 1 1 8 5 1 0 7 W i l so n S E H e Y G W e n g J. L i Q M cD o w a l l A W V i t a l M a n d C h w a n g E L ( 1 9 9 6 ) E p i t h e l i a l i n j u r y i n d u ce s ke r a t o cyt e a p o p t o si s: h yp o t h e si ze d r o l e f o r t h e i n t e r l e u ki n 1 sys t e m i n t h e m o d u l a t i o n o f co r n e a l t i ssu e o r g a n i za t i o n a n d w o u n d h e a l i n g E xp E ye R e s 6 2 ( 4 ) 3 2 5 3 2 7 1 0 8 B a l d w i n H C a n d M a r sh a l l J ( 2 0 0 2 ) G r o w t h f a ct o r s i n co r n e a l w o u n d h e a l i n g f o l l o w i n g r e f r a ct i ve su r g e r y: A r e vi e w A ct a O p h t h a l m o l S ca n d 8 0 ( 3 ) 2 3 8 2 4 7 1 0 9 C a m p o s, M R a m a n S L e e M a n d M cD o n n e l l P J. ( 1 9 9 4 ) K e r a t o cyt e l o ss a f t e r d i f f e r e n t m e t h o d s o f d e e p i t h e l i a l i za t i o n O p h t h a l m o l o g y 1 0 1 ( 5 ) 8 9 0 8 9 4 1 1 0 C h a n d r a se k h e r G M a X L a l l i e r T E a n d B a za n H E ( 2 0 0 2 ) D e l a y o f co r n e a l e p i t h e l i a l w o u n d h e a l i n g a n d i n d u ct i o n o f ke r a t o cyt e a p o p t o si s b y p l a t e l e t a ct i va t i n g f a ct o r I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 3 ( 5 ) 1 4 2 2 1 4 2 8

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1 6 6 1 1 1 W i l so n S E ( 2 0 0 2 ) A n a l ysi s o f t h e ke r a t o cyt e a p o p t o si s, ke r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n a n d m yo f i b r o b l a st t r a n sf o r m a t i o n r e sp o n se s a f t e r p h o t o r e f r a ct i ve k e r a t e c t o m y a n d l a se r i n si t u k e r a t o m i l e u si s T r a n s A m O p h t h a l m o l S o c 1 0 0 4 1 1 4 3 3 1 1 2 C h e w S J. B e u e r m a n R W K a u f m a n H E a n d M cD o n a l d M B ( 1 9 9 5 ) I n vi vo co n f o ca l m i c r o sco p y o f co r n e a l w o u n d h e a l i n g a f t e r e xci m e r l a se r p h o t o r e f r a ct i ve ke r a t e ct o m y C l a o J 2 1 ( 4 ) 2 7 3 2 8 0 1 1 3 H e l e n a M C B a e r ve l d t F K i m W J a n d W i l so n S E ( 1 9 9 8 ) K e r a t o cyt e a p o p t o si s a f t e r co r n e a l s u r g e r y I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 3 9 ( 2 ) 2 7 6 2 8 3 1 1 4 W i l so n S E M o h a n R R M o h a n R R A m b r o si o R Jr H o n g J. a n d L e e J. ( 2 0 0 1 ) T h e c o r n e a l w o u n d h e a l i n g r e sp o n se : cyt o ki n e m e d i a t e d i n t e r a ct i o n o f t h e e p i t h e l i u m st r o m a a n d i n f l a m m a t o r y ce l l s P r o g R e t i n E ye R e s 2 0 ( 5 ) 6 2 5 6 3 7 1 1 5 W i l so n S E ( 2 0 0 0 ) R o l e o f a p o p t o si s i n w o u n d h e a l i n g i n t h e co r n e a C o r n e a 1 9 ( 3 S u p p l ) S 7 1 2 1 1 6 B a za n H a n d O t t i n o P ( 2 0 0 2 ) T h e r o l e o f p l a t e l e t a ct i va t i n g f a ct o r i n t h e co r n e a l r e sp o n se t o i n j u r y P r o g R e t i n E ye R e s 2 1 ( 5 ) 4 4 9 4 6 4 1 1 7 P o d sko ch y, A a n d F a g e r h o l m P ( 2 0 0 2 ) T h e e xp r e ssi o n o f F a s l i g a n d p r o t e i n i n u l t r a vi o l e t e xp o s e d r a b b i t co r n e a s C o r n e a 2 1 ( 1 ) 9 1 9 4 1 1 8 Z h a o J. N a g a sa ki T a n d M a u r i ce D M ( 2 0 0 1 ) R o l e o f t e a r s i n ke r a t o cyt e l o ss a f t e r e p i t h e l i a l r e m o va l i n m o u se co r n e a I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 2 ( 8 ) 1 7 4 3 1 7 4 9 1 1 9 K a l l i n i ko s, P a n d E f r o n N ( 2 0 0 4 ) O n t h e e t i o l o g y o f ke r a t o cyt e l o ss d u r i n g co n t a ct l e n s w e a r I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 5 ( 9 ) 3 0 1 1 3 0 2 0 1 2 0 K a m i ya m a K I g u c h i I W a n g X a n d I m a n i sh i J. ( 1 9 9 8 ) E f f e ct s o f P D G F o n t h e m i g r a t i o n o f r a b b i t c o r n e a l f i b r o b l a st s a n d e p i t h e l i a l ce l l s C o r n e a 1 7 ( 3 ) 3 1 5 3 2 5 1 2 1 L i Q A sh r a f M F B e ko e N A S t a r k, W J C h a n C C a n d O B r i e n T P ( 2 0 0 0 ) T h e r o l e o f a p o p t o si s i n t h e e a r l y co r n e a l w o u n d h e a l i n g a f t e r e xci m e r l a se r ke r a t e ct o m y i n t h e r a t G r a e f e s A r ch C l i n E xp O p h t h a l m o l 2 3 8 ( 1 0 ) 8 5 3 8 6 0 1 2 2 W a t sky, M A G r i f f i t h M W a n g D A a n d T i g yi G J. ( 2 0 0 0 ) P h o sp h o l i p i d g r o w t h f a ct o r s a n d co r n e a l w o u n d h e a l i n g A n n N Y A ca d S ci 9 0 5 1 4 2 1 5 8

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1 6 7 1 2 3 K i m W J. M o h a n R R M o h a n R R a n d W i l so n S E ( 1 9 9 9 ) E f f e ct o f P D G F I L 1 a l p h a a n d B M P 2 / 4 o n co r n e a l f i b r o b l a st ch e m o t a xi s: e xp r e ssi o n o f t h e p l a t e l e t d e r i ve d g r o w t h f a ct o r syst e m i n t h e co r n e a I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 0 ( 7 ) 1 3 6 4 1 3 7 2 1 2 4 M o h a n R R K i m W J. M o h a n R R C h e n L a n d W i l so n S E ( 1 9 9 8 ) B o n e m o r p h o g e n i c p r o t e i n s 2 a n d 4 a n d t h e i r r e ce p t o r s i n t h e a d u l t h u m a n co r n e a I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 3 9 ( 1 3 ) 2 6 2 6 2 6 3 6 1 2 5 Y a n a i R Y a m a d a N K u g i m i ya N I n u i M a n d N i sh i d a T ( 2 0 0 2 ) M i t o g e n i c a n d a n t i a p o p t o t i c e f f e ct s o f va r i o u s g r o w t h f a ct o r s o n h u m a n co r n e a l f i b r o b l a st s I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 3 ( 7 ) 2 1 2 2 2 1 2 6 1 2 6 S t r a m e r B M Z i e ske J. D J u n g J. C A u st i n J. S a n d F i n i M E ( 2 0 0 3 ) M o l e cu l a r m e ch a n i sm s c o n t r o l l i n g t h e f i b r o t i c r e p a i r p h e n o t yp e i n co r n e a : i m p l i ca t i o n s f o r su r g i ca l o u t c o m e s I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 4 ( 1 0 ) 4 2 3 7 4 2 4 6 1 2 7 C i n t r o n C a n d K u b l i n C L ( 1 9 7 7 ) R e g e n e r a t i o n o f co r n e a l t i ssu e D e v B i o l 6 1 ( 2 ) 3 4 6 3 5 7 1 2 8 B l e ckm a n n H S ch n o y, N a n d K r e sse H ( 2 0 0 2 ) E l e ct r o n m i cr o sco p i c a n d i m m u n o h i st o ch e m i ca l e xa m i n a t i o n o f sca r r e d h u m a n c o r n e a r e t r e a t e d b y e xci m e r l a se r G r a e f e s A r ch C l i n E xp O p h t h a l m o l 2 4 0 ( 4 ) 2 7 1 2 7 8 1 2 9 C a r l so n E C W a n g I J. L i u C Y B r a n n a n P K a o C W a n d K a o W W ( 2 0 0 3 ) A l t e r e d K S P G e xp r e ssi o n b y ke r a t o cyt e s f o l l o w i n g co r n e a l i n j u r y M o l V i s 9 6 1 5 6 2 3 1 3 0 P r i g l i n g e r S G M a y, C A A l g e C S W o l f A N e u b a u e r A S H a r i t o g l o u C K a m p i k, A a n d W e l g e L u sse n U ( 2 0 0 6 ) I m m u n o h i st o ch e m i c a l f i n d i n g s a f t e r L A S I K co n f i r m i n vi t r o L A S I K m o d e l C o r n e a 2 5 ( 3 ) 3 3 1 3 3 5 1 3 1 L i n se n m a ye r T F F i t ch J. M G o r d o n M K C a i C X I g o e F M a r ch a n t J. K a n d B i r k, D E ( 1 9 9 8 ) D e ve l o p m e n t a n d r o l e s o f co l l a g e n o u s m a t r i ce s i n t h e e m b r y o n i c a vi a n c o r n e a P r o g R e t i n E ye R e s 1 7 ( 2 ) 2 3 1 2 6 5 1 3 2 M u l l e r L J. P e l s, L a n d V r e n s e n G F ( 1 9 9 5 ) N o ve l a sp e ct s o f t h e u l t r a st r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n o f h u m a n co r n e a l ke r a t o cyt e s I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 3 6 ( 1 3 ) 2 5 5 7 2 5 6 7 1 3 3 H a h n e l C S o m o d i S W e i ss, D G a n d G u t h o f f R F ( 2 0 0 0 ) T h e ke r a t o cyt e n e t w o r k o f h u m a n co r n e a : a t h r e e d i m e n si o n a l st u d y u si n g co n f o ca l l a se r sca n n i n g f l u o r e sce n ce m i cr o sc o p y C o r n e a 1 9 ( 2 ) 1 8 5 1 9 3

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1 6 8 1 3 4 H a h n e l C S o m o d i S S l o w i k, C W e i ss, D G a n d G u t h o f f R F ( 1 9 9 7 ) F l u o r e sce n c e m i cr o sc o p y a n d t h r e e d i m e n si o n a l i m a g i n g o f t h e p o r ci n e co r n e a l ke r a t o cyt e n e t w o r k G r a e f e s A r ch C l i n E xp O p h t h a l m o l 2 3 5 ( 1 2 ) 7 7 3 7 7 9 1 3 5 W i l so n S E M o h a n R R A m b r o si o R Jr H o n g J. a n d L e e J. ( 2 0 0 1 ) T h e co r n e a l w o u n d h e a l i n g r e sp o n se : cyt o ki n e m e d i a t e d i n t e r a ct i o n o f t h e e p i t h e l i u m st r o m a a n d i n f l a m m a t o r y ce l l s P r o g R e t i n E ye R e s 2 0 ( 5 ) 6 2 5 6 3 7 1 3 6 H a n n a K D P o u l i q u e n Y W a r i n g G O 3 r d S a vo l d e l l i M C o t t e r J. M o r t o n K a n d M e n a sch e M ( 1 9 8 9 ) C o r n e a l st r o m a l w o u n d h e a l i n g i n r a b b i t s a f t e r 1 9 3 n m e xci m e r l a se r su r f a c e a b l a t i o n A r ch O p h t h a l m o l 1 0 7 ( 6 ) 8 9 5 9 0 1 1 3 7 D e l P e r o R A G i g st a d J. E R o b e r t s, A D K l i n t w o r t h G K M a r t i n C A L E sp e r a n c e F A Jr a n d T a yl o r D M ( 1 9 9 0 ) A r e f r a ct i ve a n d h i st o p a t h o l o g i c st u d y o f e xci m e r l a se r k e r a t e c t o m y i n p r i m a t e s A m J O p h t h a l m o l 1 0 9 ( 4 ) 4 1 9 4 2 9 1 3 8 G a r a n a R M P e t r o l l W M C h e n W T H e r m a n I M B a r r y, P A n d r e w s, P C a va n a g h H D a n d Je st e r J. V ( 1 9 9 2 ) R a d i a l ke r a t o t o m y. I I R o l e o f t h e m yo f i b r o b l a st i n co r n e a l w o u n d co n t r a ct i o n I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 3 3 ( 1 2 ) 3 2 7 1 3 2 8 2 1 3 9 B e r r yh i l l B L B e a l e s, M P a n d H a sse l l J. R ( 2 0 0 1 ) P r o d u ct i o n o f p r o st a g l a n d i n D syn t h a se a s a ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n b y cu l t u r e d b o vi n e ke r a t o cyt e s I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 2 ( 6 ) 1 2 0 1 1 2 0 7 1 4 0 M a l i n d a K M N o m i zu M C h u n g M D e l g a d o M K u r a t o m i Y Y a m a d a Y K l e i n m a n H K a n d P o n ce M L ( 1 9 9 9 ) I d e n t i f i ca t i o n o f l a m i n i n a l p h a 1 a n d b e t a 1 c h a i n p e p t i d e s a ct i v e f o r e n d o t h e l i a l c e l l a d h e si o n t u b e f o r m a t i o n a n d a o r t i c s p r o u t i n g F a se b J 1 3 ( 1 ) 5 3 6 2 1 4 1 G r a n t D S K i n se l l a J L K i b b e y, M C L a F l a m m e S B u r b e l o P D G o l d st e i n A L a n d K l e i n m a n H K ( 1 9 9 5 ) M a t r i g e l i n d u ce s t h y m o si n b e t a 4 g e n e i n d i f f e r e n t i a t i n g e n d o t h e l i a l c e l l s J C e l l S ci 1 0 8 ( P t 1 2 ) 3 6 8 5 3 6 9 4 1 4 2 G r a n t D C i d M K i b b e y M C a n d K l e i n m a n H ( 1 9 9 2 ) E xt r a c e l l u l a r m a t r i x ce l l i n t e r a ct i o n : M a t r i g e l a n d co m p l e x c e l l u l a r p a t t e r n f o r m a t i o n L a b I n ve st 6 7 ( 6 ) 8 0 5 8 0 6 ; a u t h o r r e p l y 8 0 7 8 0 8

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1 6 9 1 4 3 V u ki ce vi c, S K l e i n m a n H K L u yt e n F P R o b e r t s, A B R o ch e N S a n d R e d d i A H ( 1 9 9 2 ) I d e n t i f i ca t i o n o f m u l t i p l e a ct i ve g r o w t h f a ct o r s i n b a se m e n t m e m b r a n e M a t r i g e l su g g e st s ca u t i o n i n i n t e r p r e t a t i o n o f c e l l u l a r a ct i vi t y r e l a t e d t o e xt r a ce l l u l a r m a t r i x co m p o n e n t s E xp C e l l R e s 2 0 2 ( 1 ) 1 8 1 4 4 S ch u e t z, E G L i D O m i e ci n ski C J. M u l l e r E b e r h a r d U K l e i n m a n H K E l sw i ck, B a n d G u ze l i a n P S ( 1 9 8 8 ) R e g u l a t i o n o f g e n e e xp r e ssi o n i n a d u l t r a t h e p a t o cyt e s cu l t u r e d o n a b a se m e n t m e m b r a n e m a t r i x J C e l l P h ysi o l 1 3 4 ( 3 ) 3 0 9 3 2 3 1 4 5 K l e i n m a n H K M cG a r ve y, M L H a ss e l l J. R S t a r V L C a n n o n F B L a u r i e G W a n d M a r t i n G R ( 1 9 8 6 ) B a se m e n t m e m b r a n e co m p l e xe s w i t h b i o l o g i ca l a ct i vi t y B i o ch e m i st r y 2 5 ( 2 ) 3 1 2 3 1 8 1 4 6 Y u e B Y H si e h P a n d B a u m J. L ( 1 9 8 6 ) E f f e ct s o f co r n e a l e xt r a ct s o n r a b b i t co r n e a l st r o m a l ce l l s i n cu l t u r e I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 2 7 ( 1 ) 1 4 1 9 1 4 7 G o sp o d a r o w i cz, D C h e n g J. L u i G M B a i r d A a n d B o h l e n t P ( 1 9 8 4 ) I so l a t i o n o f b r a i n f i b r o b l a st g r o w t h f a ct o r b y h e p a r i n S e p h a r o se a f f i n i t y ch r o m a t o g r a p h y: i d e n t i t y w i t h p i t u i t a r y f i b r o b l a st g r o w t h f a ct o r P r o c N a t l A ca d S ci U S A 8 1 ( 2 2 ) 6 9 6 3 6 9 6 7 1 4 8 M a ci a g T M e h l m a n T F r i e se l R a n d S ch r e i b e r A B ( 1 9 8 4 ) H e p a r i n b i n d s e n d o t h e l i a l ce l l g r o w t h f a ct o r t h e p r i n ci p a l e n d o t h e l i a l ce l l m i t o g e n i n b o vi n e b r a i n S ci e n ce 2 2 5 ( 4 6 6 5 ) 9 3 2 9 3 5 1 4 9 N a ka m u r a T N a w a K a n d I ch i h a r a A ( 1 9 8 4 ) P a r t i a l p u r i f i ca t i o n a n d ch a r a ct e r i za t i o n o f h e p a t o cyt e g r o w t h f a c t o r f r o m se r u m o f h e p a t e ct o m i ze d r a t s B i o ch e m B i o p h ys R e s C o m m u n 1 2 2 ( 3 ) 1 4 5 0 1 4 5 9 1 5 0 D r e so w B a n d D e l b r u ck, A ( 1 9 8 4 ) T h e i so l a t i o n a n d a c t i vi t y o f g r o w t h st i m u l a t i n g f a c t o r s f r o m h u m a n p l a t e l e t s J C l i n C h e m C l i n B i o ch e m 2 2 ( 8 ) 5 2 7 5 3 3 1 5 1 S h i n g Y F o l km a n J. S u l l i va n R B u t t e r f i e l d C M u r r a y, J. a n d K l a g sb r u n M ( 1 9 8 4 ) H e p a r i n a f f i n i t y: p u r i f i ca t i o n o f a t u m o r d e r i ve d ca p i l l a r y e n d o t h e l i a l ce l l g r o w t h f a c t o r S ci e n c e 2 2 3 ( 4 6 4 2 ) 1 2 9 6 1 2 9 9 1 5 2 P o g g i A R u ci n ski B Ja m e s, P H o l t J. C a n d N i e w i a r o w ski S ( 1 9 8 4 ) P a r t i a l p u r i f i ca t i o n a n d c h a r a c t e r i za t i o n o f p o r ci n e p l a t e l e t d e r i ve d g r o w t h f a ct o r ( P D G F ) E xp C e l l R e s 1 5 0 ( 2 ) 4 3 6 4 4 1 1 5 3 K a o W W a n d L i u C Y ( 2 0 0 2 ) R o l e s o f l u m i ca n a n d k e r a t o c a n o n co r n e a l t r a n sp a r e n cy G l yc o co n j J 1 9 ( 4 5 ) 2 7 5 2 8 5

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1 7 0 1 5 4 T a sh e va E S F u n d e r b u r g h J. L C o r p u z, L M a n d C o n r a d G W ( 1 9 9 8 ) C l o n i n g ch a r a ct e r i za t i o n a n d t i ssu e sp e ci f i c e xp r e ssi o n o f t h e g e n e e n co d i n g b o vi n e ke r a t o ca n a co r n e a l ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yc a n G e n e 2 1 8 ( 1 2 ) 6 3 6 8 1 5 5 C h a kr a va r t i S P e t r o l l W M H a sse l l J. R Je st e r J. V L a ss, J. H P a u l J. a n d B i r k, D E ( 2 0 0 0 ) C o r n e a l o p a ci t y i n l u m i ca n n u l l m i ce : d e f e ct s i n co l l a g e n f i b r i l st r u ct u r e a n d p a cki n g i n t h e p o st e r i o r st r o m a I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 1 ( 1 1 ) 3 3 6 5 3 3 7 3 1 5 6 C h a kr a va r t i S ( 2 0 0 2 ) F u n ct i o n s o f l u m i ca n a n d f i b r o m o d u l i n : l e ss o n s f r o m kn o cko u t m i c e G l yco co n j J 1 9 ( 4 5 ) 2 8 7 2 9 3 1 5 7 L i u C Y B i r k, D E H a sse l l J. R K a n e B a n d K a o W W ( 2 0 0 3 ) K e r a t o ca n d e f i ci e n t m i ce d i sp l a y a l t e r a t i o n s i n co r n e a l st r u ct u r e J B i o l C h e m 2 7 8 ( 2 4 ) 2 1 6 7 2 2 1 6 7 7 1 5 8 P e l l e g a t a N S D i e g u e z L u ce n a J. L Jo e n s u u T L a u S M o n t g o m e r y, K T K r a h e R K i ve l a T K u c h e r l a p a t i R F o r si u s, H a n d d e l a C h a p e l l e A ( 2 0 0 0 ) M u t a t i o n s i n K E R A e n co d i n g ke r a t o ca n ca u se co r n e a p l a n a N a t G e n e t 2 5 ( 1 ) 9 1 9 5 1 5 9 L e h m a n n O J. E l a sh r y, M F E b e n e ze r N D O ca ka L F r a n ci s, P J. W i l ki e S E P a t e l R J. F i cke r L J o r d a n T K h a w P T a n d B h a t t a ch a r ya S S ( 2 0 0 1 ) A n o ve l k e r a t o c a n m u t a t i o n c a u si n g a u t o so m a l r e ce ssi ve co r n e a p l a n a I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 2 ( 1 3 ) 3 1 1 8 3 1 2 2 1 6 0 C h a kr a va r t i S ( 2 0 0 1 ) T h e co r n e a t h r o u g h t h e e ye s o f kn o ck o u t m i ce E xp E ye R e s 7 3 ( 4 ) 4 1 1 4 1 9 1 6 1 F i n i M E ( 1 9 9 9 ) K e r a t o cy t e a n d f i b r o b l a st p h e n o t yp e s i n t h e r e p a i r i n g co r n e a P r o g R e t i n E ye R e s 1 8 ( 4 ) 5 2 9 5 5 1 1 6 2 Je st e r J. V a n d H o C h a n g J. ( 2 0 0 3 ) M o d u l a t i o n o f cu l t u r e d co r n e a l ke r a t o cyt e p h e n o t yp e b y g r o w t h f a ct o r s/ cy t o ki n e s co n t r o l i n vi t r o co n t r a ct i l i t y a n d e xt r a ce l l u l a r m a t r i x c o n t r a ct i o n E xp E ye R e s 7 7 ( 5 ) 5 8 1 5 9 2 1 6 3 F u n d e r b u r g h J. L F u n d e r b u r g h M L M a n n M M P r a ka sh S a n d C o n r a d G W ( 1 9 9 6 ) S yn t h e si s o f co r n e a l ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yc a n s b y b o vi n e ke r a t o cyt e s i n vi t r o J B i o l C h e m 2 7 1 ( 4 9 ) 3 1 4 3 1 3 1 4 3 6 1 6 4 A b e d i n i a M P a i n T A l g a r E M a n d H o l m e s, R S ( 1 9 9 0 ) B o vi n e co r n e a l a l d e h yd e d e h yd r o g e n a s e : t h e m a j o r s o l u b l e co r n e a l p r o t e i n w i t h a p o ssi b l e d u a l p r o t e ct i v e r o l e f o r t h e e ye E xp E ye R e s 5 1 ( 4 ) 4 1 9 4 2 6

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1 7 1 1 6 5 R o ss, R B o w e n P o p e D F a n d R a i n e s, E W ( 1 9 9 0 ) P l a t e l e t d e r i ve d g r o w t h f a ct o r a n d i t s r o l e i n h e a l t h a n d d i se a s e P h i l o s T r a n s R S o c L o n d B B i o l S ci 3 2 7 ( 1 2 3 9 ) 1 5 5 1 6 9 1 6 6 H e l d i n C H W e st e r m a r k, B a n d W a st e so n A ( 1 9 8 1 ) P l a t e l e t d e r i ve d g r o w t h f a ct o r I s o l a t i o n b y a l a r g e sca l e p r o ce d u r e a n d a n a l ysi s o f su b u n i t co m p o si t i o n B i o ch e m J 1 9 3 ( 3 ) 9 0 7 9 1 3 1 6 7 W e st e r m a r k, B a n d W a s t e so n A ( 1 9 7 6 ) A p l a t e l e t f a ct o r st i m u l a t i n g h u m a n n o r m a l g l i a l ce l l s E xp C e l l R e s 9 8 ( 1 ) 1 7 0 1 7 4 1 6 8 P e d e r se n W A a n d F l yn n E R ( 2 0 0 4 ) I n su l i n r e si st a n ce c o n t r i b u t e s t o a b e r r a n t st r e ss r e sp o n se s i n t h e T g 2 5 7 6 m o u se m o d e l o f A l zh e i m e r s d i se a se N e u r o b i o l D i s 1 7 ( 3 ) 5 0 0 5 0 6 1 6 9 D e sb o i s M o u t h o n C C a d o r e t A B l i ve t V a n E g g e l p o e l M J B e r t r a n d F C a r o n M A t f i A C h e r q u i G a n d C a p e a u J. ( 2 0 0 0 ) I n su l i n m e d i a t e d c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d su r vi va l i n vo l ve i n h i b i t i o n o f c Ju n N t e r m i n a l ki n a se s t h r o u g h a p h o s p h a t i d yl i n o si t o l 3 ki n a se a n d m i t o g e n a ct i va t e d p r o t e i n ki n a se p h o s p h a t a s e 1 d e p e n d e n t p a t h w a y E n d o cr i n o l o g y 1 4 1 ( 3 ) 9 2 2 9 3 1 1 7 0 C o n e j o R a n d L o r e n zo M ( 2 0 0 1 ) I n su l i n si g n a l i n g l e a d i n g t o p r o l i f e r a t i o n su r vi va l a n d m e m b r a n e r u f f l i n g i n C 2 C 1 2 m yo b l a st s J C e l l P h ysi o l 1 8 7 ( 1 ) 9 6 1 0 8 1 7 1 R o ch a E M C u n h a D A C a r n e i r o E M B o sch e r o A C S a a d M J. a n d V e l l o so L A ( 2 0 0 2 ) I d e n t i f i ca t i o n o f i n su l i n i n t h e t e a r f i l m a n d i n su l i n r e ce p t o r a n d I G F 1 r e c e p t o r o n t h e h u m a n o c u l a r su r f a ce I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 3 ( 4 ) 9 6 3 9 6 7 1 7 2 S a n ch e z T h o r i n J. C ( 1 9 9 8 ) T h e co r n e a i n d i a b e t e s m e l l i t u s I n t O p h t h a l m o l C l i n 3 8 ( 2 ) 1 9 3 6 1 7 3 K a b o so va A K r a m e r o v, A A A o ki A M M u r p h y, G Z i e ske J. D a n d L j u b i m o v, A V ( 2 0 0 3 ) H u m a n d i a b e t i c co r n e a s p r e se r v e w o u n d h e a l i n g b a se m e n t m e m b r a n e i n t e g r i n a n d M M P 1 0 d i f f e r e n ce s f r o m n o r m a l co r n e a s i n o r g a n cu l t u r e E xp E ye R e s 7 7 ( 2 ) 2 1 1 2 1 7 1 7 4 L j u b i m o v, A V H u a n g Z S H u a n g G H B u r g e so n R E G u l l b e r g D M i n e r J H N i n o m i ya Y S a d o Y a n d K e n n e y, M C ( 1 9 9 8 ) H u m a n co r n e a l e p i t h e l i a l b a s e m e n t m e m b r a n e a n d i n t e g r i n a l t e r a t i o n s i n d i a b e t e s a n d d i a b e t i c r e t i n o p a t h y J H i st o ch e m C yt o ch e m 4 6 ( 9 ) 1 0 3 3 1 0 4 1

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1 7 2 1 7 5 S a g h i za d e h M B r o w n D J C a st e l l o n R C h w a M H u a n g G H L j u b i m o va J. Y R o se n b e r g S S p i r i n K S S t o l i t e n ko R B A d a ch i W K i n o sh i t a S M u r p h y, G W i n d so r L J. K e n n e y, M C a n d L j u b i m o v, A V ( 2 0 0 1 ) O ve r e x p r e ssi o n o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e 1 0 a n d m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a se 3 i n h u m a n d i a b e t i c co r n e a s: a p o ssi b l e m e c h a n i sm o f b a se m e n t m e m b r a n e a n d i n t e g r i n a l t e r a t i o n s A m J P a t h o l 1 5 8 ( 2 ) 7 2 3 7 3 4 1 7 6 W i g h t M ( 2 0 0 1 ) F i b r o b l a st G r o w t h F a ct o r T w o ( F G F 2 ) i n B o vi n e se r u m A r t t o S ci e n ce 2 0 ( 1 ) 1 4 1 7 7 L a r sso n A S ko l d e n b e r g E a n d E r i cso n H ( 2 0 0 2 ) S e r u m a n d p l a s m a l e ve l s o f F G F 2 a n d V E G F i n h e a l t h y b l o o d d o n o r s A n g i o g e n e si s 5 ( 1 2 ) 1 0 7 1 1 0 1 7 8 L o n g C J. R o t h M R T a sh e va E S F u n d e r b u r g h M S m i t R C o n r a d G W a n d F u n d e r b u r g h J. L ( 2 0 0 0 ) F i b r o b l a st g r o w t h f a ct o r 2 p r o m o t e s ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n e xp r e s si o n b y ke r a t o cyt e s i n vi t r o J B i o l C h e m 2 7 5 ( 1 8 ) 1 3 9 1 8 1 3 9 2 3 1 7 9 M u sse l m a n n K K a n e B P a n d H a sse l l J. R ( 2 0 0 3 ) I so l a t i o n o f a p u t a t i ve ke r a t o cyt e a ct i va t i n g f a ct o r f r o m t h e c o r n e a l st r o m a E xp E ye R e s 7 7 ( 3 ) 2 7 3 2 7 9 1 8 0 C a r l so n E C M a m i ya K L i u C Y G e n d r o n R L B i r k, D E F u n d e r b u r g h J. L a n d K a o W W ( 2 0 0 3 ) R o l e o f C ys4 1 i n t h e N t e r m i n a l d o m a i n o f l u m i ca n i n e x vi vo co l l a g e n f i b r i l l o g e n e si s b y cu l t u r e d co r n e a l st r o m a l c e l l s B i o ch e m J 3 6 9 ( P t 3 ) 4 6 1 4 6 8 1 8 1 D u n l e vy, J. R N e a m e P J. V e r g n e s, J. P a n d H a sse l l J. R ( 1 9 9 8 ) I d e n t i f i ca t i o n o f t h e N l i n ke d o l i g o sa cch a r i d e s i t e s i n ch i ck co r n e a l l u m i ca n a n d ke r a t o ca n t h a t r e ce i ve ke r a t a n su l f a t e J B i o l C h e m 2 7 3 ( 1 6 ) 9 6 1 5 9 6 2 1 1 8 2 K r u si u s, T a n d R u o sl a h t i E ( 1 9 8 6 ) P r i m a r y st r u ct u r e o f a n e xt r a c e l l u l a r m a t r i x p r o t e o g l yca n co r e p r o t e i n d e d u ce d f r o m cl o n e d cD N A P r o c N a t l A ca d S ci U S A 8 3 ( 2 0 ) 7 6 8 3 7 6 8 7 1 8 3 S e r r e r o G a n d L e p a k N ( 1 9 9 9 ) I n su l i n b u t n o t I G F I i s r e q u i r e d f o r t h e m a i n t e n a n ce o f t h e a d i p o se p h e n o t yp e i n t h e a d i p o g e n i c ce l l l i n e 1 2 4 6 I n V i t r o C e l l D e v B i o l A n i m 3 5 ( 1 0 ) 6 4 2 6 4 6 1 8 4 S h e H X i o n g S H a zr a S a n d T su ka m o t o H ( 2 0 0 5 ) A d i p o g e n i c t r a n scr i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f h e p a t i c st e l l a t e c e l l s J B i o l C h e m 2 8 0 ( 6 ) 4 9 5 9 4 9 6 7

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1 7 3 1 8 5 W i l l i a m s, B R G e l m a n R A P o p p ke D C a n d P i e z, K A ( 1 9 7 8 ) C o l l a g e n f i b r i l f o r m a t i o n O p t i m a l i n vi t r o co n d i t i o n s a n d p r e l i m i n a r y ki n e t i c r e su l t s J. B i o l C h e m 2 5 3 ( 1 8 ) 6 5 7 8 6 5 8 5 1 8 6 S i l ve r F H a n d B i r k, D E ( 1 9 8 3 ) K i n e t i c a n a l ysi s o f c o l l a g e n f i b r i l l o g e n e si s: I U se o f t u r b i d i t y t i m e d a t a C o l l R e l a t R e s 3 ( 5 ) 3 9 3 4 0 5 1 8 7 L i W V e r g n e s, J P C o r n u e t P K a n d H a sse l l J. R ( 1 9 9 2 ) cD N A cl o n e t o ch i ck co r n e a l c h o n d r o i t i n / d e r m a t a n s u l f a t e p r o t e o g l yca n r e ve a l s i d e n t i t y t o d e co r i n A r c h B i o ch e m B i o p h ys 2 9 6 ( 1 ) 1 9 0 1 9 7 1 8 8 B l o ch b e r g e r T C C o r n u e t P K a n d H a sse l l J. R ( 1 9 9 2 ) I so l a t i o n a n d p a r t i a l ch a r a ct e r i za t i o n o f l u m i ca n a n d d e co r i n f r o m a d u l t ch i cke n co r n e a s. A ke r a t a n su l f a t e co n t a i n i n g i so f o r m o f d e c o r i n i s d e ve l o p m e n t a l l y r e g u l a t e d J B i o l C h e m 2 6 7 ( 2 9 ) 2 0 6 1 3 2 0 6 1 9 1 8 9 F u n d e r b u r g h J. L F u n d e r b u r g h M L B r o w n S J. V e r g n e s J. P H a sse l l J. R M a n n M M a n d C o n r a d G W ( 1 9 9 3 ) S e q u e n ce a n d st r u ct u r a l i m p l i ca t i o n s o f a b o vi n e co r n e a l ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n co r e p r o t e i n P r o t e i n 3 7 B r e p r e s e n t s b o vi n e l u m i ca n a n d p r o t e i n s 3 7 A a n d 2 5 a r e u n i q u e J B i o l C h e m 2 6 8 ( 1 6 ) 1 1 8 7 4 1 1 8 8 0 1 9 0 F e ssl e r J. H D o e g e K J. D u n ca n K G a n d F e ssl e r L I ( 1 9 8 5 ) B i o syn t h e si s o f co l l a g e n J C e l l B i o ch e m 2 8 ( 1 ) 3 1 3 7 1 9 1 F e ssl e r J. H a n d F e ssl e r L I ( 1 9 7 8 ) B i o syn t h e si s o f p r o co l l a g e n A n n u R e v B i o ch e m 4 7 1 2 9 1 6 2 1 9 2 G a l l o p P M a n d P a z, M A ( 1 9 7 5 ) P o st t r a n sl a t i o n a l p r o t e i n m o d i f i ca t i o n s, w i t h sp e ci a l a t t e n t i o n t o co l l a g e n a n d e l a st i n P h ysi o l R e v 5 5 ( 3 ) 4 1 8 4 8 7 1 9 3 M u r a d S G r o ve D L i n d b e r g K A R e y n o l d s, G S i va r a j a h A a n d P i n n e l l S R ( 1 9 8 1 ) R e g u l a t i o n o f co l l a g e n sy n t h e si s b y a sco r b i c a ci d P r o c N a t l A ca d S ci U S A 7 8 ( 5 ) 2 8 7 9 2 8 8 2 1 9 4 D a vi d so n J. M L u V a l l e P A Z o i a O Q u a g l i n o D Jr a n d G i r o M ( 1 9 9 7 ) A sco r b a t e d i f f e r e n t i a l l y r e g u l a t e s e l a st i n a n d co l l a g e n b i o syn t h e si s i n va scu l a r sm o o t h m u scl e ce l l s a n d ski n f i b r o b l a st s b y p r e t r a n sl a t i o n a l m e ch a n i sm s J B i o l C h e m 2 7 2 ( 1 ) 3 4 5 3 5 2 1 9 5 S ch w a r z, R I ( 1 9 8 5 ) P r o co l l a g e n se cr e t i o n m e e t s t h e m i n i m u m r e q u i r e m e n t s f o r t h e r a t e co n t r o l l i n g st e p i n t h e a sco r b a t e i n d u ct i o n o f p r o co l l a g e n syn t h e si s J B i o l C h e m % R 2 6 0 ( 5 ) 3 0 4 5 3 0 4 9

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1 7 4 1 9 6 K a o W W B e r g R A a n d P r o cko p D J. ( 1 9 7 7 ) K i n e t i cs f o r t h e se cr e t i o n o f p r o c o l l a g e n b y f r e sh l y i s o l a t e d t e n d o n ce l l s J B i o l C h e m 2 5 2 ( 2 3 ) 8 3 9 1 8 3 9 7 1 9 7 K a o W W P r o cko p D J. a n d B e r g R A ( 1 9 7 9 ) K i n e t i cs f o r t h e se cr e t i o n o f n o n h e l i ca l p r o c o l l a g e n b y f r e sh l y i so l a t e d t e n d o n ce l l s J B i o l C h e m 2 5 4 ( 7 ) 2 2 3 4 2 2 4 3 1 9 8 F e ssl e r L I a n d F e ssl e r J. H ( 1 9 7 4 ) P r o t e i n a sse m b l y o f p r o c o l l a g e n a n d e f f e ct s o f h yd r o xyl a t i o n J B i o l C h e m 2 4 9 ( 2 3 ) 7 6 3 7 7 6 4 6 1 9 9 C o h e n I K a n d K e i se r H R ( 1 9 7 6 ) D i sr u p t i o n o f h e a l e d sca r s i n scu r vy t h e r e su l t o f a d i se q u i l i b r i u m i n co l l a g e n m e t a b o l i sm P l a st R e co n s t r S u r g 5 7 ( 2 ) 2 1 3 2 1 5 2 0 0 R o ss, R a n d B e n d i t t E P ( 1 9 6 2 ) W o u n d h e a l i n g a n d co l l a g e n f o r m a t i o n I I F i n e st r u ct u r e i n e x p e r i m e n t a l scu r vy J C e l l B i o l 1 2 5 3 3 5 5 1 2 0 1 R i n g vo l d A A n d e r sse n E a n d K j o n n i kse n I ( 2 0 0 0 ) D i st r i b u t i o n o f a sco r b a t e i n t h e a n t e r i o r b o vi n e e ye I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 1 ( 1 ) 2 0 2 3 2 0 2 R i n g vo l d A ( 1 9 9 8 ) C o r n e a l e p i t h e l i u m a n d U V p r o t e ct i o n o f t h e e ye A ct a O p h t h a l m o l S ca n d 7 6 ( 2 ) 1 4 9 1 5 3 2 0 3 B r u b a ke r R F B o u r n e W M B a ch m a n L A a n d M cL a r e n J. W ( 2 0 0 0 ) A sco r b i c a ci d c o n t e n t o f h u m a n co r n e a l e p i t h e l i u m I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 1 ( 7 ) 1 6 8 1 1 6 8 3 2 0 4 L e vi n so n R A P a t e r so n C A a n d P f i st e r R R ( 1 9 7 6 ) A sco r b i c a ci d p r e ve n t s c o r n e a l u l ce r a t i o n a n d p e r f o r a t i o n f o l l o w i n g e xp e r i m e n t a l a l k a l i b u r n s I n v e st O p h t h a l m o l 1 5 ( 1 2 ) 9 8 6 9 9 3 2 0 5 P f i st e r R R a n d P a t e r so n C A ( 1 9 8 0 ) A sc o r b i c a ci d i n t h e t r e a t m e n t o f a l ka l i b u r n s o f t h e e y e O p h t h a l m o l o g y 8 7 ( 1 0 ) 1 0 5 0 1 0 5 7 2 0 6 P f i st e r R R a n d P a t e r so n C A ( 1 9 7 7 ) A d d i t i o n a l cl i n i ca l a n d m o r p h o l o g i ca l o b se r va t i o n s o n t h e f a vo r a b l e e f f e ct o f a sco r b a t e i n e xp e r i m e n t a l o cu l a r a l ka l i b u r n s I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 1 6 ( 6 ) 4 7 8 4 8 7 2 0 7 S t o j a n o vi c, A R i n g vo l d A a n d N i t t e r T ( 2 0 0 3 ) A sco r b a t e p r o p h yl a xi s f o r co r n e a l h a z e a f t e r p h o t o r e f r a ct i ve ke r a t e ct o m y J R e f r a ct S u r g 1 9 ( 3 ) 3 3 8 3 4 3 2 0 8 S a i ka S ( 1 9 9 3 ) A sco r b i c a ci d a n d p r o l i f e r a t i o n o f cu l t u r e d r a b b i t ke r a t o cyt e s C o r n e a 1 2 ( 3 ) 1 9 1 1 9 8

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1 7 5 2 0 9 S a i ka S K a n a g a w a R U e n o ya m a K H i r o i K a n d H i r a o k a J. ( 1 9 9 1 ) L a sco r b i c a ci d 2 p h o sp h a t e a p h o sp h a t e d e r i va t i ve o f L a sco r b i c a ci d e n h a n ce s t h e g r o w t h o f c u l t u r e d r a b b i t ke r a t o cyt e s G r a e f e s A r ch C l i n E xp O p h t h a l m o l 2 2 9 ( 1 ) 7 9 8 3 2 1 0 S a i ka S U e n o ya m a K H i r o i K a n d O o sh i m a A ( 1 9 9 2 ) L a sco r b i c a ci d 2 p h o sp h a t e e n h a n ce s t h e p r o d u ct i o n o f t yp e I a n d t yp e I I I co l l a g e n p e p t i d e s i n c u l t u r e d r a b b i t ke r a t o cyt e s O p h t h a l m i c R e s 2 4 ( 2 ) 6 8 7 2 2 1 1 M u sse l m a n n K A l e xa n d r o u B K a n e B a n d H a sse l l J. R ( 2 0 0 5 ) M a i n t e n a n ce o f t h e ke r a t o cyt e p h e n o t y p e d u r i n g ce l l p r o l i f e r a t i o n st i m u l a t e d b y i n su l i n J B i o l C h e m 2 8 0 ( 3 8 ) 3 2 6 3 4 3 2 6 3 9 2 1 2 P e t e r ko f sky, B a n d D i e g e l m a n n R ( 1 9 7 1 ) U se o f a m i xt u r e o f p r o t e i n a s e f r e e co l l a g e n a se s f o r t h e sp e ci f i c a ssa y o f r a d i o a ct i ve co l l a g e n i n t h e p r e se n ce o f o t h e r p r o t e i n s B i o ch e m i st r y 1 0 9 8 8 9 9 4 2 1 3 C a o M W e st e r h a u s e n L a r so n A N i yi b i zi C K a va l ko vi ch K G e o r g e scu H I R i zzo C F H e b d a P A S t e f a n o vi c R a ci c, M a n d E va n s, C H ( 1 9 9 7 ) N i t r i c o xi d e i n h i b i t s t h e sy n t h e si s o f t yp e I I co l l a g e n w i t h o u t a l t e r i n g C o l 2 A 1 m R N A a b u n d a n c e : p r o l yl h yd r o xyl a se a s a p o ssi b l e t a r g e t B i o ch e m J. 3 2 4 ( ( P t 1 ) ) 3 0 5 3 1 0 2 1 4 G o vi n d r a j P W e st L S m i t h S a n d H a sse l l J. R ( 2 0 0 6 ) M o d u l a t i o n o f F G F 2 b i n d i n g t o ch o n d r o cyt e s f r o m t h e d e ve l o p i n g g r o w t h p l a t e b y p e r l e ca n M a t r i x B i o l 2 1 5 S a sa k i T M a j a m a a K a n d U i t t o J. ( 1 9 8 7 ) R e d u ct i o n o f c o l l a g e n p r o d u ct i o n i n ke l o i d f i b r o b l a st cu l t u r e s b y e t h yl 3 4 d i h y d r o xyb e n zo a t e I n h i b i t i o n o f p r o l yl h yd r o xyl a se a ct i vi t y a s a m e ch a n i sm o f a ct i o n J B i o l C h e m 2 6 2 ( 1 9 ) 9 3 9 7 9 4 0 3 2 1 6 M i t su m o t o Y L i u Z a n d K l i p A ( 1 9 9 4 ) A l o n g l a st i n g vi t a m i n C d e r i va t i ve a sc o r b i c a ci d 2 p h o sp h a t e i n cr e a s e s m yo g e n i n g e n e e xp r e ssi o n a n d p r o m o t e s d i f f e r e n t i a t i o n i n L 6 m u scl e ce l l s B i o ch e m B i o p h ys R e s C o m m u n 1 9 9 ( 1 ) 3 9 4 4 0 2 2 1 7 N a n d a n D C l a r ke E P B a l l E H a n d S a n w a l B D ( 1 9 9 0 ) E t h yl 3 4 d i h yd r o xyb e n zo a t e i n h i b i t s m yo b l a st d i f f e r e n t i a t i o n : e vi d e n c e f o r a n e sse n t i a l r o l e o f co l l a g e n J C e l l B i o l 1 1 0 ( 5 ) 1 6 7 3 1 6 7 9 2 1 8 G o l d st e i n R H P o l i ks, C F P i l ch P F S m i t h B D a n d F i n e A ( 1 9 8 9 ) S t i m u l a t i o n o f co l l a g e n f o r m a t i o n b y i n su l i n a n d i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r I i n cu l t u r e s o f h u m a n l u n g f i b r o b l a st s E n d o cr i n o l o g y 1 2 4 ( 2 ) 9 6 4 9 7 0

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1 7 6 2 1 9 G o r e H ye r E P a n n u J. S m i t h E A G r o t e n d o r st G a n d T r o j a n o w ska M ( 2 0 0 3 ) S e l e ct i ve s t i m u l a t i o n o f co l l a g e n sy n t h e si s i n t h e p r e se n ce o f co st i m u l a t o r y i n su l i n si g n a l i n g b y co n n e ct i ve t i ssu e g r o w t h f a ct o r i n scl e r o d e r m a f i b r o b l a st s A r t h r i t i s R h e u m 4 8 ( 3 ) 7 9 8 8 0 6 2 2 0 M a d i b a l l y, S V S o l o m o n V M i t ch e l l R N V a n D e W a t e r L Y a r m u s h M L a n d T o n e r M ( 2 0 0 3 ) I n f l u e n c e o f i n su l i n t h e r a p y o n b u r n w o u n d h e a l i n g i n r a t s J S u r g R e s 1 0 9 ( 2 ) 9 2 1 0 0 2 2 1 S a r a g a s, S A r f f a R R a b i n B K r o n i sh J. M i l l e r D a n d M a y m a n C ( 1 9 8 5 ) R e ve r sa l o f w o u n d st r e n g t h r e t a r d a t i o n b y a d d i t i o n o f i n su l i n t o co r t i co st e r o i d t h e r a p y A n n O p h t h a l m o l 1 7 ( 7 ) 4 2 8 4 3 0 2 2 2 C h a kr a va r t i S ( 2 0 0 6 ) F o cu s o n M o l e cu l e s : K e r a t o ca n ( K E R A ) E xp E ye R e s 8 2 ( 2 ) 1 8 3 1 8 4 2 2 3 K a o W W F u n d e r b u r g h J. L X i a Y L i u C Y a n d C o n r a d G W ( 2 0 0 6 ) F o cu s o n m o l e cu l e s: l u m i ca n E xp E ye R e s 8 2 ( 1 ) 3 4 2 2 4 S co t t J. E ( 1 9 8 8 ) P r o t e o g l yca n f i b r i l l a r c o l l a g e n i n t e r a c t i o n s B i o ch e m J 2 5 2 ( 2 ) 3 1 3 3 2 3 2 2 5 S co t t J. E a n d H a i g h M ( 1 9 8 8 ) I d e n t i f i ca t i o n o f sp e ci f i c b i n d i n g si t e s f o r ke r a t a n s u l p h a t e p r o t e o g l yca n s a n d ch o n d r o i t i n d e r m a t a n s u l p h a t e p r o t e o g l yc a n s o n c o l l a g e n f i b r i l s i n co r n e a b y t h e u se o f cu p r o m e r o n i c b l u e i n c r i t i ca l e l e ct r o l yt e c o n ce n t r a t i o n t e ch n i q u e s B i o ch e m J 2 5 3 ( 2 ) 6 0 7 6 1 0 2 2 6 S co t t J. E ( 1 9 9 1 ) P r o t e o g l yca n : c o l l a g e n i n t e r a ct i o n s i n co n n e ct i ve t i ssu e s U l t r a st r u ct u r a l b i o ch e m i ca l f u n c t i o n a l a n d e vo l u t i o n a r y a s p e ct s I n t J B i o l M a cr o m o l 1 3 ( 3 ) 1 5 7 1 6 1 2 2 7 K e e n e D R S a n A n t o n i o J. D M a yn e R M cQ u i l l a n D J. S a r r i s, G S a n t o r o S A a n d I o zzo R V ( 2 0 0 0 ) D e co r i n b i n d s n e a r t h e C t e r m i n u s o f t yp e I co l l a g e n J B i o l C h e m 2 7 5 ( 2 9 ) 2 1 8 0 1 2 1 8 0 4 2 2 8 B a r n e s, M J. ( 1 9 6 9 ) A sco r b i c a ci d a n d t h e b i o syn t h e si s o f c o l l a g e n a n d e l a st i n B i b l N u t r D i e t a 1 3 8 6 9 8 2 2 9 B r o d o vsky, S C M cC a r t y, C A S n i b so n G L o u g h n a n M S u l l i va n L D a n i e l l M a n d T a yl o r H R ( 2 0 0 0 ) M a n a g e m e n t o f a l ka l i b u r n s : a n 1 1 ye a r r e t r o sp e c t i ve r e vi e w O p h t h a l m o l o g y 1 0 7 ( 1 0 ) 1 8 2 9 1 8 3 5 2 3 0 Z i m m e r m a n n O Z w a ka T P M a r x, N T o r ze w ski M B u ch e r A G u i l l i a r d P H a n n e ku m A H o m b a ch V a n d T o r z e w ski J. ( 2 0 0 6 ) S e r u m st a r va t i o n a n d g r o w t h f a ct o r r e ce p t o r e xp r e ssi o n i n v a scu l a r sm o o t h m u scl e ce l l s J V a sc R e s 4 3 ( 2 ) 1 5 7 1 6 5

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1 7 7 2 3 1 P l e d g e r W J. S t i l e s, C D A n t o n i a d e s H N a n d S ch e r C D ( 1 9 7 7 ) I n d u ct i o n o f D N A syn t h e si s i n B A L B / c 3 T 3 c e l l s b y se r u m co m p o n e n t s: r e e va l u a t i o n o f t h e co m m i t m e n t p r o c e ss P r o c N a t l A ca d S ci U S A 7 4 ( 1 0 ) 4 4 8 1 4 4 8 5 2 3 2 S t i l e s, C D C a p o n e G T S ch e r C D A n t o n i a d e s, H N V a n W yk, J. J. a n d P l e d g e r W J. ( 1 9 7 9 ) D u a l co n t r o l o f c e l l g r o w t h b y s o m a t o m e d i n s a n d p l a t e l e t d e r i ve d g r o w t h f a ct o r P r o c N a t l A ca d S ci U S A 7 6 ( 3 ) 1 2 7 9 1 2 8 3 2 3 3 S t i l e s, C D I sb e r g R R P l e d g e r W J. A n t o n i a d e s, H N a n d S ch e r C D ( 1 9 7 9 ) C o n t r o l o f t h e B a l b / c 3 T 3 ce l l cyc l e b y n u t r i e n t s a n d se r u m f a ct o r s: a n a l ysi s u si n g p l a t e l e t d e r i ve d g r o w t h f a ct o r a n d p l a t e l e t p o o r p l a sm a J C e l l P h ysi o l 9 9 ( 3 ) 3 9 5 4 0 5 2 3 4 F i n i M E G i r a r d M T a n d M a t su b a r a M ( 1 9 9 2 ) C o l l a g e n o l yt i c/ g e l a t i n o l yt i c e n zym e s i n co r n e a l w o u n d h e a l i n g A ct a O p h t h a l m o l S u p p l ( 2 0 2 ) 2 6 3 3 2 3 5 G i r a r d M T M a t s u b a r a M K u b l i n C T e ssi e r M J. C i n t r o n C a n d F i n i M E ( 1 9 9 3 ) S t r o m a l f i b r o b l a st s syn t h e si ze co l l a g e n a se a n d st r o m e l ysi n d u r i n g l o n g t e r m t i ss u e r e m o d e l i n g J C e l l S ci 1 0 4 ( P t 4 ) 1 0 0 1 1 0 1 1 2 3 6 R a j a va sh i st h T B X u X P Jo vi n g e S M e i se l S X u X O C h a i N N F i sh b e i n M C K a u l S C e r ce k, B S h a r i f i B a n d S h a h P K ( 1 9 9 9 ) M e m b r a n e t yp e 1 m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a se e xp r e ssi o n i n h u m a n a t h e r o scl e r o t i c p l a q u e s: e vi d e n ce f o r a ct i va t i o n b y p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s C i r cu l a t i o n 9 9 ( 2 4 ) 3 1 0 3 3 1 0 9 2 3 7 C h a kr a va r t i S W u F V i j N R o b e r t s L a n d Jo yce S ( 2 0 0 4 ) M i cr o a r r a y st u d i e s r e ve a l m a cr o p h a g e l i ke f u n ct i o n o f st r o m a l k e r a t o cyt e s i n t h e co r n e a I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 5 ( 1 0 ) 3 4 7 5 3 4 8 4 2 3 8 S m i n e A a n d P l a n t n e r J. J ( 1 9 9 7 ) M e m b r a n e t yp e 1 m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a se i n h u m a n o cu l a r t i ssu e s C u r r E ye R e s 1 6 ( 9 ) 9 2 5 9 2 9 2 3 9 Z h a n g D a n d B r o d t P ( 2 0 0 3 ) T yp e 1 i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r r e g u l a t e s M T 1 M M P syn t h e si s a n d t u m o r i n va si o n vi a P I 3 ki n a se / A kt si g n a l i n g O n co g e n e 2 2 ( 7 ) 9 7 4 9 8 2 2 4 0 S o l o m o n V M a d i h a l l y, S M i t ch e l l R N Y a r m u sh M a n d T o n e r M ( 2 0 0 2 ) A n t i p r o t e o l yt i c a ct i o n o f i n su l i n i n b u r n i n j u r e d r a t s J S u r g R e s 1 0 5 ( 2 ) 2 3 4 2 4 2

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1 7 8 2 4 1 P e r e i r a C M u r p h y, K Je sch ke M a n d H e r n d o n D N ( 2 0 0 5 ) P o st b u r n m u scl e w a st i n g a n d t h e e f f e ct s o f t r e a t m e n t s I n t J B i o ch e m C e l l B i o l 3 7 ( 1 0 ) 1 9 4 8 1 9 6 1 2 4 2 A sa n u m a K S h i r a t o I I s h i d o h K K o m i n a m i E a n d T o m i n o Y ( 2 0 0 2 ) S e l e ct i ve m o d u l a t i o n o f t h e se cr e t i o n o f p r o t e i n a se s a n d t h e i r i n h i b i t o r s b y g r o w t h f a ct o r s i n c u l t u r e d d i f f e r e n t i a t e d p o d o c yt e s K i d n e y I n t 6 2 ( 3 ) 8 2 2 8 3 1 2 4 3 O p b r o e k, A K e n n e y, M C a n d B r o w n D ( 1 9 9 3 ) C h a r a ct e r i za t i o n o f a h u m a n co r n e a l m e t a l l o p r o t e i n a se i n h i b i t o r ( T I M P 1 ) C u r r E ye R e s 1 2 ( 1 0 ) 8 7 7 8 8 3 2 4 4 Y a n L M o s e s, M A H u a n g S a n d I n g b e r D E ( 2 0 0 0 ) A d h e si o n d e p e n d e n t co n t r o l o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e 2 a ct i va t i o n i n h u m a n ca p i l l a r y e n d o t h e l i a l ce l l s J C e l l S ci 1 1 3 ( P t 2 2 ) 3 9 7 9 3 9 8 7 2 4 5 C o l l i e r S A ( 2 0 0 1 ) I s t h e co r n e a l d e g r a d a t i o n i n ke r a t o co n u s ca u se d b y m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s? C l i n E xp e r i m e n t O p h t h a l m o l 2 9 ( 6 ) 3 4 0 3 4 4 2 4 6 B e r n st e i n A M G r e e n b e r g R S T a l i a n a L a n d M a s u r S K ( 2 0 0 4 ) U r o ki n a se a n c h o r s u P A R t o t h e a ct i n cyt o ske l e t o n I n ve s t O p h t h a l m o l V i s S ci 4 5 ( 9 ) 2 9 6 7 2 9 7 7 2 4 7 W i l so n S E ( 1 9 9 7 ) M o l e cu l a r ce l l b i o l o g y f o r t h e r e f r a ct i ve co r n e a l su r g e o n : p r o g r a m m e d ce l l d e a t h a n d w o u n d h e a l i n g J R e f r a ct S u r g 1 3 ( 2 ) 1 7 1 1 7 5 2 4 8 M o l l e r P e d e r se n T C a va n a g h H D P e t r o l l W M a n d J e st e r J. V ( 1 9 9 8 ) N e u t r a l i zi n g a n t i b o d y t o T G F b e t a m o d u l a t e s st r o m a l f i b r o si s b u t n o t r e g r e ssi o n o f p h o t o a b l a t i ve e f f e ct f o l l o w i n g P R K C u r r E ye R e s 1 7 ( 7 ) 7 3 6 7 4 7 2 4 9 Je st e r J. V H u a n g J. F i sh e r S S p i e ke r m a n J. C h a n g J. H W r i g h t W E a n d S h a y, J. W ( 2 0 0 3 ) M yo f i b r o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n o f n o r m a l h u m a n ke r a t o cyt e s a n d h T E R T e x t e n d e d l i f e h u m a n co r n e a l f i b r o b l a s t s I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 4 ( 5 ) 1 8 5 0 1 8 5 8 2 5 0 F i n i M E a n d S t r a m e r B M ( 2 0 0 5 ) H o w t h e co r n e a h e a l s: co r n e a sp e ci f i c r e p a i r m e ch a n i sm s a f f e ct i n g s u r g i ca l o u t co m e s C o r n e a 2 4 ( 8 S u p p l ) S 2 S 1 1 2 5 1 R o ch a E M C u n h a D A C a r n e i r o E M B o sch e r o A C S a a d M J. a n d V e l l o so L A ( 2 0 0 2 ) I n su l i n i n su l i n r e ce p t o r a n d i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r I r e ce p t o r o n t h e h u m a n o cu l a r su r f a c e A d v E xp M e d B i o l 5 0 6 ( P t A ) 6 0 7 6 1 0

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1 7 9 2 5 2 B u r r e n C P B e r k a J. L E d m o n d s o n S R W e r t h e r G A a n d B a t ch J. A ( 1 9 9 6 ) L o ca l i za t i o n o f m R N A s f o r i n su l i n l i ke g r o w t h f a c t o r I ( I G F I ) I G F I r e ce p t o r a n d I G F b i n d i n g p r o t e i n s i n r a t e ye I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 3 7 ( 7 ) 1 4 5 9 1 4 6 8 2 5 3 O h Y G u ce v, Z N g L M u l l e r H L a n d R o se n f e l d R G ( 1 9 9 5 ) A n t i p r o l i f e r a t i ve a ct i o n s o f i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r b i n d i n g p r o t e i n ( I G F B P ) 3 i n h u m a n b r e a st ca n c e r ce l l s P r o g G r o w t h F a ct o r R e s 6 ( 2 4 ) 5 0 3 5 1 2 2 5 4 S ch o e n T J. B o n d y, C A Z h o u J. D h a w a n R M a zu r u k, K A r n o l d D R R o d r i g u e z, I R W a l d b i l l i g R J. B e e b e D C a n d C h a d e r G J. ( 1 9 9 5 ) D i f f e r e n t i a l t e m p o r a l a n d sp a t i a l e xp r e ssi o n o f i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r b i n d i n g p r o t e i n 2 i n d e v e l o p i n g ch i ck o c u l a r t i ssu e s I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 3 6 ( 1 3 ) 2 6 5 2 2 6 6 2 2 5 5 A r n o l d D R M o sh a ye d i P S ch o e n T J. J o n e s, B E C h a d e r G J. a n d W a l d b i l l i g R J. ( 1 9 9 3 ) D i st r i b u t i o n o f I G F I a n d I I I G F b i n d i n g p r o t e i n s ( I G F B P s) a n d I G F B P m R N A i n o c u l a r f l u i d s a n d t i ssu e s: p o t e n t i a l si t e s o f syn t h e si s o f I G F B P s i n a q u e o u s a n d v i t r e o u s E xp E ye R e s 5 6 ( 5 ) 5 5 5 5 6 5 2 5 6 I zu m i K K u r o sa k a D I w a t a T O g u ch i Y T a n a ka Y M a sh i m a Y a n d T su b o t a K ( 2 0 0 6 ) I n vo l ve m e n t o f i n su l i n l i ke g r o w t h f a c t o r I a n d i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r b i n d i n g p r o t e i n 3 i n c o r n e a l f i b r o b l a st s d u r i n g co r n e a l w o u n d h e a l i n g I n ve s t O p h t h a l m o l V i s S ci 4 7 ( 2 ) 5 9 1 5 9 8 2 5 7 H o d g ki n so n S C N a p i e r J. R S p e n ce r G S a n d B a ss, J. J. ( 1 9 9 4 ) G l yco sa m i n o g l yca n b i n d i n g c h a r a c t e r i st i cs o f t h e i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r b i n d i n g p r o t e i n s J M o l E n d o cr i n o l 1 3 ( 1 ) 1 0 5 1 1 2 2 5 8 B u r r e n C P B e r k a J. L a n d B a t c h J. A ( 1 9 9 7 ) L o c a l i za t i o n st u d i e s o f I G F B P 2 a n d I G F B P 5 i n t h e a n t e r i o r c o m p a r t m e n t o f t h e e ye C u r r E ye R e s 1 6 ( 3 ) 2 5 6 2 6 2 2 5 9 S ch o n h e r r E S u n d e r k o t t e r C I o zzo R V a n d S ch a e f e r L ( 2 0 0 5 ) D e co r i n a n o ve l p l a ye r i n t h e i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r syst e m J B i o l C h e m 2 8 0 ( 1 6 ) 1 5 7 6 7 1 5 7 7 2 2 6 0 D a n i a s, J. a n d S t yl i a n o p o u l o u F ( 1 9 9 0 ) E xp r e ssi o n o f I G F I a n d I G F I I g e n e s i n t h e a d u l t r a t e y e C u r r E ye R e s 9 ( 4 ) 3 7 9 3 8 6 2 6 1 C u t h b e r t so n R A B e ck, F S e n i o r P V H a r a l a m b i d i s, J. P e n sch o w J. D a n d C o g h l a n J. P ( 1 9 8 9 ) I n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r I I m a y p l a y a l o ca l r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f o cu l a r si z e D e ve l o p m e n t 1 0 7 ( 1 ) 1 2 3 1 3 0

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1 8 0 2 6 2 R a n d h a w a R a n d C o h e n P ( 2 0 0 5 ) T h e r o l e o f t h e i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r syst e m i n p r e n a t a l g r o w t h M o l G e n e t M e t a b 8 6 ( 1 2 ) 8 4 9 0 2 6 3 H a se l b a ch e r G K I r m i n g e r J. C Z a p f J. Z i e g l e r W H a n d H u m b e l R E ( 1 9 8 7 ) I n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r I I i n h u m a n a d r e n a l p h e o ch r o m o cyt o m a s a n d W i l m s t u m o r s: e x p r e ssi o n a t t h e m R N A a n d p r o t e i n l e v e l P r o c N a t l A ca d S ci U S A 8 4 ( 4 ) 1 1 0 4 1 1 0 6 2 6 4 L e R o i t h D a n d R o b e r t s, C T Jr ( 2 0 0 3 ) T h e i n su l i n l i ke g r o w t h f a c t o r syst e m a n d c a n ce r C a n ce r L e t t 1 9 5 ( 2 ) 1 2 7 1 3 7 2 6 5 V i n ce n t A M a n d F e l d m a n E L ( 2 0 0 2 ) C o n t r o l o f ce l l s u r vi va l b y I G F si g n a l i n g p a t h w a ys G r o w t h H o r m I G F R e s 1 2 ( 4 ) 1 9 3 1 9 7 2 6 6 Y o sh i d a S S h i m m u r a S S h i m a za ki J. S h i n o za ki N a n d T su b o t a K ( 2 0 0 5 ) S e r u m F r e e S p h e r o i d C u l t u r e o f M o u s e C o r n e a l K e r a t o cyt e s I n ve st O p h t h a l m o l V i s. S ci % R 1 0 1 1 6 7 / i o vs 0 4 1 4 0 5 4 6 ( 5 ) 1 6 5 3 1 6 5 8 2 6 7 F u n d e r b u r g h M L M a n n M M a n d F u n d e r b u r g h J. L ( 2 0 0 6 ) K e r a t o cyt e D i f f e r e n t i a t i o n i n vi t r o : I t s A b o u t M a t r i x I n t e r a ct i o n I n ve st O p h t h a l m o l V i s. S ci 4 7 ( 5 ) 2 7 0 8 2 6 8 F u n d e r b u r g h J. L B i r k, D E a n d D u Y ( 2 0 0 6 ) S t e m C e l l s F o r m a C o r n e a L i ke T i ssu e i n vi t r o I n ve st O p h t h a l m o l V i s. S ci 4 7 ( 5 ) 1 1 0 8 2 6 9 E sp a n a E M K a w a ki t a T L i u C Y a n d T se n g S C ( 2 0 0 4 ) C D 3 4 e xp r e ssi o n b y cu l t u r e d h u m a n ke r a t o cyt e s i s d o w n r e g u l a t e d d u r i n g m yo f i b r o b l a st d i f f e r e n t i a t i o n i n d u ce d b y T G F b e t a 1 I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 4 5 ( 9 ) 2 9 8 5 2 9 9 1 2 7 0 F u n d e r b u r g h J. L e t a l P r o t e o g l yca n e xp r e s si o n d u r i n g t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a ct o r b e t a i n d u ce d ke r a t o cyt e m yo f i b r o b l a st t r a n sd i f f e r e n t i a t i o n J B i o l C h e m 2 0 0 1 2 7 6 ( 4 7 ) : p 4 4 1 7 3 8

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1 8 1 A PPE N D I X A M e t h o d t o p r e p a r e s t r o m a l e x t r a c t

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1 8 2 1 S cr a p e t h e e p i t h e l i u m o f t h e co r n e a o f f u si n g a # 1 0 sca l p e l b l a d e a n d e xci s e t h e co r n e a u si n g a # 1 1 sc a l p e l b l a d e 2 R e m o ve t h e e n d o t h e l i u m b y b l o t t i n g a g a i n st f i l t e r p a p e r 3 S n a p f r e e ze t h e co r n e a s b y p l a ci n g t h e m o n a l u m i n u m f o i l p l a ce d o v e r d r y i ce 4 A f t e r t h e co r n e a s a r e f r o ze n s o l i d p l a ce i n p r e w e i g h e d 5 0 m l co n i c a l s, w e i g h a g a i n a n d f r e e z e n o t i n g t h e w e i g h t o f t h e a d d e d co r n e a s 5 A d d so l i d l y f r o ze n c o r n e a s i n t o a W a r i n g b l e n d e r ch i l l e d w i t h a n d st i l l co n t a i n i n g l i q u i d N i t r o g e n a n d p u l ve r i ze t h e c o r n e a s, 1 0 a t a t i m e f o r 3 0 se co n d s a t a h i g h sp e e d se t t i n g 6 P o u r t h e p u l ve r i ze d st r o m a s i n t o 1 0 vo l u m e s o f D M E M / F 1 2 o f t o t a l co r n e a w e i g h t t o b e p u l ve r i ze d R e p e a t u n t i l a l l c o r n e a s h a ve b e e n u se d S t i r a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 0 m i n u t e s t o t h a w t h e co r n e a s. 7 C o n t i n u e st i r r i n g f o r 3 3 0 m i n u t e s ( 5 5 h o u r s) a t 4 C 8 P o u r sl u r r y i n t o p o l yca r b o n a t e t u b e s, a n d sp i n d o w n i n so l u b l e m a t e r i a l a t 2 0 0 0 0 x g f o r 1 5 m i n u t e s a t 4 C 9 P o u r cl e a r e d su p e r n a t a n t i n t o 3 5 m l p o l yc a r b o n a t e t u b e s. S p i n a t 3 3 0 0 0 r p m i n a T i 5 2 0 0 f o r 6 0 m i n u t e s t o p r e ci p i t a t e r e m a i n i n g i n so l u b l e m a t e r i a l 1 0 S t e r i l i ze e xt r a ct b y f i l t e r i n g u si n g a 0 2 u m f i l t e r u n i t A l i q u o t 5 o r 1 0 m l i n t o 1 5 o r 5 0 m l co n i ca l s, a n d f r e e ze a t 8 0 C u n t i l r e a d y t o u se T h i s i s 1 0 0 % e xt r a ct 1 1 P r e p a r e a t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n cu r ve f o r t h e b a t ch t o d e t e r m i n e t h e co n ce n t r a t i o n t h a t g i ve s t h e m a xi m u m t h y m i d i n e i n co r p o r a t i o n 1 2 B e f o r e u se t h a w t h e r e q u i r e d a m o u n t a d d f r e sh 1 X D M E M / F 1 2 a n d u se a s cu l t u r e m e d i u m

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A B O U T T H E A U T H O R K u r t M u sse l m a n n w a s b o r n o n A u g u st 2 6 1 9 7 4 i n L i m a P e r u A f t e r g r a d u a t i n g f r o m h i g h sch o o l i n L i m a h e m o ve d t o G e r m a n y a n d co m p l e t e d t h e A b i t u r H e st a r t e d a t t e n d i n g t h e U n i ve r si t y o f S o u t h F l o r i d a i n S p r i n g 1 9 9 5 a n d co m p e t e d f o r t h e u n i ve r si t y i n i n t e r co l l e g i a t e a t h l e t i cs. H e g r a d u a t e d f r o m U S F C u m L a u d e a s t h e o u t st a n d i n g B S c. C h e m i s t r y i n h i s cl a ss. H e w a s a cce p t e d i n t o t h e I n s t i t u t e f o r B i o m o l e cu l a r S ci e n ce s I P 2 C M B ( I n t e r d i sci p l i n a r y P h D P r o g r a m i n C e l l u l a r a n d M o l e cu l a r B i o l o g y ) H e st a r t e d w o r ki n g i n t h e f i e l d o f e xt r a ce l l u l a r m a t r i x r e se a r ch w i t h D r N e a m e a n d l a t e r o n j o i n e d D r H a ss e l l s o n g o i n g co r n e a r e se a r ch p r o g r a m H e h a s p r e se n t e d h i s r e se a r ch a t t h e a n n u a l m e e t i n g o f t h e A sso ci a t i o n f o r R e se a r c h i n V i si o n a n d O p h t h a l m o l o g y h e l d i n F o r d L a u d e r d a l e F l o r i d a e ve r y y e a r si n c e j o i n i n g D r H a sse l l s l a b o r a t o r y ( 2 0 0 1 ) H e e xp e ct s t o g r a d u a t e i n D e c e m b e r 2 0 0 6 w i t h a P h D d e g r e e i n M e d i ca l S ci e n ce s.


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1 100
Musselmann, Kurt.
0 245
Developing culture conditions to study keratocyte phenotypes in vitro
h [electronic resource] /
by Kurt Musselmann.
260
[Tampa, Fla] :
b University of South Florida,
2006.
3 520
ABSTRACT: The corneal wound healing response involves the activation of keratocytes to proliferate from a quiescent phenotype. The mitogens that cause the initial transformation of the quiescent keratocytes to the active phenotype have not been identified. Even though serum is commonly used to replicate this in vitro, the cornea is avascular and therefore likely not exposed to serum. In the first part of this dissertation, a DMEM/F12 extract of corneal stromas was made and shown to stimulate keratocyte proliferation in both a dose-dependent and cell-density dependent manner. This extract contains mitogens that differ from the mitogens present in serum based on their effect on keratocytes and their biochemical characteristics. Culture in extract replicates in vitro the changes observed during the activation of keratocytes in the wound-healing phase.The corneal stroma contains an extensive extracellular matrix that consists primarily of collagens and proteolgycans.^ ^This matrix is maintained and secreted by the keratocytes, cells with unique characteristics lost during the activation observed at wound healing. The second part of this dissertation aims to develop a defined culture medium that maintains the keratocyte phenotype during proliferation. Keratocytes were cultured in serum-free medium and the effect of the growth factors on the markers for the keratocyte phenotype determined. Only insulin was shown to stimulate cell proliferation in a consistent manner, while maintaining commonly accepted keratocyte markers. When this defined culture medium was supplemented with ascorbic acid to study collagen synthesis, a marked increase in both collagen synthesis and keratan sulfate proteoglycan accumulation was measured.^ ^This newly developed culture medium, containing insulin and ascorbate, allows for cell growth, maintains the keratocyte markers, and could be used to study the native, non-activated keratocyte phenotype in culture.This dissertation shows that the culture media described herein replicate in vitro all the phenotypes observed during the corneal wound healing response in vivo. These culture media, in turn, could be used to obtain more knowledge about the different keratocyte phenotypes, and how they could be manipulated in culture. (329 words)
502
Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2006.
504
Includes bibliographical references.
516
Text (Electronic dissertation) in PDF format.
538
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Mode of access: World Wide Web.
500
Title from PDF of title page.
Document formatted into pages; contains 182 pages.
Includes vita.
590
Adviser: John R. Hassell, Ph.D.
653
Stroma.
Cornea.
Insulin.
Collagen/
Keratocan.
Chromatography.
690
Dissertations, Academic
z USF
x Molecular Medicine
Doctoral.
773
t USF Electronic Theses and Dissertations.
4 856
u http://digital.lib.usf.edu/?e14.1726