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Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in lung tissue using a fiber optic biosensor

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Material Information

Title:
Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in lung tissue using a fiber optic biosensor
Physical Description:
Book
Language:
English
Creator:
Denton, Kimberly A
Publisher:
University of South Florida
Place of Publication:
Tampa, Fla
Publication Date:

Subjects

Subjects / Keywords:
Autopsy
Biosensor
Immunoassay
Lung Tissue
Tuberculosis
Dissertations, Academic -- Biology -- Masters -- USF
Genre:
bibliography   ( marcgt )
theses   ( marcgt )
non-fiction   ( marcgt )

Notes

Abstract:
ABSTRACT: There is no rapid diagnostic technique at medical examiners' offices to determine if a decedent is infected with Mycobacterium tuberculosis. Present diagnostic testing requires at least one month for results. A biosensor-based sandwich immunoassay for the detection of M. tuberculosis was developed in this study. M. tuberculosis polyclonal antibody was used for target antigen capture and detection in the immunoassay. Live attenuated M. tuberculosis (ATCC 25177) suspended in phosphate-buffered saline with 0.1% Tween 20 was used as the antigen in the detection assay. The Analyte 2000 was the initial biosensor platform. Initial testing was of Freund's adjuvant complete. M. tuberculosis was detected 50% of the time at 1,000,000 CFU/ml and 100% of the time at 10,000,000 CFU/ml and 100,000,000 CFU/ml. Live attenuated M. tuberculosis was also tested using the Analyte 2000 biosensor. Detection was obtained 87.5% of the time at 1,000,000 CFU/ml and 100% of the time at 10,00 0,000 CFU/ml and 100,000,000 CFU/ml. The RAPTOR, an automated, portable instrument, was then tested as the fiber optic biosensor platform. Positive biosensor detection was obtained 75% of the time at cell concentrations of 1,000,000 CFU/ml, 95% of the time at 10,000,000 CFU/ml, and 99% of the time at 100,000,000 CFU/ml. Live attenuated M. tuberculosis suspended in PBST and seeded into decedent lung tissue was tested using the RAPTOR. Positive detection was obtained 21% of the time at cell concentrations of 1,000,000 CFU/ml, 86% of the time at 10,000,000 CFU/ml and 100% of the time at 100,000,000 CFU/ml. Antibody specificity studies using ELISA were performed to determine the anti-M. tuberculosis antibody's cross reactivity with microorganisms other than M. tuberculosis. M. tuberculosis actively growing in the lung of an individual is found at levels of 10,000,000 to 1,000,000,000 CFU in the lesions of the lung. This study determined that the RAPTOR biosensor assay was capable of ^detecting the presence of M. tuberculosis in lung tissue homogenate within three hours when the concentration of M. tuberculosis was 10,000,000 to 1,000,000,000 CFU/ml.
Thesis:
Thesis (M.S.)--University of South Florida, 2006.
Bibliography:
Includes bibliographical references.
System Details:
System requirements: World Wide Web browser and PDF reader.
System Details:
Mode of access: World Wide Web.
Statement of Responsibility:
by Kimberly A. Denton.
General Note:
Title from PDF of title page.
General Note:
Document formatted into pages; contains 86 pages.

Record Information

Source Institution:
University of South Florida Library
Holding Location:
University of South Florida
Rights Management:
All applicable rights reserved by the source institution and holding location.
Resource Identifier:
aleph - 001916025
oclc - 180877793
usfldc doi - E14-SFE0001788
usfldc handle - e14.1788
System ID:
SFS0026106:00001


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Full Text

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R a p i d D e t e c t i o n o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s i n L u n g T i s s u e U s i n g a F i b e r O p t i c B i o s e n s o r b y K i m b e r l y A D e n t o n A t h e s i s s u b m i t t e d i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f M a s t e r o f S c i e n c e D e p a r t m e n t o f B i o l o g y C o l l e g e o f A r t s a n d S c i e n c e s U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a M a j o r P r o f e s s o r : D a n i e l V L i m P h D A n d r e w C C a n n o n s P h D D i a n e T e S t r a k e P h D D a t e o f A p p r o v a l : D e c e m b e r 6 2 0 0 6 K e y w o r d s : A u t o p s y B i o s e n s o r I m m u n o a s s a y L u n g T i s s u e T u b e r c u l o s i s C o p y r i g h t 2 0 0 6 K i m b e r l y A D e n t o n

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D e d i c a t i o n T h e w r i t i n g o f t h i s t h e s i s i s d e d i c a t e d t o m y p a r e n t s C o r i n n e T D e n t o n a n d T o m m y B D e n t o n J r w h o s e u n s u r p a s s e d d e v o t i o n a n d s u p p o r t h a v e m a d e a l l o f t h i s p o s s i b l e ; D r D a n i e l V L i m f o r h i s g u i d a n c e b e l i e v i n g i n m e a n d a l l o w i n g m e t h e o p p o r t u n i t y t o p u r s u e m y d r e a m ; D r M a r i a n n e K r a m e r w h o s e p a t i e n c e e n c o u r a g e m e n t a n d n e v e r e n d i n g k n o w l e d g e h a v e g o t t e n m e t h r o u g h ; m y o t h e r c o m m i t t e e m e m b e r s D r C a n n o n s a n d D r T e S t r a k e f o r t h e i r g u i d a n c e a n d k i n d n e s s ; S o n i a M a g a a f o r h e r h e l p f u l n e s s t e a c h i n g s a n d l a u g h s ; m e m b e r s o f t h e A d v a n c e d B i o s e n s o r s L a b o r a t o r y w h o h a v e m a d e t h i s a v e r y f u n a d v e n t u r e ; D r J a c q u e l i n e L e e f o r h e r c o n t i n u o u s s o u r c e o f k n o w l e d g e o f p a t h o l o g y a n d k i n d n e s s ; S u s a n D e a n a t t h e S t a t e L a b o r a t o r y f o r t h e l a b o r a t o r y p r o t o c o l s a n d h e l p f u l n e s s ; a l l m y f r i e n d s a n d f a m i l y w h o h e l p e d t o k e e p m e f o c u s e d a n d m o t i v a t e d ; a n d t h e l u n g d o n o r a n d h e r f a m i l y f o r t h e i r g r a c i o u s n e s s T h a n k y o u a l l v e r y m u c h I a m f o r e v e r g r a t e f u l

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i T a b l e o f C o n t e n t s L i s t o f T a b l e s i i i L i s t o f F i g u r e s v i A b s t r a c t v i i i I n t r o d u c t i o n 1 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 2 1 C h e m i c a l s a n d B u f f e r s 2 1 B a c t e r i a l S t r a i n s 2 1 A n t i b o d i e s 2 2 A n t i b o d y L a b e l i n g 2 2 P r e p a r a t i o n o f F r e u n d ’ s A d j u v a n t C o m p l e t e 2 3 E L I S A 2 3 W e s t e r n B l o t s 2 4 W a v e g u i d e P r e p a r a t i o n 2 5 A n a l y t e 2 0 0 0 2 6 A n a l y t e 2 0 0 0 A s s a y 2 8 R A P T O R 2 9 R A P T O R A s s a y 3 1 L i v e A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s P r e p a r a t i o n f o r R A P T O R 3 2 L u n g P r e p a r a t i o n 3 2

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i i L i v e A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s P r e p a r a t i o n f o r U s e i n S e e d i n g i n t o L u n g T i s s u e f o r U s e i n t h e R A P T O R 3 3 R A P T O R A s s a y s w i t h M t u b e r c u l o s i s S e e d e d i n t o L u n g T i s s u e 3 4 S p e c i f i c i t y T e s t i n g U s i n g t h e R A P T O R 3 4 A n a l y t e 2 0 0 0 a n d R A P T O R C a l c u l a t i o n s 3 5 C l e a n i n g o f t h e A n a l y t e 2 0 0 0 a n d R A P T O R 3 5 R e s u l t s 3 6 F r e u n d ’ s A d j u v a n t C o m p l e t e T e s t i n g 3 6 A n a l y t e 2 0 0 0 T e s t i n g w i t h P e l l e t f r o m F r e u n d ’ s A d j u v a n t C o m p l e t e 3 8 A n a l y t e 2 0 0 0 T e s t i n g w i t h L i v e A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s 4 0 R A P T O R T e s t i n g w i t h L i v e A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s 4 1 R A P T O R T e s t i n g w i t h L i v e A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s S e e d e d i n t o D e c e d e n t L u n g T i s s u e 4 3 E L I S A T e s t i n g w i t h M t u b e r c u l o s i s A n t i b o d y 4 5 M t u b e r c u l o s i s A n t i b o d y S p e c i f i c i t y S t u d i e s U s i n g t h e R A P T O R 5 5 W e s t e r n B l o t A n t i b o d y S t u d y 7 0 D i s c u s s i o n 7 3 R e f e r e n c e s 8 0

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i i i L i s t o f T a b l e s T a b l e 1 : F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e r e a c t i v i t y w i t h M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y 3 7 T a b l e 2 : A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y w i t h F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e 3 8 T a b l e 3 : R e s u l t s o f t h r e e A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y s w i t h F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e 3 9 T a b l e 4 : A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y w i t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s 4 0 T a b l e 5 : R e s u l t s o f t w o A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y s w i t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s 4 1 T a b l e 6 : R A P T O R a s s a y w i t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s 4 2 T a b l e 7 : R e s u l t s o f n i n e t e e n R A P T O R a s s a y s w i t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s 4 3 T a b l e 8 : R A P T O R a s s a y w i t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s i n d e c e d e n t l u n g t i s s u e 4 4 T a b l e 9 : R e s u l t s o f s e v e n R A P T O R a s s a y s w i t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s i n d e c e d e n t l u n g t i s s u e 4 5 T a b l e 1 0 : M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y r e a c t i v i t y w i t h M t u b e r c u l o s i s 4 6 T a b l e 1 1 : A n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y r e a c t i v i t y a t v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f M t u b e r c u l o s i s 4 7 T a b l e 1 2 a : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s 5 6

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i v T a b l e 1 2 b : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e 5 7 T a b l e 1 2 c : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 5 8 T a b l e 1 2 d : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e 5 9 T a b l e 1 2 e : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e 6 0 T a b l e 1 2 f : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e 6 1 T a b l e 1 2 g : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a 6 2 T a b l e 1 2 h : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o C a n d i d a a l b i c a n s 6 3 T a b l e 1 2 i : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s 6 4 T a b l e 1 2 j : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o P r o t e u s m i r a b i l i s 6 5 T a b l e 1 2 k : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s 6 6 T a b l e 1 2 l : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e 6 7

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v T a b l e 1 2 m : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e 6 8 T a b l e 1 3 : S u m m a r y o f c r o s s r e a c t i v i t y s t u d i e s u s i n g R A P T O R 6 9

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v i L i s t o f F i g u r e s F i g u r e 1 : W a v e g u i d e 2 6 F i g u r e 2 : A n a l y t e 2 0 0 0 2 8 F i g u r e 3 : A s s a y f o r m a t u s i n g b i o s e n s o r w a v e g u i d e 2 9 F i g u r e 4 : R A P T O R 3 1 F i g u r e 5 : R A P T O R c o u p o n 3 2 F i g u r e 6 : E L I S A r e s u l t s o f a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y r e a c t i v i t y t o F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e 3 7 F i g u r e 7 : E L I S A r e s u l t s o f a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y r e a c t i v i t y t o M t u b e r c u l o s i s 4 6 F i g u r e 8 : E L I S A r e s u l t s o f a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y r e a c t i v i t y a t v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f M t u b e r c u l o s i s 4 8 F i g u r e 9 : E L I S A r e s u l t s o f t h e r e a c t i v i t y o f M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w i t h a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e a n d S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e 5 0 F i g u r e 1 0 : E L I S A r e s u l t s o f t h e r e a c t i v i t y o f M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w i t h a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e a n d S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s 5 1

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v i i F i g u r e 1 1 : E L I S A r e s u l t s o f t h e r e a c t i v i t y o f M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w i t h a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s P r o t e u s m i r a b i l i s a n d P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a 5 2 F i g u r e 1 2 : E L I S A r e s u l t s o f t h e r e a c t i v i t y o f M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w i t h a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s C a n d i d a a l b i c a n s a n d M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e 5 3 F i g u r e 1 3 : E L I S A r e s u l t s o f t h e r e a c t i v i t y o f M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w i t h a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s a n d M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e 5 4 F i g u r e 1 4 : W e s t e r n b l o t s h o w i n g a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i o n w i t h M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s p r o t e i n s 7 1

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v i i i R a p i d D e t e c t i o n o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s i n L u n g T i s s u e U s i n g a F i b e r O p t i c B i o s e n s o r K i m b e r l y A D e n t o n A B S T R A C T T h e r e i s n o r a p i d d i a g n o s t i c t e c h n i q u e a t m e d i c a l e x a m i n e r s ’ o f f i c e s t o d e t e r m i n e i f a d e c e d e n t i s i n f e c t e d w i t h M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s P r e s e n t d i a g n o s t i c t e s t i n g r e q u i r e s a t l e a s t o n e m o n t h f o r r e s u l t s A b i o s e n s o r b a s e d s a n d w i c h i m m u n o a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f M t u b e r c u l o s i s w a s d e v e l o p e d i n t h i s s t u d y M t u b e r c u l o s i s p o l y c l o n a l a n t i b o d y w a s u s e d f o r t a r g e t a n t i g e n c a p t u r e a n d d e t e c t i o n i n t h e i m m u n o a s s a y L i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s ( A T C C 2 5 1 7 7 ) s u s p e n d e d i n p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e w i t h 0 1 % T w e e n 2 0 w a s u s e d a s t h e a n t i g e n i n t h e d e t e c t i o n a s s a y T h e A n a l y t e 2 0 0 0 w a s t h e i n i t i a l b i o s e n s o r p l a t f o r m I n i t i a l t e s t i n g w a s o f F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e M t u b e r c u l o s i s w a s d e t e c t e d 5 0 % o f t h e t i m e a t 1 06 C F U / m l a n d 1 0 0 % o f t h e t i m e a t 1 07 C F U / m l a n d 1 08 C F U / m l L i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s w a s a l s o t e s t e d u s i n g t h e A n a l y t e 2 0 0 0 b i o s e n s o r D e t e c t i o n w a s o b t a i n e d 8 7 5 % o f t h e t i m e a t 1 06 C F U / m l a n d 1 0 0 % o f t h e t i m e a t 1 07 C F U / m l a n d 1 08 C F U / m l T h e R A P T O R a n a u t o m a t e d p o r t a b l e i n s t r u m e n t w a s t h e n t e s t e d a s t h e f i b e r o p t i c b i o s e n s o r p l a t f o r m P o s i t i v e b i o s e n s o r d e t e c t i o n w a s o b t a i n e d 7 5 % o f t h e t i m e a t c e l l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 06 C F U / m l 9 5 % o f t h e t i m e a t 1 07 C F U / m l a n d 9 9 % o f t h e t i m e a t 1 08 C F U / m l L i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s s u s p e n d e d i n P B S T a n d s e e d e d i n t o d e c e d e n t l u n g t i s s u e w a s t e s t e d u s i n g t h e R A P T O R

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i x P o s i t i v e d e t e c t i o n w a s o b t a i n e d 2 1 % o f t h e t i m e a t c e l l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 06 C F U / m l 8 6 % o f t h e t i m e a t 1 07 C F U / m l a n d 1 0 0 % o f t h e t i m e a t 1 08 C F U / m l A n t i b o d y s p e c i f i c i t y s t u d i e s u s i n g E L I S A w e r e p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y ’ s c r o s s r e a c t i v i t y w i t h m i c r o o r g a n i s m s o t h e r t h a n M t u b e r c u l o s i s M t u b e r c u l o s i s a c t i v e l y g r o w i n g i n t h e l u n g o f a n i n d i v i d u a l i s f o u n d a t l e v e l s o f 1 07 t o 1 09 C F U i n t h e l e s i o n s o f t h e l u n g T h i s s t u d y d e t e r m i n e d t h a t t h e R A P T O R b i o s e n s o r a s s a y w a s c a p a b l e o f d e t e c t i n g t h e p r e s e n c e o f M t u b e r c u l o s i s i n l u n g t i s s u e h o m o g e n a t e w i t h i n t h r e e h o u r s w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f M t u b e r c u l o s i s w a s 1 07 t o 1 09 C F U / m l

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1 I n t r o d u c t i o n T h e e t i o l o g i c a l a g e n t M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s i s r e s p o n s i b l e f o r c a u s i n g t u b e r c u l o s i s ( T B ) i n h u m a n s ( 4 3 ) D a t e d a s f a r b a c k a s 2 4 0 0 B C E M t u b e r c u l o s i s p a t h o l o g i c a l f i n d i n g s h a v e b e e n f o u n d i n s p i n a l c o l u m n f r a g m e n t s o f E g y p t i a n m u m m i e s ( 1 1 ) T h e f i r s t M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s s t a i n i n g t e c h n i q u e w a s d e v e l o p e d b y R o b e r t K o c h i n 1 8 8 2 ( 4 1 4 2 ) M t u b e r c u l o s i s k n o w n i n t h e 1 7t h a n d 1 8t h c e n t u r y i n E u r o p e a s t h e W h i t e P l a g u e c a u s e s m o r e d e a t h s i n h u m a n s t h a n a n y o t h e r b a c t e r i a l p a t h o g e n ( 2 4 ) I n e a r l y t i m e s d o c t o r s c o u l d o n l y t r e a t T B i n f e c t i o n s b y i m p r o v i n g p a t i e n t s ’ h e a l t h b y a d m i t t i n g t h e m i n t o s a n a t o r i a s ( T B h o s p i t a l s ) w h i c h f o r c e d p a t i e n t s t o r e s t h a v e a p r o p e r d i e t a n d b e i s o l a t e d f r o m t h e g e n e r a l p u b l i c ( 1 9 ) S t r e p t o m y c i n w a s t h e f i r s t a n t i b i o t i c p r e s c r i b e d f o r T B i n 1 9 4 4 ( 3 5 ) W o r l d w i d e t h e r e a r e m o r e t h a n t w o m i l l i o n t u b e r c u l o s i s d e a t h s e a c h y e a r ( 1 5 ) G l o b a l T B c a s e s c o n t i n u e t o r i s e A p p r o x i m a t e l y o n e p e r c e n t o f t h e w o r l d ’ s p o p u l a t i o n i s n e w l y i n f e c t e d w i t h M t u b e r c u l o s i s e a c h y e a r a n d e v e r y s e c o n d s o m e o n e i n t h e w o r l d i s n e w l y i n f e c t e d P r e s e n t l y o n e t h i r d o f t h e w o r l d ’ s t o t a l p o p u l a t i o n ( 2 b i l l i o n ) i s i n f e c t e d w i t h M t u b e r c u l o s i s a n d o f t h o s e i n f e c t e d f i v e t o t e n p e r c e n t w i l l b e c o m e s i c k o r i n f e c t i o u s l a t e r i n l i f e T B i s a w o r l d w i d e p a n d e m i c A f r i c a a c c o u n t s f o r 2 9 % o f a l l T B c a s e s a n d A s i a n c o u n t r i e s B a n g l a d e s h C h i n a I n d i a I n d o n e s i a P a k i s t a n a n d P h i l i p p i n e s a c c o u n t f o r 5 0 % o f a l l n e w T B c a s e s E a c h y e a r t e n t o f i f t e e n n e w l y i n f e c t e d p e o p l e r e s u l t f r o m o n e p e r s o n w i t h a c t i v e T B n o t b e i n g t r e a t e d

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2 ( 8 3 ) A d u l t m o r t a l i t y r e s u l t i n g f r o m t u b e r c u l o s i s i s t h e s e c o n d m o s t c o m m o n c a u s e o f i n f e c t i o u s d e a t h ( 2 5 ) T B c a s e s i n t h e U n i t e d S t a t e s h a v e b e e n o n t h e d e c l i n e s i n c e 1 9 9 3 T h e r e w e r e 1 6 3 0 9 T B c a s e s p e r 1 0 0 0 0 0 p o p u l a t i o n i n 2 0 0 0 a n d 1 4 0 9 7 p e r 1 0 0 0 0 0 p o p u l a t i o n i n 2 0 0 5 B y t h e y e a r 2 0 1 0 t h e C e n t e r s f o r D i s e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n ( C D C ) h o p e t o h a v e e l i m i n a t e d t u b e r c u l o s i s f r o m t h e U n i t e d S t a t e s ( 1 5 ) M t u b e r c u l o s i s g r o w s a s s e r p e n t i n e c o r d s a n d i s n e i t h e r g r a m n e g a t i v e n o r g r a m p o s i t i v e ; i t i s a n o n m o t i l e b a c i l l u s ( r o d s h a p e d ) a n d i s c h a r a c t e r i z e d a s a n a c i d f a s t b a c t e r i u m ( 5 7 ) T h e b a c t e r i a h a v e p e p t i d o g l y c a n i n t h e c e l l w a l l b u t o v e r 6 0 % o f t h e c e l l w a l l i s l i p i d a n d c o m p o s e d o f m y c o l i c a c i d s ( 1 6 ) M t u b e r c u l o s i s r e q u i r e s o x y g e n a n d i t s g r o w t h r a t e i s p r o p o r t i o n a l t o t h e c o n c e n t r a t i o n o f o x y g e n T h e r e f o r e t h e b a c i l l u s g r o w s w e l l i n t h e o x y g e n r i c h c a v i t i e s o f t h e l u n g s ( 4 4 ) T h e s e b a c i l l i a r e a l s o c a l l e d t u b e r c l e b a c i l l i a s a r e s u l t o f f o r m i n g t h e c h a r a c t e r i s t i c l e s i o n s o f M t u b e r c u l o s i s i n f e c t i o n I n a n a c t i v e l y p r o l i f e r a t i n g i n f e c t i o n t h e r e a r e p o p u l a t i o n s o f t u b e r c l e b a c i l l i v a r y i n g f r o m 1 07 t o 1 09 C F U ( 3 1 4 4 ) L o w e n s t e i n J e n s e n ( L J ) m e d i u m a n d M i d d l e b r o o k m e d i u m a r e t h e m e d i a u s e d t o g r o w M t u b e r c u l o s i s ( 3 6 5 5 ) r e s u l t i n g i n g e n e r a t i o n t i m e s o f 1 5 2 0 h o u r s C o l o n i e s a p p e a r b u f f c o l o r e d ( 7 8 ) a n d s m a l l a f t e r f o u r t o s i x w e e k s o f g r o w t h M t u b e r c u l o s i s c a n s u r v i v e f o r l o n g p e r i o d s o f t i m e o u t s i d e o f i t s h o s t O n c a r p e t t h e b a c t e r i a c a n s u r v i v e f o r 7 0 d a y s O n c l o t h i n g M t u b e r c u l o s i s c a n s u r v i v e f o r 4 5 d a y s a n d o n a p a p e r b o o k 1 0 5 d a y s S p u t u m t h a t i s s t o r e d i n a c o o l d a r k a r e a c a n s u p p o r t s u r v i v a l f o r s i x t o e i g h t m o n t h s M t u b e r c u l o s i s c a n s u r v i v e o n d u s t f o r 9 0 t o 1 2 0 d a y s I t c a n s u r v i v e o n m a n u r e f o r u p t o 4 5 d a y s a n d o n c o c k r o a c h e s f o r 4 0 d a y s ( 5 7 ) T h e h i g h l i p i d c o n t e n t o f

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3 M t u b e r c u l o s i s i n f l u e n c e s p e r m e a b i l i t y o f t h e c e l l w a l l t o s t a i n s a n d m a k e s t h e b a c t e r i u m r e s i s t a n t t o s o m e a n t i b i o t i c s a n d c a p a b l e o f s u r v i v a l i n s i d e m a c r o p h a g e s ( 1 6 ) T h e c o m p l e t e g e n o m e o f M t u b e r c u l o s i s H 3 7 R v w a s e s t a b l i s h e d i n 1 9 9 8 T h e g e n o m e c o n s i s t s o f 4 4 1 1 5 3 2 b a s e p a i r s w i t h a 6 5 % G + C c o n t e n t w h i c h i s a s s o c i a t e d w i t h i t s h i g h l y a e r o b i c e n v i r o n m e n t r e q u i r e m e n t a c h a r a c t e r i s t i c o f a e r o b i c m i c r o b e s O f t h e 4 0 4 3 g e n e s 2 6 % a r e c o n s e r v e d h y p o t h e t i c a l p r o t e i n s ; 5 % a r e r e g u l a t o r y p r o t e i n s ; 7 % a r e p r o t e i n s o f u n k n o w n f u n c t i o n ; 4 % a r e i n s e r t i o n s e q u e n c e s ; 1 7 % a r e i n v o l v e d i n c e l l w a l l a n d c e l l p r o c e s s e s ; 4 % a r e P E p r o t e i n s ( a p r o t e i n f a m i l y i n M t u b e r c u l o s i s w i t h u n k n o w n f u n c t i o n n a m e d P f o r c o n s e r v e d p r o l i n e a n d E f o r g l u t a m a t e r e s i d u e s ) ; 1 % a r e i n v o l v e d i n s t a b l e R N A s ; 6 % a r e i n v o l v e d i n i n f o r m a t i o n p a t h w a y s ; 6 % a r e i n v o l v e d i n l i p i d m e t a b o l i s m ; 2 2 % a r e i n v o l v e d i n i n t e r m e d i a r y m e t a b o l i s m a n d r e s p i r a t i o n a n d 2 % a r e i n v o l v e d i n v i r u l e n c e d e t o x i f i c a t i o n a n d a d a p t a t i o n ( 1 6 7 3 ) S o m e i n d i v i d u a l s a r e m o r e a t r i s k f o r d e v e l o p i n g T B i n f e c t i o n t h a n o t h e r s T h o s e i n d i v i d u a l s w i t h p o o r n u t r i t i o n d r u g a b u s e a l c o h o l a b u s e y o u n g c h i l d r e n t h o s e i n c l o s e c o n t a c t w i t h l a r g e g r o u p s o f p e o p l e t h o s e l i v i n g i n d o r m i t o r i e s t h o s e a t t e n d i n g s c h o o l s h o s p i c e a n d h o s p i c e e m p l o y e e s n u r s i n g h o m e r e s i d e n t s a n d w o r k e r s t h o s e i n l o n g t e r m p s y c h i a t r i c f a c i l i t i e s a n d w o r k e r s p a t i e n t s a n d s t a f f o f c h r o n i c c a r e u n i t s o f h o s p i t a l s f o r v e t e r a n s h e a l t h c a r e w o r k e r s p a t h o l o g i s t s a u t o p s y t e c h n i c i a n s f o r e n s i c c l e r i c a l s t a f f f a m i l y m e m b e r s a n d f r i e n d s o f t h o s e i n f e c t e d f u n e r a l h o m e w o r k e r s t h o s e w h o r i d e i n a i r p l a n e s ( 2 3 8 ) t h e h o m e l e s s t h o s e p r e s e n t l y o r p r e v i o u s l y i m p r i s o n e d a n d t h o s e d i a g n o s e d a s H I V p o s i t i v e a r e a t t h e g r e a t e r r i s k ( 5 1 6 2 7 7 8 ) P e o p l e w i t h c h r o n i c r e n a l f a i l u r e d i a b e t e s m e l l i t u s a n d n e o p l a s t i c d i s e a s e s a r e a t i n c r e a s e d r i s k o f d e v e l o p i n g t u b e r c u l o s i s ( 1 6 ) H o s t f a c t o r s t h a t a r e c r i t i c a l i n i n f l u e n c i n g w h e t h e r o r n o t M

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4 t u b e r c u l o s i s d e v e l o p s i n t o s y m p t o m a t i c t u b e r c u l o s i s a r e g e n e t i c f a c t o r s c o e x i s t i n g d i s e a s e s i m m u n e s t a t u s a g e s p e c i f i c i m m u n o d e f i c i e n c y s t a t e s a n d i m m u n i z a t i o n w i t h B a c i l l e o f C a l m e t t e a n d G u r i n ( B C G ) v a c c i n e a l i v e v a c c i n e m a d e f r o m a n a t t e n u a t e d s t r a i n o f M b o v i s ( 1 0 1 6 ) A l s o c r i t i c a l a r e t h e m i c r o b i a l f a c t o r s o f v i r u l e n c e o f t h e o r g a n i s m a n d t h e s p e c i f i c t i s s u e i t i n f e c t s O f t h e i n d i v i d u a l s i n f e c t e d w i t h M t u b e r c u l o s i s o n l y t h r e e t o f o u r p e r c e n t w i l l d e v e l o p a c t i v e d i s e a s e I n h e a l t h y p e o p l e i n f e c t i o n w i t h M t u b e r c u l o s i s i s u s u a l l y a s y m p t o m a t i c T h e r e i s a t e n p e r c e n t l i k e l y r i s k o f d e v e l o p i n g c l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n s o f M t u b e r c u l o s i s w i t h a n i n e t y p e r c e n t p r o b a b i l i t y o f t h e i n f e c t i o n r e m a i n i n g l a t e n t ( 1 6 1 8 ) P r i o r t o t h e d i s c o v e r y o f H I V e i g h t y f i v e p e r c e n t o f c a s e s r e p o r t e d i n v o l v e d p u l m o n a r y t u b e r c u l o s i s a n d f i f t e e n p e r c e n t e i t h e r i n v o l v e d n o n p u l m o n a r y a r e a s o r a c o m b i n a t i o n o f p u l m o n a r y o r n o n p u l m o n a r y s i t e s A f t e r H I V d i s c o v e r y t h e r e w a s t h i r t y e i g h t p e r c e n t p u l m o n a r y i n v o l v e m e n t t h i r t y p e r c e n t e x t r a p u l m o n a r y s i t e i n v o l v e m e n t a n d t h i r t y t w o p e r c e n t l i k e l i h o o d o f b o t h n o n p u l m o n a r y a n d p u l m o n a r y i n v o l v e m e n t ( 1 6 2 6 3 3 7 0 ) T h e b a c t e r i u m i s c h a r a c t e r i z e d a s a f a c u l t a t i v e i n t r a c e l l u l a r p a r a s i t e t a k e n u p b y p h a g o c y t o s i s a n d i s n o t a b l e t o a c t i v e l y i n v a d e h o s t c e l l s ( 4 7 ) P o r t a l e n t r y i s t h e l u n g F o u r t o t w e l v e w e e k s a r e t h e i n c u b a t i o n p e r i o d f r o m i n f e c t i o n t o p r i m a r y l e s i o n o r t u b e r c u l i n r e a c t i o n I n f e c t i o n s m a y p e r s i s t f o r a l i f e t i m e a s l a t e n t i n f e c t i o n s E x t r a p u l m o n a r y i n f e c t i o n s f r o m M t u b e r c u l o s i s u s u a l l y o c c u r o n e o r t w o y e a r s a f t e r e x p o s u r e ( 5 7 ) T h e r e a r e f i v e s t a g e s o f d i s e a s e c a u s e d b y M t u b e r c u l o s i s S t a g e o n e i s c h a r a c t e r i z e d b y i n h a l a t i o n o f d r o p l e t n u c l e i D r o p l e t n u c l e i a r e g e n e r a t e d b y t a l k i n g

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5 c o u g h i n g s n e e z i n g s i n g i n g a n d o t h e r f o r m s w h i c h m a k e a i r b o r n e p a r t i c l e s o f d r o p l e t n u c l e i M a c r o p h a g e s u p t a k e t h e s e b a c t e r i a b u t a r e u n a b l e t o d e s t r o y t h e m ( 7 8 ) M a c r o p h a g e e n t r y b y M t u b e r c u l o s i s o c c u r s b y l i g a t i o n w i t h r e c e p t o r s e n a b l i n g p h a g o c y t o s i s ( 1 6 ) S t a g e t w o i s c h a r a c t e r i z e d a t s e v e n t o t w e n t y o n e d a y s M a c r o p h a g e s b u r s t a s M t u b e r c u l o s i s m u l t i p l i e s S t a g e t h r e e i s c h a r a c t e r i z e d b y T c e l l a n d m a c r o p h a g e a c t i v a t i o n I n d i v i d u a l s b e c o m e t u b e r c u l i n p o s i t i v e T u b e r c l e f o r m a t i o n b e g i n s w i t h c a s e a t i o n n e c r o s i s S t a g e f o u r i s c h a r a c t e r i z e d b y t u b e r c l e s b e i n g s u r r o u n d e d b y m a c r o p h a g e s T u b e r c l e g r o w t h c o n t i n u e s p o s s i b l y i n v a d i n g o t h e r a r e a s o f t h e l u n g a n d / o r a r t e r i e s S t a g e f i v e i s c h a r a c t e r i z e d b y l i q u e f a c t i o n o f t u b e r c l e s B r o n c h i r u p t u r e a n d b e c o m e n e c r o t i c l e a v i n g c a v i t i e s t h a t a l l o w b a c t e r i a t o i n v a d e o t h e r p a r t s o f t h e l u n g T h e G h o n c o m p l e x i s c h a r a c t e r i z e d b y l e s i o n s i n t h e l u n g s b e c o m i n g f i b r o u s c a l c i f y i n g a n d h e a l i n g a n d c a n b e o b s e r v e d u p o n c h e s t x r a y D e p e n d i n g u p o n t h e h o s t s t r e n g t h t h e i n f e c t i o n m a y b e c o n t r o l l e d ( 7 8 ) M t u b e r c u l o s i s a f f e c t s a l l p a r t s o f t h e w o r l d l e a d i n g t o d i s a b i l i t y a n d d e a t h T h e i n f e c t i o u s d o s e i s 1 0 b a c i l l i b y i n h a l a t i o n T h e m o d e o f t r a n s m i s s i o n i s a i r b o r n e b a c i l l i f r o m a n i n f e c t e d p e r s o n ’ s s p u t u m b r e a k s i n t h e s k i n a n d m u c o u s m e m b r a n e i n v a s i o n T h o s e w h o p e r f o r m o r a s s i s t a t a u t o p s i e s i n t u b a t i o n s a n d b r o n c h o s c o p i e s a r e a t e x t r e m e r i s k o f e x p o s u r e H u m a n s s e r v e a s r e s e r v o i r s f o r M t u b e r c u l o s i s ( 5 7 ) B o t h s e x e s a r e i n f e c t e d e q u a l l y w i t h M t u b e r c u l o s i s e x c e p t f o r t h o s e H I V p o s i t i v e i n w h i c h m a l e s p r e d o m i n a t e T h e n u m b e r o f t h o s e w i t h H I V a s s o c i a t e d T B c o n t i n u e s t o r i s e a n d c a u s e i n c i d e n c e r a t e s t o g o u p w a r d g l o b a l l y ( 1 6 ) S y m p t o m s o f T B i n c l u d e : f e v e r f a t i g u e c o u g h c h e s t p a i n e x t r a p u l m o n a r y i n v o l v e m e n t w e i g h t l o s s a n d n i g h t s w e a t s w h i c h c a n l e a d t o d i s a b i l i t y a n d d e a t h ( 5 7 )

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6 D e p r e s s i o n h a s a l s o b e e n a s s o c i a t e d w i t h i n f e c t i o n ( 1 6 ) T h e l u n g s a r e t h e m a i n s i t e o f d a m a g e c a u s e d b y M t u b e r c u l o s i s H o w e v e r o t h e r a r e a s o f t h e b o d y m a y b e i n f e c t e d : b o n e s w h i c h m a y l e a d t o p a r a l y s i s ; k i d n e y s d e s t r o y i n g t i s s u e w h i c h t h e n m a y s p r e a d t o t h e b l a d d e r ; f e m a l e r e p r o d u c t i v e o r g a n s w h i c h c a n t h e n s p r e a d t o t h e a b d o m i n a l c a v i t y c a u s i n g s y m p t o m s o f a p p e n d i c i t i s ; a n d j o i n t s c a u s i n g a f o r m o f a r t h r i t i s a f f e c t i n g h i p s k n e e s e l b o w s h a n d s a n d w r i s t s T h e s k i n v e s s e l s a d r e n a l g l a n d s a n d i n t e s t i n e s c a n b e i n f e c t e d b y M t u b e r c u l o s i s ( 6 ) T r e a t m e n t i n v o l v e s s i n g l e o r c o m b i n a t i o n o f a n t i b i o t i c t h e r a p y i n v o l v i n g i s o n i a z i d r i f a m p i n p y r a z i n a m i d e e t h a m b u t o l a n d s t r e p t o m y c i n T h e l e n g t h o f t r e a t m e n t c a n v a r y f r o m s i x m o n t h s a n d i n s o m e c a s e s u p t o t w e l v e m o n t h s ( 5 ) E x p o s u r e t o M t u b e r c u l o s i s i s d e t e r m i n e d b y a s k i n t e s t w i t h p u r i f i e d p r o t e i n d e r i v a t i v e ( P P D ) f o l l o w e d b y a c h e s t x r a y ( 4 7 ) S k i n t e s t i n g i n v o l v e s a t e s t c a l l e d t h e t u b e r c u l i n o r M a n t o u x t e s t ( 5 6 ) M t u b e r c u l o s i s i s b o i l e d t o g e n e r a t e P P D I n j e c t i o n o f f i v e t u b e r c u l i n u n i t s ( 0 0 0 0 0 1 m g ) P P D i n a 0 1 m l v o l u m e i n t o t h e f o r e a r m i s d o n e i n t h e M a n t o u x t e s t W i t h i n 4 8 7 2 h r s t h e f o r e a r m a r e a i s p o s i t i v e i f t h e i n j e c t i o n s i t e h a s a n o b s e r v e d l e s i o n 1 0 m m o r l a r g e r r e d n e s s c a l l e d e r y t h e m a s w e l l i n g a n d i n d u r a t i o n ( r a i s e d a n d h a r d ) ( 5 1 ) A d i s a d v a n t a g e o f t h e M a n t o u x t e s t i s t h e p o s s i b i l i t y o f f a l s e p o s i t i v e s F a l s e p o s i t i v e s a r e u s u a l l y l e s s i n t e n s e r e a c t i o n s a n d m a y b e t h e r e s u l t o f v a c c i n a t i o n w i t h B C G i n f e c t i o n w i t h o t h e r m y c o b a c t e r i a o r p r i o r e x p o s u r e t o M t u b e r c u l o s i s F a l s e n e g a t i v e s s o m e t i m e s r e s u l t i n A I D S p a t i e n t s w i t h i m p a i r e d c e l l m e d i a t e d i m m u n e ( C M I ) r e s p o n s e i n d i v i d u a l s w i t h m a l n u t r i t i o n a n d t h o s e t a k i n g s t e r o i d s ( 7 8 ) A p o s i t i v e P P D t e s t d o e s n o t c o n f i r m i n f e c t i o n w i t h M t u b e r c u l o s i s N o r d o e s a n e g a t i v e t e s t c o n f i r m t h e a b s e n c e o f i n f e c t i o n T h e p u r i f i e d p r o t e i n d e r i v a t i v e

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7 c o n t a i n s g r e a t e r t h a n t w o h u n d r e d t y p e s o f m y c o b a c t e r i a l a n t i g e n s w h i c h c a u s e s p o o r s p e c i f i c i t y a n d t h e a b i l i t y t o d i f f e r e n t i a t e f r o m v a c c i n a t i o n p r i o r M t u b e r c u l o s i s i n f e c t i o n a n d i n f e c t i o n w i t h n o n p a t h o g e n i c e n v i r o n m e n t a l m y c o b a c t e r i a c a u s i n g c r o s s s e n s i t i z a t i o n I f a p o s i t i v e P P D t e s t i s a c q u i r e d a c h e s t x r a y i s p e r f o r m e d ( 1 6 ) C h e s t x r a y s ( A b r e u g r a p h y ) n a m e d a f t e r p u l m o n o l o g i s t M a n o e l D i a s d e A b r e u w e r e d e v e l o p e d i n 1 9 2 1 t o s c r e e n f o r t u b e r c u l o s i s ( 1 ) W h e n a n a b n o r m a l c h e s t x r a y i s o b t a i n e d s p u t u m a n d b r o n c h o s c o p y e x a m i n a t i o n s a r e i n v e s t i g a t e d T h o s e i n d i v i d u a l s t h a t a r e t u b e r c u l i n p o s i t i v e s h o u l d b e i n f o r m e d a n d a d v i s e d o f t h e d i s e a s e s y m p t o m s a n d s e e k t r e a t m e n t ( 1 6 ) T h e l i v e v a c c i n e B a c i l l e o f C a l m e t t e a n d G u r i n ( B C G ) i s a t t e n u a t e d M b o v i s ( 5 7 ) A d i s a d v a n t a g e o f u s i n g B C G v a c c i n e i s t h a t d i s e a s e i s p r e v e n t e d b u t i n f e c t i o n i s n o t C o n s e q u e n t l y a l l i n d i v i d u a l s w o r l d w i d e w o u l d n e e d t o b e v a c c i n a t e d T h e v a c c i n e i s a l s o n o t 1 0 0 % e f f e c t i v e I f v a c c i n a t i o n w e r e p e r f o r m e d i n t h e U S t u b e r c u l i n s k i n t e s t r e s u l t s w o u l d b e u s e l e s s A n e f f e c t i v e a n t i b o d y d e t e c t i o n b a s e d t e s t t h a t i s s e n s i t i v e a n d s p e c i f i c f o r M t u b e r c u l o s i s i s n o t a v a i l a b l e a l t h o u g h d e v e l o p m e n t o f s e r o d i a g n o s t i c t e s t s h a v e b e e n s t u d i e d f o r d e c a d e s S o m e o f t h e a n t i g e n s u s e d t o d e v e l o p s e r o d i a g n o s t i c t e s t s a r e t h e 1 4 / 1 6 k D a a l p h a c r y s t a l l i n e h o m o l o g u e p r o t e i n 1 0 k D a h e a t s h o c k p r o t e i n 1 9 k D a l i p o p r o t e i n 3 8 k D a p r o t e i n a n d a n t i g e n s 8 5 A a n d B ( 1 6 ) C l i n i c a l s p e c i m e n s t e s t e d f o r p r e s e n c e o f M t u b e r c u l o s i s i n c l u d e c e r e b r o s p i n a l f l u i d ( C S F ) b l o o d u r i n e l e s i o n s f r o m t i s s u e s s p u t u m b o n e m a r r o w a n d g a s t r i c l a v a g e f l u i d s a n d b i o p s y s p e c i m e n s o f l y m p h n o d e s l u n g s l i v e r k i d n e y s a d r e n a l s a n d s p l e e n ( 5 9 1 6 1 7 ) V a r i o u s n o n s e l e c t i v e m e d i a a r e u s e d t o r e c o v e r m y c o b a c t e r i a f r o m c l i n i c a l s p e c i m e n s i n c l u d i n g L o w e n s t e i n J e n s e n P e t r a g n a n i A m e r i c a n T h o r a c i c S o c i e t y ( A T S )

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8 m e d i u m M i d d l e b r o o k 7 H 1 0 a n d M i d d l e b r o o k 7 H 1 1 L o w e n s t e i n J e n s e n m e d i a i s t h e m o s t c o m m o n m e d i a u s e d f o r r e c o v e r y o f m y c o b a c t e r i a T h e m e d i u m i s c o m p o s e d o f d e f i n e d s a l t s g l y c e r o l p o t a t o f l o u r c o a g u l a t e d w h o l e e g g s a n d m a l a c h i t e g r e e n a s a n i n h i b i t o r y a g e n t P e t r a g n a n i m e d i u m i s u s e d t o r e c o v e r M y c o b a c t e r i a f r o m s a m p l e s h e a v i l y c o n t a m i n a t e d w i t h b a c t e r i a A T S m e d i u m h a s l o w e r l e v e l s o f m a l a c h i t e g r e e n m a k i n g i t l e s s i n h i b i t o r y o f m y c o b a c t e r i a A T S m e d i u m i s o f t e n u s e d t o r e c o v e r M y c o b a c t e r i a f r o m s t e r i l e s p e c i m e n s o f C S F t i s s u e a n d p l e u r a l f l u i d M i d d l e b r o o k 7 H 1 0 a n d M i d d l e b r o o k 7 H 1 1 a g a r m e d i a a r e u s e d f o r s u s c e p t i b i l i t y a n d i s o l a t i o n t e s t i n g M i d d l e b r o o k 7 H 1 1 v a r i e s o n l y f r o m M i d d l e b r o o k 7 H 1 0 b y c o n t a i n i n g c a s e i n h y d r o l y s a t e w h i c h i m p r o v e s g r o w i n g r a t e o f M y c o b a c t e r i a r e s i s t a n t t o i s o n i a z i d E x a m p l e s o f s e l e c t i v e M y c o b a c t e r i a l i s o l a t i o n m e d i a ( m e d i a c o n t a i n i n g a n t i m i c r o b i a l a g e n t s u s e d t o s u p p r e s s f u n g a l a n d b a c t e r i a l c o n t a m i n a t i o n ) a r e G r u f t m o d i f i c a t i o n o f L o w e n s t e i n J e n s e n L o w e n s t e i n J e n s e n M i d d l e b r o o k 7 H 1 0 a n d s e l e c t i v e 7 H 1 1 T h e G r u f t m o d i f i c a t i o n o f L o w e n s t e i n J e n s e n m e d i u m c o n t a i n s t h e i n h i b i t o r y a g e n t s o f m a l a c h i t e g r e e n n a l i d i x i c a c i d p e n i c i l l i n a n d t h e c o m p o n e n t s o f p o t a t o f l o u r R N A c o a g u l a t e d w h o l e e g g s a n d d e f i n e d s a l t s L o w e n s t e i n J e n s e n s e l e c t i v e i s o l a t i o n m e d i u m h a s t h e s a m e c o m p o n e n t s a s t h e n o n s e l e c t i v e m e d i a B o t h m e d i a c o n t a i n t h e i n h i b i t o r y a g e n t m a l a c h i t e g r e e n H o w e v e r t h e s e l e c t i v e L o w e n s t e i n J e n s e n m e d i u m a l s o c o n t a i n s t h e i n h i b i t o r y a g e n t s c y c l o h e x i m i d e l i n c o m y c i n a n d n a l i d i x i c a c i d M i d d l e b r o o k 7 H 1 0 a s a s e l e c t i v e m e d i u m c o n t a i n s a l l t h e n o n s e l e c t i v e c o m p o n e n t s o f M i d d l e b r o o k 7 H 1 0 m e d i u m w i t h t h e a d d i t i o n o f g l u c o s e i n s t e a d o f d e x t r o s e a n d t h e a d d i t i o n o f t h e i n h i b i t o r y a g e n t s o f c y c l o h e x i m i d e l i n c o m y c i n a n d n a l i d i x i c a c i d S e l e c t i v e M i d d l e b r o o k 7 H 1 0 c o n t a i n s t h e s a m e c o m p o n e n t s a s t h e n o n s e l e c t i v e m e d i a

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9 M i d d l e b r o o k 7 H 1 1 w i t h t h e a d d i t i o n o f g l u c o s e a n d t h e i n h i b i t o r y a g e n t s o f c a r b e n i c i l l i n a m p h o t e r i c i n p o l y m y x i n B a n d t r i m e t h o p r i m l a c t a t e M i d d l e b r o o k 7 H 1 1 a s a s e l e c t i v e m e d i u m h o w e v e r l a c k s t h e i n h i b i t o r y a g e n t m a l a c h i t e g r e e n w h i c h i s p r e s e n t i n t h e n o n s e l e c t i v e m e d i u m M i d d l e b r o o k 7 H 1 0 o r 7 H 1 1 c l e a r a g a r c u l t u r e m e d i u m a l l o w s g r o w t h o f m i c r o c o l o n i e s ( m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n ) t h a t c a n b e o b s e r v e d i n f i v e t o s e v e n d a y s P r e s u m p t i v e i d e n t i f i c a t i o n i s p o s s i b l e b a s e d o n m o r p h o l o g i c a l m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f m i c r o c o l o n i e s a i d i n g i n d i a g n o s i s T h e S e p t i C h e k A F B S y s t e m ( B B L ) a n d t h e M y c o b a c t e r i a G r o w t h I n d i c a t o r T u b e ( M G I T ) s y s t e m h a v e a l s o b e e n u t i l i z e d t o r e c o v e r m y c o b a c t e r i a f r o m c l i n i c a l s p e c i m e n s T h e B B L s y s t e m u t i l i z e s a m o d i f i e d M i d d l e b r o o k 7 H 9 b r o t h i n 2 0 % C O2, n o n s e l e c t i v e M i d d l e b r o o k 7 H 1 1 a g a r m o d i f i e d L J m e d i u m a n d c h o c o l a t e a g a r A c i d f a s t s t a i n i n g a n d D N A p r o b e a n a l y s i s c a n b e p e r f o r m e d i f g r o w t h i s o b s e r v e d T h e M G I T s y s t e m i n c o r p o r a t e s a n o x y g e n s e n s i t i v e f l u o r e s c e n t s e n s o r i n d i c a t i n g m i c r o b e g r o w t h i n M i d d l e b r o o k 7 H 9 b r o t h M i d d l e b r o o k 7 H 9 b r o t h i s a m e d i u m u s e d f o r c u l t i v a t i o n a n d i s o l a t i o n o f M y c o b a c t e r i u m T u r b i d i t y o r d e t e c t i o n o f c o l o n i e s c a n b e v i s u a l i z e d e a r l i e r b u t g r o w t h o f b a c t e r i a m u s t s t i l l o c c u r ( 4 4 ) L a b o r a t o r y t e s t s t o d e t e c t M t u b e r c u l o s i s i n c l u d e s t a i n i n g c o n v e n t i o n a l b i o c h e m i c a l t e s t s i n o c u l a t i o n o f c l i n i c a l s p e c i m e n s i n t o a g a r b a s e d c u l t u r e m e d i a u s e o f b r o t h c u l t u r e m e d i a a p p l i c a t i o n o f p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) t e c h n o l o g y n o n i s o t o p i c n u c l e i c a c i d p r o b e s u s e o f a u t o m a t e d a n d s e m i a u t o m a t e d i n s t r u m e n t s r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e a s s a y s a n d u s e o f l y s i s c e n t r i f u g a t i o n s y s t e m b l o o d c u l t u r e t u b e L a b o r a t o r y t e s t i n g a l s o i n c l u d e s g a s l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a n d m a s s s p e c t r o m e t r y ( 4 4 )

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1 0 F o u r t o e i g h t w e e k s a r e r e q u i r e d f o r t r a d i t i o n a l c u l t u r i n g t e c h n i q u e s w h i c h m u s t t h e n b e f o l l o w e d b y b i o c h e m i c a l t e s t s i n o r d e r t o i d e n t i f y M t u b e r c u l o s i s ( 5 ) A c i d f a s t s t a i n i n g i s t h e o n l y r a p i d w i d e l y a v a i l a b l e l a b o r a t o r y t e s t t h a t c a n b e p e r f o r m e d t o p r e s u m p t i v e l y d i a g n o s i s a s a m p l e a s M y c o b a c t e r i u m p o s i t i v e H o w e v e r f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s c a n b e o b t a i n e d f r o m a c i d f a s t s t a i n s o f B a c i l l u s a n d C l o s t r i d i u m e n d o s p o r e s N o c a r d i a s o m e a s c o s p o r e s o f y e a s t s a n d o t h e r M y c o b a c t e r i u m s p e c i e s w h i c h a l s o a r e a c i d f a s t I n t h e a c i d f a s t s t a i n t h e s p e c i m e n i s h e a t f i x e d t o a s l i d e a n d s t e a m e d w i t h c a r b o l f u c h s i n a p r i m a r y s t a i n T h e s p e c i m e n p r e p a r e d s l i d e i s t h e n r i n s e d d e c o l o r i z e d w i t h a c i d a l c o h o l r i n s e d a n d c o u n t e r s t a i n e d w i t h m e t h y l e n e b l u e A c i d f a s t p o s i t i v e m i c r o o r g a n i s m s a r e p i n k a n d n o n a c i d f a s t m i c r o o r g a n i s m s a r e b l u e T h e c e l l e n v e l o p e c o n t a i n s h i g h l i p i d c o n t e n t p r e v e n t i n g d e c o l o r i z a t i o n f r o m a c i d a l c o h o l ( 5 3 ) A c i d f a s t s t a i n i n g i s u s e d o n l y a s a p r e s u m p t i v e t e s t f o r M t u b e r c u l o s i s w h i c h c a n b e p e r f o r m e d i n a m a t t e r o f m i n u t e s b u t m u s t b e f o l l o w e d w i t h a s e r i e s o f b i o c h e m i c a l t e s t s w h i c h c a n t a k e o n e t o t w o m o n t h s b e c a u s e o f t h e s l o w g r o w t h o f t h i s m i c r o o r g a n i s m ( 5 ) C o n v e n t i o n a l i d e n t i f i c a t i o n t e s t s t h a t h e l p d i s t i n g u i s h m y c o b a c t e r i a s p e c i e s a r e p i g m e n t p r o d u c t i o n t e s t i n t h e p r e s e n c e ( p h o t o c h r o m o g e n ) o r a b s e n c e ( s c o t o c h r o m o g e n ) o f l i g h t ( 4 4 ) A d d i t i o n a l c o n v e n t i o n a l i d e n t i f i c a t i o n t e s t s a r e T w e e n 8 0 h y d r o l y s i s a r y l s u l f a t a s e a c t i v i t y u r e a s e a c t i v i t y i r o n u p t a k e g r o w t h i n 5 % s o d i u m c h l o r i d e g r o w t h o n M a c C o n k e y a g a r n i a c i n a c c u m u l a t i o n n i t r a t e r e d u c t i o n p y r a z i n a m i d a s e p r o d u c t i o n t h i o p h e n e 2 c a r b o x y l i c a c i d h y d r a z i d e ( T C H ) s u s c e p t i b i l i t y p r o d u c t i o n o f h e a t s t a b l e c a t a l a s e a n d d r u g s u s c e p t i b i l i t i e s ( 1 6 4 4 ) A u t o m a t e d a n d s e m i a u t o m a t e d i n s t r u m e n t s a r e a l s o u s e d t o i d e n t i f y M y c o b a c t e r i u m W i t h t h e s e i n s t r u m e n t s d r u g r e s i s t a n c e c a n b e d e t e r m i n e d i n t h r e e t o

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1 1 f i v e d a y s a f t e r i n o c u l a t i o n w i t h t h e M y c o b a c t e r i u m s t r a i n o f i n t e r e s t ( 4 4 ) T h e B A C T E C A F B S y s t e m d e t e c t s g r o w t h u s i n g a n a u t o m a t e d B A C T E C 4 6 0 i n s t r u m e n t T h e B A C T E C A F B S y s t e m i n v o l v e s p a s s i n g c u l t u r e b o t t l e s t h r o u g h t h e m a c h i n e A s p i r a t i o n o f t h e b o t t l e s o c c u r s a n d t h e a s p i r a t e d g a s i s d e l i v e r e d t o a c o u n t i n g c h a m b e r F r e s h 1 0 % C O2 i s a d d e d t o r e p l a c e t h e a s p i r a t e d g a s T h e s a m p l e s a r e i n c u b a t e d a n d i f M y c o b a c t e r i a a r e p r e s e n t i n t h e s a m p l e C O2 i s r e l e a s e d i n p r o p o r t i o n t o t h e a m o u n t o f g r o w t h C a r b o n 1 4 l a b e l e d p a l m i t i c a c i d i s u s e d a s t h e g r o w t h d e t e c t o r T h e s y s t e m d e t e c t s t h e r a d i o a c t i v e C O2, a n d a g r o w t h i n d e x ( G I ) i s c a l c u l a t e d A t e n o r h i g h e r G I i s p o s i t i v e f o r t h e d e t e c t i o n o f M y c o b a c t e r i u m T h e m a c h i n e d o e s n o t i d e n t i f y t h e M y c o b a c t e r i u m s p e c i e s D i s a d v a n t a g e s o f t h i s s y s t e m a r e i t s h i g h c o s t o v e r g r o w t h b y c o n t a m i n a n t s a n d t h e n e e d t o d i s p o s e o f r a d i o a c t i v e m a t e r i a l s ( 6 6 ) G r o w t h o f m y c o b a c t e r i a i s d e t e c t e d i n 1 4 d a y s i n s t e a d o f t h e 2 1 d a y s b y s t a n d a r d c u l t u r e m e t h o d ( 6 6 ) T h e E S P M y c o S y s t e m m o n i t o r s a n i n c r e a s e i n g a s p r e s s u r e r e s u l t i n g f r o m g a s e s p r o d u c e d b y m e t a b o l i z i n g m y c o b a c t e r i a G a s p r e s s u r e i n c r e a s e t a k e s a t l e a s t s e v e n d a y s f o r d e t e c t i o n M o d i f i e d M i d d l e b r o o k 7 H 9 m e d i u m c a s i t o n e g l y c e r o l a n d c e l l u l o s e s p o n g e s a r e p l a c e d w i t h i n e a c h c u l t u r e b o t t l e T h e c e l l u l o s e s p o n g e s p r o v i d e a n e n v i r o n m e n t s i m u l a t i n g t h e a l v e o l i o f t h e l u n g s E a c h b o t t l e c o n t a i n s a s e n s o r a n d c o n t i n u o u s l y m o n i t o r s a n y c h a n g e s i n p r e s s u r e T h i s s y s t e m d e t e c t s t h e p r e s e n c e o f m y c o b a c t e r i a I t d o e s n o t i d e n t i f y t h e m y c o b a c t e r i a s p e c i e s H o w e v e r t h i s s y s t e m i s b e i n g t e s t e d a n d i s n o t c l i n i c a l s e t t i n g r e a d y ( 8 2 ) A n o t h e r a u t o m a t e d i n s t r u m e n t i s t h e M B / B a c T u s e d i n c l i n i c a l s p e c i m e n d e t e c t i o n b u t n o t i n b l o o d w i t h a g a s p e r m e a b l e C O2 s e n s o r t h a t c h a n g e s c o l o r f r o m g r e e n t o y e l l o w w h e n C O2 i s p r o d u c e d f r o m m e t a b o l i z i n g m y c o b a c t e r i a T h e b a c t e r i a

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1 2 m u s t g r o w t o b e d e t e c t e d b y t h i s i n s t r u m e n t T h e M B / B a c T M y c o b a c t e r i a d e t e c t i o n s y s t e m i s u s e d t o d e t e c t m y c o b a c t e r i a b u t n o t t o i d e n t i f y t h e s p e c i e s ( 6 4 ) P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) t e c h n o l o g y i s u s e d t o d e t e c t M t u b e r c u l o s i s a n d c u r r e n t l y h a s t h e m o s t p o t e n t i a l f o r r a p i d d e t e c t i o n D e t e c t i o n b y P C R r e q u i r e s a m p l i f i c a t i o n o f t a r g e t M t u b e r c u l o s i s D N A s e q u e n c e s e x t r a c t e d f r o m c l i n i c a l s p e c i m e n s a n d s u b j e c t e d t o g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 6 0 ) T h e p r o d u c t s o f P C R a r e t r a n s f e r r e d t o m e m b r a n e s a n d p r o b e s a r e u s e d t h a t b i n d s p e c i f i c D N A o f M t u b e r c u l o s i s ( 5 ) S t r a i n i d e n t i f i c a t i o n b y P C R i s b a s e d o n p r i m e r s t h a t a m p l i f y I S 6 1 1 0 a n i n s e r t i o n s e q u e n c e ( I S ) o f 1 3 6 5 b a s e p a i r s ( 7 5 ) I S 6 1 1 0 i s f o u n d o n l y i n t h e M t u b e r c u l o s i s c o m p l e x o f m y c o b a c t e r i a c o n s i s t i n g o f M t u b e r c u l o s i s M b o v i s M a f r i c a n u m M c a n e t t i a n d M m i c r o t i i ( 1 2 ) T h e I S c o p i e s v a r y f r o m t w e n t y t o o n e p e r g e n o m e ( 5 1 6 5 4 ) D N A f i n g e r p r i n t i n g i d e n t i f i e s M t u b e r c u l o s i s b a s e d o n t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e I S 6 1 1 0 i n s e r t i o n s e q u e n c e w i t h i n t h e g e n o m e T h e s e i n s e r t i o n s e q u e n c e s v a r y i n l o c a t i o n a n d i n n u m b e r w i t h i n c h r o m o s o m e s I S 6 1 1 0 i s c o n s e r v e d D i g e s t i o n o f M t u b e r c u l o s i s o c c u r s w i t h e n z y m e s y i e l d i n g f r a g m e n t s o f v a r y i n g s i z e s a n d n u m b e r s t h a t b e c o m e e v i d e n t u s i n g g e l e l e c t r o p h o r e s i s F r a g m e n t s a r e t r a n s f e r r e d t o a m e m b r a n e a n d a r a d i o l a b e l e d D N A p r o b e i s u s e d t o h y b r i d i z e T h e p a t t e r n a n d n u m b e r o f f r a g m e n t s m a k e u p t h e f i n g e r p r i n t c h a r a c t e r i s t i c o f M t u b e r c u l o s i s ( 5 ) M t u b e r c u l o s i s a l s o c a n b e i d e n t i f i e d b y n u c l e i c a c i d h y b r i d i z a t i o n S i n g l e s t r a n d e d 1 2 5I l a b e l e d D N A p r o b e s c o m p l e m e n t a r y t o r R N A o f M t u b e r c u l o s i s c o m p l e x ( M t u b e r c u l o s i s M b o v i s M a f r i c a n u m a n d M u l c e r a n s ) M a v i u m M i n t r a c e l l u l a r e M g o r d o n a e a n d M k a n s a s i i a r e u s e d i n i d e n t i f i c a t i o n o f M y c o b a c t e r i a s p e c i e s A l y s i n g o f t h e b a c t e r i u m s a m p l e o c c u r s t h r o u g h t h e u s e o f l y s i n g a g e n t h e a t a n d

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1 3 s o n i f i c a t i o n T h e D N A p r o b e f o r m s a c o m p l e x w i t h R N A a n d t h e r a d i o a c t i v e h y b r i d s a r e q u a n t i f i e d A l u m i n o m e t e r m e a s u r e s t h e v i s i b l e l i g h t t o d e t e r m i n e a p o s i t i v e C o n f i r m a t i o n o f M t u b e r c u l o s i s r e q u i r e s c o l o n y g r o w t h o n L o w e n s t e i n J e n s e n s l a n t s F o u r t o s i x w e e k s a r e r e q u i r e d f o r f i n a l i d e n t i f i c a t i o n ( 2 3 3 9 5 9 6 7 ) N o n i s o t o p i c a c r i d i n i u m e s t h e r l a b e l e d n u c l e i c a c i d p r o b e s c a n a l s o b e u s e d t o c o n f i r m i d e n t i f i c a t i o n o f M t u b e r c u l o s i s c o m p l e x M a v i u m M i n t r a c e l l u l a r e a n d M g o r d o n a e w i t h s i m i l a r t e s t i n g a s t o t h e i s o t o p i c l a b e l e d D N A p r o b e E s t e r l a b e l e d s i n g e s t r a n d e d c o m p l e m e n t a r y D N A p r o b e b i n d s t o r R N A o f b a c t e r i a T h e s e t e s t s t a k e f i v e h o u r s t o p e r f o r m ( 3 0 4 9 ) V i a b i l i t y c o n f i r m a t i o n i s s t i l l n e c e s s a r y r e q u i r i n g f o u r t o s i x w e e k s ( 4 4 7 1 7 9 ) I m p l e m e n t a t i o n o f r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e a n a l y s i s o f P C R a m p l i f i e d p r o d u c t s f o r m t a r g e t r R N A o r D N A c o n s e r v e d s e q u e n c e s i s a l s o u s e d t o i d e n t i f y M t u b e r c u l o s i s s p e c i e s a n d t o d e t e r m i n e s t r a i n v a r i a n c e ( 1 3 3 4 8 4 ) C o m b i n i n g a D N A p r o b e s p e c i f i c f o r R N A s e q u e n c e s o f M t u b e r c u l o s i s w i t h r a d i o m e t r i c c u l t u r e p r o c e d u r e s w i l l p r o d u c e r e s u l t s i n s e v e n t o t w e n t y o n e d a y s ( 5 ) G a s l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a n d h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h a v e b e e n u s e d t o i d e n t i f y M t u b e r c u l o s i s T h e s e t e s t s a n a l y z e m y c o l i c a c i d s a n d f a t t y a c i d s o f t h e c e l l w a l l o f M t u b e r c u l o s i s u s i n g h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) a n d g a s l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( G L C ) t o r a p i d l y i d e n t i f y s p e c i e s o f M t u b e r c u l o s i s T h e p r o c e s s t a k e s l e s s t h a n t w o h o u r s ( 3 2 6 5 6 7 7 7 ) U n f o r t u n a t e l y t u b e r c u l o s t e a r i c a c i d i s a l s o p r e s e n t i n A c t i n o m y c e t a l e s a n d n o n t u b e r c u l o u s b a c t e r i a s o t e s t s p e c i f i c i t y c a n b e a p r o b l e m H P L C a n d G L C h a v e n o t y e t b e e n t e s t e d u s i n g c l i n i c a l s p e c i m e n s T h e s e b i o c h e m i c a l t e c h n i q u e s w h i c h u s e e x p e n s i v e e q u i p m e n t a r e l i m i t e d t o r e f e r e n c e l a b o r a t o r i e s ( 5 )

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1 4 E n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) c a n b e u s e d t o d e t e c t M t u b e r c u l o s i s i n b o d y f l u i d s S a m p l e s r e q u i r e o v e r n i g h t i n c u b a t i o n a n d e q u i p m e n t s u c h a s a p l a t e r e a d e r W h e n d e t e c t i n g M t u b e r c u l o s i s i n s p u t u m i f n o t p r o c e s s e d c o r r e c t l y a n t i g e n m a y b e s u b j e c t t o b e i n g d e n a t u r e d i n t h e d e c o n t a m i n a t i o n p r o c e s s i n g w h i c h m a y l e a d t o s p e c i f i c i t y p r o b l e m s ( 5 8 ) I m m u n o a s s a y s f o r a n t i m y c o b a c t e r i a l a n t i b o d i e s u s i n g E L I S A h a v e a l s o b e e n p e r f o r m e d P a t i e n t s a m p l e s a r e m i x e d w i t h m y c o b a c t e r i a l a n t i g e n s A n t i b o d i e s a r e d e t e c t e d b y a d d i n g a n t i b o d i e s t o h u m a n i m m u n o g l o b u l i n f o r a c o l o r i m e t r i c a s s a y C o m b i n i n g r a d i o m e t r i c c u l t u r e m e t h o d s a n d D N A p r o b i n g M t u b e r c u l o s i s c o u l d b e i d e n t i f i e d i n t h r e e w e e k s ( 5 ) T w o t y p e s o f m y c o b a c t e r i o p h a g e b a s e d t e s t s h a v e a l s o b e e n u s e d t o d e t e c t M t u b e r c u l o s i s : t h e l u c i f e r a s e r e p o r t e r p h a g e ( L R P ) a s s a y a n d t h e F A S T P l a q u e a s s a y L R P a s s a y u s e s p h a g e s t h a t h a r b o r t h e f f l u x r e p o r t e r g e n e c o d i n g f o r l u c i f e r a s e I n t h e p r e s e n c e o f t h e s u b s t r a t e l u c i f e r i n l i g h t e m i s s i o n i s m e a s u r e d u s i n g a l u m i n o m e t e r o r p h o t o g r a p h i c f i l m L u c i f e r a s e a c t i v i t y i s d e t e c t e d i n c l i n i c a l s p e c i m e n s o n l y i f c e l l u l a r A T P i s p r e s e n t T h e e m i s s i o n o f l i g h t i s p r o p o r t i o n a l t o t h e v i a b i l i t y o f m y c o b a c t e r i a A m p l i f i c a t i o n o f M y c o b a c t e r i a i s r e q u i r e d o v e r a p p r o x i m a t e l y t w e l v e d a y s T h e F A S T P l a q u e a s s a y u s e s w i l d t y p e m y c o b a c t e r i o p h a g e s t h a t a r e m i x e d w i t h M s m e g m a t i s P h a g e s a r e r e l e a s e d f r o m M t u b e r c u l o s i s a n d i n f e c t M s m e g m a t i s P l a q u e s a r e d e t e c t a b l e o n e d a y l a t e r o n p l a t e s o f M s m e g m a t i s T h i s i s a p h a s e s u s c e p t i b i l i t y t e s t a n d d o e s n o t p o s i t i v e l y c o n f i r m i n f e c t i o n w i t h M t u b e r c u l o s i s ( 3 4 7 4 0 8 1 ) M i c r o p l a t e c o l o r i m e t r i c a s s a y s a r e u s e d t o d e t e c t d r u g r e s i s t a n t M t u b e r c u l o s i s T h e s e t e s t s u t i l i z e i n d i c a t o r s o f o x i d a t i o n r e d u c t i o n r e a c t i o n s t h a t o c c u r d u r i n g m y c o b a c t e r i a g r o w t h i n t h e p r e s e n c e o f a n t i t u b e r c u l o s i s d r u g s T h e t e s t i s i n c u b a t e d f o r

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1 5 f i v e t o s e v e n d a y s A c o l o r c h a n g e d u e t o a r e d u c t i o n r e a c t i o n d e m o n s t r a t e s t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f d r u g r e s i s t a n t M t u b e r c u l o s i s ( 1 4 6 3 ) A t a u t o p s y t h e r e i s t h e r i s k o f e x p o s u r e t o a g r e a t m a n y i n f e c t i o u s a g e n t s t h a t c a n b e a e r o s o l i z e d a n d b l o o d b o r n e i n c l u d i n g h u m a n i m m u n o d e f i c i e n c y v i r u s M t u b e r c u l o s i s a n d h e p a t i t i s C a n d B E v e n w i t h p r o p e r f a c i l i t y d e s i g n a p p r o p r i a t e a u t o p s y p r o c e d u r e p r o t o c o l s a n d t h e u s e o f p e r s o n a l p r o t e c t i v e e q u i p m e n t t r a n s m i s s i o n d o e s o c c u r f r o m d e c e d e n t s t o a u t o p s y p e r s o n n e l T h e h i g h r a t e o f e x p o s u r e o f m e d i c a l l a b o r a t o r y w o r k e r s p a t h o l o g i s t s a n d a u t o p s y t e c h n i c i a n s o f t e n l e a d s t o t h e d e v e l o p m e n t o f M t u b e r c u l o s i s i n f e c t i o n ( 2 9 6 1 ) T h e r e a r e n u m e r o u s r e p o r t s o f p u l m o n a r y t u b e r c u l o s i s a c q u i s i t i o n b y l a b o r a t o r y a n d a u t o p s y r o o m s t a f f i n w h i c h t h e r e i s a o n e h u n d r e d t o t w o h u n d r e d t i m e s r a t e o f a c q u i s i t i o n t h a n t h e g e n e r a l p u b l i c D u r i n g t h e i r p r o f e s s i o n a l c a r e e r s b o t h p a t h o l o g i s t s a n d p a t h o l o g y a s s i s t a n t s w i l l b e e x p o s e d t o M t u b e r c u l o s i s w i t h h i g h p r o b a b i l i t y o f i n f e c t i o n ( 2 8 ) T h e r e a r e s e v e r a l s t u d i e s d e m o n s t r a t i n g M t u b e r c u l o s i s t r a n s m i s s i o n t h r o u g h r o u t i n e e m b a l m i n g f r o m c a d a v e r s t o f u n e r a l d i r e c t o r s a n d m o r t u a r y w o r k e r s ( 4 8 ) F o r m a l i n f i x e d t i s s u e c o n t a i n i n g M t u b e r c u l o s i s p o s e s a r i s k o f b e i n g i n f e c t i v e b y a e r o s o l i z a t i o n a n d i n o c u l a t i o n ( 2 9 ) T h e a s s a y s d e s c r i b e d a b o v e h a v e m a n y l i m i t a t i o n s M o s t a s s a y s r e q u i r e e x p e n s i v e e q u i p m e n t t e c h n i c a l e x p e r t i s e a n d r e q u i r e d a y s t o w e e k s f o r r e s u l t s T h e r e i s a s i g n i f i c a n t n e e d f o r i m p r o v e d a n d r a p i d d i a g n o s t i c t e s t i n g f o r t u b e r c u l o s i s i n f e c t i o n s T h e M e d i c a l E x a m i n e r ’ s m i s s i o n i s t o i n v e s t i g a t e a n d t r y t o e x p l a i n t h e c a u s e o f d e a t h o f d e c e d e n t s w h e n d e a t h i s u n a t t e n d e d u n e x p e c t e d o r v i o l e n t a s w e l l a s g i v e a p p r o v a l f o r c r e m a t i o n r e m o v a l o f a b o d y f r o m t h e s t a t e b u r i a l a t s e a o r a n a t o m i c a l d i s s e c t i o n ( 5 8 ) L u n g t i s s u e s a m p l e s s u s p e c t e d o f M t u b e r c u l o s i s i n f e c t i o n a r e s e n t t o

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1 6 t h e S t a t e o f F l o r i d a D e p a r t m e n t o f H e a l t h B u r e a u o f L a b o r a t o r i e s M y c o b a c t e r i o l o g y L a b o r a t o r i e s i n J a c k s o n v i l l e F l o r i d a S p e c i a l i n s t r u c t i o n s a r e t o c o l l e c t t h e s p e c i m e n a s e p t i c a l l y a n d a v o i d i n d i g e n o u s m i c r o b i o t a A c a s e o u s p o r t i o n i s t o b e s e l e c t e d i f a v a i l a b l e T h e s p e c i m e n i s n o t t o b e i m m e r s e d i n s a l i n e ( o r o t h e r f l u i d ) o r w r a p p e d i n g a u z e T h e s p e c i m e n i s n o t t o b e f r o z e n a s f r e e z i n g d e c r e a s e s y i e l d S p e c i m e n s c a n n o t b e s u b m i t t e d i n f o r m a l i n S p e c i m e n r e q u i r e m e n t s a r e o n e g r a m o f t i s s u e w i t h o u t f i x a t i v e o r p r e s e r v a t i v e T h e s p e c i m e n m a y b e s h i p p e d i n a s t e r i l e c o n t a i n e r w i t h a s m a l l a m o u n t o f s t e r i l e w a t e r o r s t e r i l e s a l i n e ( t o k e e p t h e s p e c i m e n m o i s t ) T h e s t a t e l a b o r a t o r y p r o c e s s e s b o d y f l u i d s s w a b s p e c i m e n s t i s s u e a n d b o n e A t t h e s t a t e l a b o r a t o r y t i s s u e s a m p l e s a r e p r o c e s s e d b y c u t t i n g t h e t i s s u e i n t o s e v e r a l s m a l l p i e c e s w i t h s t e r i l e s c i s s o r s a n d p l a c i n g t h e p i e c e s i n t o a s t e r i l e g r i n d e r S a l i n e s o l u t i o n i s p l a c e d i n t o t h e g r i n d e r T h e t i s s u e i s g r i n d e d w e l l u s i n g a b a c k a n d f o r t h m o t i o n w h i l e a p p l y i n g p r e s s u r e u n t i l o n l y t h e f i b r o u s p o r t i o n o f t h e t i s s u e r e m a i n s T h e f l u i d i s t h e n r e m o v e d f r o m t h e t i s s u e g r i n d e r D i g e s t i o n a n d d e c o n t a m i n a t i o n o f s p e c i m e n s m u s t t h e n o c c u r N a c e t y l L c y s t e i n e / s o d i u m h y d r o x i d e m e t h o d ( N A L C N a O H ) i s u s e d t o d e c o n t a m i n a t e s p e c i m e n s A v o l u m e o f N A L C N a O H s o l u t i o n e q u a l t o t h e v o l u m e o f t h e s p e c i m e n i s a d d e d E a c h s p e c i m e n i s m i x e d w i t h a v o r t e x e d a c t i o n u n t i l l i q u e f i e d T h e s p e c i m e n s a r e n o t t o b e o v e r m i x e d b e c a u s e a e r a t i o n o f t h e s p e c i m e n m a y i n a c t i v a t e t h e N A L C a n d c a u s e t h e s p e c i m e n t o g e l T h e s p e c i m e n i s l e t t o s t a n d a t r o o m t e m p e r a t u r e A 6 8 p H p h o s p h a t e b u f f e r i s a d d e d a f t e r d e c o n t a m i n a t i o n T h e t u b e i s r e c a p p e d a n d i n v e r t e d t o m i x E a c h s a m p l e i s c e n t r i f u g e d a n d t h e s u p e r n a t a n t i s d e c a n t e d w i t h o u t d i s t u r b i n g t h e s e d i m e n t T h e s e d i m e n t i s r e s u s p e n d e d w i t h p h o s p h a t e b u f f e r a n d u s e d t o i n o c u l a t e m e d i a a n d p r e p a r e s m e a r s I f s p e c i m e n s a r e c o n t a m i n a t e d w i t h P s e u d o m o n a s s p e c i e s o r f r o m

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1 7 p a t i e n t s w i t h c y s t i c f i b r o s i s t h e O x a l i c a c i d m e t h o d o f d e c o n t a m i n a t i o n i s p e r f o r m e d T h e i n o c u l a t i o n o f m e d i a a n d s m e a r p r e p a r a t i o n i s p e r f o r m e d w i t h a s t e r i l e c o t t o n t i p s w a b a n d a g e n e r o u s a m o u n t o f s e d i m e n t i s i n o c u l a t e d i n t o L o w e n s t e i n J e n s e n ( L J ) s l a n t s T h e i n c u b a t i o n o f L J s l a n t s w i t h c a p s l o o s e o c c u r s a t 3 5 C i n t h e p r e s e n c e o f f i v e t o t e n p e r c e n t C O2. S l a n t s a r e e x a m i n e d t w i c e a w e e k f o r t w o w e e k s a n d t h e n o n c e a w e e k f o r u p t o e i g h t w e e k s f o r g r o w t h T h e L o w e n s t e i n J e n s e n s l a n t s a r e e x a m i n e d f o r g r o w t h b y u s i n g a l i g h t w i t h a m a g n i f y i n g l e n s I f g r o w t h i s o b s e r v e d t h e Z i e h l N e e l s e n a c i d f a s t s t a i n i s p e r f o r m e d a n d e x a m i n e d w i t h a m i c r o s c o p e I f t h e g r o w t h i s n o t a c i d f a s t t h e s l a n t i s r e i n c u b a t e d a n d r e e x a m i n e d I f t h e s l a n t b e c o m e s o v e r g r o w n w i t h n o n a c i d f a s t o r g a n i s m s t h e s l a n t i s d i s c a r d e d T h e s m e a r i s e x a m i n e d b y m a k i n g a s e r i e s o f n i n e v e r t i c a l p a r a l l e l o r t h r e e h o r i z o n t a l s w e e p s o f t h e s l i d e v i e w i n g a t l e a s t 3 0 0 f i e l d s Q u a n t i f i c a t i o n o f s m e a r r e s u l t s i s n o t e d D N A p r o b e i d e n t i f i c a t i o n i s t h e n p e r f o r m e d D N A p r o b e s o f M t u b e r c u l o s i s c o m p l e x M a v i u m M i n t r a c e l l u l a r e a n d M g o r d o n a e a r e u s e d t o i d e n t i f y t h e m y c o b a c t e r i a D N A f i n g e r p r i n t i n g a n d s t r a i n t y p i n g u s i n g R F L P r e s t r i c t i o n f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m c a n b e u s e d t o f u r t h e r i d e n t i f y m y c o b a c t e r i a N u c l e i c a c i d a m p l i f i c a t i o n ( P C R ) a n d h y b r i d i z a t i o n a s s a y s c a n a l s o b e p e r f o r m e d t o i d e n t i f y t h e m y c o b a c t e r i a R e s u l t s a r e t h e n i s s u e d t o t h e M e d i c a l E x a m i n e r ’ s O f f i c e w h e r e t h e a u t o p s y r e p o r t c a n t h e n b e f i n a l i z e d a n d t h o s e a t r i s k o f e x p o s u r e n o t i f i e d T h e s e a r e a l l t i m e c o n s u m i n g p r o c e d u r e s ( 2 0 4 4 4 6 5 0 7 1 7 9 ) A t t h e H i l l s b o r o u g h C o u n t y M e d i c a l E x a m i n e r ’ s O f f i c e a s w e l l a s o t h e r m e d i c a l e x a m i n e r s ’ o f f i c e s t h e r e i s n o r a p i d d i a g n o s t i c t e c h n i q u e t o d e t e r m i n e i f a d e c e d e n t i s i n f e c t e d w i t h M t u b e r c u l o s i s ( 2 0 5 0 ) B o d i e s a r e r e c e i v e d f r o m h o s p i t a l s r e s i d e n c e s a c c i d e n t s j a i l s a n d f u n e r a l h o m e s T h e s t a t e s o f d e c o m p o s i t i o n o f t h e b o d i e s v a r y

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1 8 g r e a t l y A l l t h o s e p r e s e n t d u r i n g a n a u t o p s y d o c t o r s a u t o p s y t e c h n i c i a n s m e d i c a l s t u d e n t s a n d d e t e c t i v e s a r e a t p o s s i b l e r i s k o f e x p o s u r e t o M t u b e r c u l o s i s ( 4 4 4 7 ) T h e r e i s e v i d e n c e o f t u b e r c u l i n s k i n t e s t c o n v e r s i o n s o c c u r r i n g i n a u t o p s y p e r s o n n e l a s a r e s u l t o f e x p o s u r e t o d e c e d e n t s i n f e c t e d w i t h M t u b e r c u l o s i s ( 8 0 ) T h r o u g h i n v e s t i g a t i o n i t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t p o s t m o r t e m e x a m i n a t i o n o f d e c e d e n t l u n g t i s s u e a n d a u t o p s y s t a f f s p u t u m b o t h i n f e c t e d w i t h M t u b e r c u l o s i s c a n h a v e i d e n t i c a l M t u b e r c u l o s i s D N A f i n g e r p r i n t s a s a r e s u l t o f s t a f f b e i n g e x p o s e d a t a u t o p s y ( 7 4 ) A t t h e U n i v e r s i t y o f N e w M e x i c o S c h o o l o f M e d i c i n e a s t u d y w a s p e r f o r m e d t h a t i n v e s t i g a t e d t h e p o s t m o r t e m s u r v i v a l a b i l i t y o f M t u b e r c u l o s i s i n l u n g t i s s u e f r o m a n u n e m b a l m e d e x h u m e d b o d y E i g h t d a y s a f t e r d e a t h t h e r e w a s v i a b i l i t y o f M t u b e r c u l o s i s i n t h e l u n g t i s s u e d e m o n s t r a t i n g t h a t b o d i e s w i t h p o s t m o r t e m i n t e r v a l s w i t h e x t e n d e d t i m e b e t w e e n d e a t h a n d a u t o p s y c a n p o t e n t i a l l y b e i n f e c t i o u s w i t h M t u b e r c u l o s i s T h e a c t u a l c a u s e o f d e a t h o f t h i s d e c e d e n t w a s p u l m o n a r y t u b e r c u l o s i s ( 6 2 ) P u l m o n a r y t u b e r c u l o s i s c a n n o t b e d i a g n o s e d b y p h y s i c a l f i n d i n g s ( 1 6 ) I f a d e c e d e n t i s s u s p e c t e d t o h a v e h a d t u b e r c u l o s i s a t t i m e o f d e a t h a t a u t o p s y a f t e r t h e c h e s t c a v i t y i s o p e n e d a n d l u n g s r e m o v e d t h e l u n g s a r e s l i c e d o n a c u t t i n g b o a r d a n d s a m p l e s a r e t a k e n o f c a s e o u s o r l e s i o n a r e a s T e s t i n g o f t h e s a m p l e s t a k e s a m i n i m u m o f o n e m o n t h ( 2 0 3 1 4 7 5 0 ) D u r i n g t h i s t i m e t h o s e w h o m a y h a v e b e e n e x p o s e d a r e p o s t p o n i n g t r e a t m e n t a t t h e m i n i m u m f o r o n e m o n t h I n a d d i t i o n a u t o p s y r e s u l t s a r e i n c o m p l e t e ( 5 0 ) D e v e l o p m e n t o f a r a p i d m e t h o d t o d e t e c t M t u b e r c u l o s i s f r o m l u n g t i s s u e a t a u t o p s y w o u l d b e a s i g n i f i c a n t b e n e f i t t o m e d i c a l e x a m i n e r s ’ o f f i c e s a n d p a t h o l o g i s t s w o r l d w i d e R a p i d d i a g n o s i s w o u l d a l l o w a u t o p s y p e r s o n n e l w h o h a d b e e n e x p o s e d t o a n

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1 9 i n f e c t e d d e c e d e n t t o b e t e s t e d e a r l i e r f o r p o s s i b l e c o n t r a c t i o n o f M t u b e r c u l o s i s a n d b e g i n i m m e d i a t e t r e a t m e n t i f n e e d e d T h e A n a l y t e 2 0 0 0 a n d t h e R A P T O R ( R e s e a r c h I n t e r n a t i o n a l M o n r o e W A ) a r e t h e t w o b i o s e n s o r s u s e d f o r t h i s s t u d y T h e A n a l y t e 2 0 0 0 m u s t b e o p e r a t e d i n a m a n u a l m o d e w h e r e a s t h e R A P T O R i s p o r t a b l e a n d a u t o m a t e d w i t h a f o o t p r i n t t h e s i z e o f a c a r b a t t e r y T h e s e e v a n e s c e n t w a v e f i b e r o p t i c b i o s e n s o r s h a v e a l a s e r t h a t e m i t s a 6 3 5 n m b e a m o f l i g h t T h e l a s e r e x c i t e s t h e f l u o r e s c e n t m o l e c u l e c y a n i n e 5 ( C y 5 ) c a u s i n g t h e C y 5 t o e m i t l i g h t a t w a v e l e n g t h s a b o v e 6 7 0 n m T h e e m i t t e d l i g h t i s r e c o r d e d i n p i c o A m p s b y t h e b i o s e n s o r T h e s i g n a l i n c r e a s e s i n p r o p o r t i o n t o t h e a m o u n t o f t a r g e t b a c t e r i a p r e s e n t o n a w a v e g u i d e T h e s e b i o s e n s o r s h a v e b e e n u s e d t o d e t e c t S t a p h y l o c o c c a l e n t e r o t o x i n B r i c i n C l o s t r i d i u m b o t u l i n u m t o x i n A E c o l i l i p o p o l y s a c c h a r i d e e n d o t o x i n B a c i l l u s a n t h r a c i s E s c h e r i c h i a c o l i O 1 5 7 : H 7 S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m V a c c i n i a v i r u s F r a n c i s e l l a t u l a r e n s i s C r y p t o s p o r i d i u m p a r v u m i n m a t r i c e s o f a p p l e j u i c e g r o u n d b e e f o t h e r f o o d s d r i n k i n g w a t e r s e a w a t e r a n d h u m a n c l i n i c a l s p e c i m e n s ( 2 1 2 2 5 2 ) A s a n d w i c h i m m u n o a s s a y i s t h e b a s i s f o r t h e b i o s e n s o r s ’ d e t e c t i o n p l a t f o r m s T h e s e b i o s e n s o r s u s e p o l y s t y r e n e w a v e g u i d e s c o a t e d w i t h s t r e p t a v i d i n ( a p r o t e i n p r o d u c e d b y S t r e p t o m y c e s a v i d i n i i w h i c h h a s f o u r b i n d i n g s i t e s f o r b i o t i n ) A b i o t i n l a b e l e d p o l y c l o n a l c a p t u r e i s t h e n i n c u b a t e d o n t h e w a v e g u i d e s T h e s a m p l e o f i n t e r e s t i s a p p l i e d t o t h e w a v e g u i d e s a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e A C y a n i n e 5 ( C y 5 ) l a b e l e d d e t e c t i o n p o l y c l o n a l a n t i b o d y i s t h e n i n c u b a t e d o n t h e w a v e g u i d e T h e r e f o r e r a p i d d e t e c t i o n o f M t u b e r c u l o s i s a t a u t o p s y u s i n g l u n g t i s s u e f r o m d e c e d e n t s w o u l d b e a h e l p f u l d i a g n o s t i c t o o l T h e r e a r e c u r r e n t l y n o r a p i d p r o c e d u r e s t o

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2 0 d e t e c t M t u b e r c u l o s i s T h e o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y w a s t o d e v e l o p a r a p i d b i o s e n s o r a s s a y t h a t w i l l d e t e c t M t u b e r c u l o s i s i n l u n g t i s s u e

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2 1 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s C h e m i c a l s a n d B u f f e r s A l l r e a g e n t s w e r e f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t L o u i s M O ) u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d T h e f o l l o w i n g s o l u t i o n s w e r e u s e d f o r a l l e x p e r i m e n t s u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d P h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e p H 7 4 ( P B S ) c o n s i s t e d o f 0 1 M s o d i u m p h o s p h a t e p H 7 4 a n d 0 8 5 % ( w t / v o l ) s o d i u m c h l o r i d e P B S c o n t a i n i n g T w e e n 2 0 ( P B S T ) c o n s i s t e d o f P B S w i t h 0 1 % T w e e n 2 0 B l o c k i n g b u f f e r w a s m a d e w i t h P B S T 2 m g / m l c a s e i n a n d 2 m g / m l B S A N u P A G E s a m p l e t r a n s f e r b u f f e r w a s u s e d i n p e r f o r m i n g W e s t e r n b l o t t i n g f r o m I n v i t r o g e n ( C a r l s b a d C A ) F i x i n g s o l u t i o n f o r f i x i n g p r o t e i n s t o g e l s c o n s i s t e d o f 7 5 % m e t h a n o l ( v o l / v o l ) 1 0 % a c e t i c a c i d ( v o l / v o l ) a n d 8 2 5 % w a t e r B o r a t e b u f f e r c o n s i s t e d o f p H 9 7 B o r a x a n d M g S O4 7 H2O C o l u m n b u f f e r w a s m a d e w i t h P B S a n d 0 0 2 % ( w t / v o l ) s o d i u m a z i d e S o d i u m c a r b o n a t e s o l u t i o n s c o n s i s t e d o f 0 1 M s o d i u m c a r b o n a t e a t p H 8 5 o r a t p H 9 3 B a c t e r i a l S t r a i n s F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e L o t 5 1 H 8 9 2 5 w a s o b t a i n e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y T h e f o l l o w i n g b a c t e r i a w e r e o b t a i n e d f r o m T h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n ( A T C C ) : a t t e n u a t e d M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s A T T C 2 5 1 7 7 E c o l i K 1 2 A T C C 2 3 7 2 4 K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e A T C C 1 3 8 8 3 M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e A T C C 1 4 4 7 0 M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e A T C C 1 3 9 5 0 a n d S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s A T C C 6 5 3 8 C a n d i d a a l b i c a n s H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s

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2 2 M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s P r o t e u s m i r a b i l i s P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e a n d S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e w e r e o b t a i n e d f r o m t h e U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a A d v a n c e d B i o s e n s o r s L a b o r a t o r y c u l t u r e c o l l e c t i o n A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s w a s c u l t u r e d o n B B L L o w e n s t e i n J e n s e n m e d i u m s l a n t s ( B D S p a r k s M D ) H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e w a s g r o w n o n H a e m o p h i l u s i s o l a t i o n a g a r p l a t e s ( R e m e l L e n e x a K S ) A l l o t h e r b a c t e r i a w e r e c u l t u r e d o n s h e e p b l o o d a g a r p l a t e s ( R e m e l L e n e x a K S ) A l l b a c t e r i a w e r e i n c u b a t e d i n 5 % C O2 a t 3 7 C A n t i b o d i e s R a b b i t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y ( a g a i n s t a l l a n t i g e n s ) a n d b i o t i n c o n j u g a t e d r a b b i t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y ( a g a i n s t a l l a n t i g e n s ) w e r e o b t a i n e d f r o m B i o d e s i g n I n t e r n a t i o n a l ( S a c o M E ) T h e i m m u n o g e n w a s p u r i f i e d p r o t e i n d e r i v a t i v e o f M t u b e r c u l o s i s W h e n t h e s e a n t i b o d i e s w e r e t e s t e d t h e m a j o r r e a c t i v i t y w a s t o t w o p r o t e i n s a t t h e g a m m a a n d b e t a p o s i t i o n s T h e i d e n t i t y o f t h e s e p r o t e i n s h a s n o t b e e n d e t e r m i n e d T h e s e a n t i b o d i e s h a v e n o t b e e n a b s o r b e d a n d m a y b e r e a c t i v e w i t h r e l a t e d o r g a n i s m s T h e a f f i n i t y p u r i f i e d a n t i r a b b i t I g G c o n j u g a t e d t o h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ( H R P ) w a s o b t a i n e d f r o m K i r k e g a a r d a n d P e r r y L a b o r a t o r i e s ( G a i t h e r s b u r g M D ) A n t i b o d y L a b e l i n g R a b b i t a n t i b o d y t o M t u b e r c u l o s i s c a t a l o g # B 6 5 6 0 1 R ( B i o d e s i g n I n t e r n a t i o n a l ) w i t h a c o n c e n t r a t i o n o f 2 m g / m l w a s a d d e d t o 2 7 7 l o f 0 1 M c a r b o n a t e b u f f e r p H 9 3 i n a C y 5 d y e v i a l ( F l u o r o L i n k C y 5 r e a c t i v e d y e p a c k ; A m e r s h a m B i o s c i e n c e s P i s c a t a w a y N J ) a n d i n c u b a t e d f o r 1 h r a t 2 4 C o n a r o c k e r A P 1 0 c o l u m n ( B i o G e l P 1 0 g e l B i o R a d H e r c u l e s C A ) w a s p r e p a r e d a n d u s e d t o s e p a r a t e l a b e l e d a n t i b o d y f r o m n o n c o n j u g a t e d d y e T h e c o l u m n h a s a n e x c l u s i o n l i m i t o f 2 0 0 0 0 D a l t o n s a n d a b e d

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2 3 v o l u m e o f 1 0 m l T h e l a b e l e d a n t i b o d y w a s c o l l e c t e d a n d t h e a b s o r b a n c e a t 2 8 0 n m a n d 6 5 0 n m w a s r e c o r d e d u s i n g a D U 6 4 S p e c t r o p h o t o m e t e r ( B e c k m a n F u l l e r t o n C A ) T h e a b s o r b a n c e v a l u e s w e r e t h e n u s e d t o c a l c u l a t e t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a n d t h e d y e t o p r o t e i n r a t i o P r e p a r a t i o n o f F r e u n d ’ s A d j u v a n t C o m p l e t e E a c h m l o f F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e ( S i g m a ) c o n t a i n e d 1 m g M t u b e r c u l o s i s ( H 3 7 R a A T C C 2 5 1 7 7 ) h e a t k i l l e d a n d d r i e d 0 8 5 m l m i n e r a l o i l a n d 0 1 5 m l m a n n i d e m o n o o l e a t e F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e w a s f i r s t s e p a r a t e d i n t o a n o i l l a y e r a n d a c e l l l a y e r U s i n g a 1 5 m l c o n i c a l t u b e a 1 0 m l s a m p l e o f F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e w a s c e n t r i f u g e d f o r 2 0 m i n a t 1 4 3 0 x g a t 4 C T h e o i l l a y e r w a s s e r i a l d i l u t e d u s i n g P B S T h e y e l l o w w h i t e p e l l e t w a s w a s h e d t w i c e w i t h P B S T a n d r e s u s p e n d e d i n 1 m l o f P B S T T h e r e s u s p e n d e d p e l l e t w a s s e r i a l d i l u t e d i n P B S F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e w a s a l s o s e r i a l d i l u t e d i n P B S A d i r e c t c o u n t o f r e s u s p e n d e d p e l l e t c o u l d n o t b e p e r f o r m e d d u e t o i n t e r f e r e n c e f r o m o i l d r o p l e t s E L I S A D i r e c t e n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y s ( E L I S A s ) w e r e u s e d a s a n i n i t i a l s c r e e n i n g m e t h o d t o t e s t t h e r e a c t i v i t y o f a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y t o i n h o u s e t r e a t e d F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s a n d o t h e r t y p e s o f b a c t e r i a B a c t e r i a t o b e t e s t e d w e r e s e r i a l d i l u t e d i n P B S A v o l u m e o f 1 0 0 l w a s a d d e d t o t h e a p p r o p r i a t e w e l l s o f a 9 6 w e l l m i c r o w e l l p l a t e ( N u n c M a x i S o r p R o s k i l d e O K ) a n d i n c u b a t e d f o r 1 8 h o u r s a t 4 C T h e w e l l s w e r e w a s h e d w i t h P B S T u s i n g a p l a t e w a s h e r ( E L X 5 0 B i o T e k I n s t r u m e n t s I n c W i n o o s k i V T ) A v o l u m e o f 1 0 0 l o f b l o c k i n g b u f f e r w a s a d d e d t o e a c h w e l l a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e a t 2 4 C f o r 3 0 m i n T h e

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2 4 w e l l s w e r e w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h P B S T R a b b i t a n t i b o d y a n t i M t u b e r c u l o s i s 1 0 0 l a t 1 0 g / m l i n P B S o r b l o c k i n g b u f f e r w a s a d d e d t o e a c h w e l l a n d i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n a t 2 4 C W e l l s w e r e t h e n w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h P B S T O n e h u n d r e d l o f a n t i r a b b i t I g G c o n j u g a t e d t o H R P 2 g / m l i n P B S w a s a d d e d t o e a c h w e l l a n d i n c u b a t e d a t 2 4 C f o r 3 0 m i n W e l l s w e r e t h e n w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h P B S T A v o l u m e o f 1 0 0 l o f Q u a n t a B l u F l u o r o g e n i c P e r o x i d a s e S u b s t r a t e ( P i e r c e R o c k f o r d I L ) p r e p a r e d a c c o r d i n g t o m a n u f a c t u r e r ’ s i n s t r u c t i o n w a s a d d e d t o e a c h w e l l a n d i n c u b a t e d f o r 1 5 m i n a t 2 4 C Q u a n t a B l u s t o p s o l u t i o n 1 0 0 l w a s t h e n a d d e d t o e a c h w e l l T h e p l a t e w a s r e a d o n t h e f l u o r o m e t e r ( S p e c t r a M a x G e m i n i X S M o l e c u l a r D e v i c e s S u n n y v a l e C A ) a t 3 4 0 n m e x c i t a t i o n a n d 4 2 0 n m e m i s s i o n M t u b e r c u l o s i s ( A T C C 2 5 1 7 7 ) w a s g r o w n o n B B L L o w e n s t e i n J e n s e n m e d i u m s l a n t s w i t h a n i n c u b a t i o n t i m e o f a p p r o x i m a t e l y t h r e e w e e k s a t 3 7 C i n 5 % C O2 ( B D S p a r k s M D ) M t u b e r c u l o s i s w a s r e m o v e d u s i n g a s t e r i l e l o o p a n d p l a c e d i n a s t e r i l e 5 0 m l c o n i c a l t u b e c o n t a i n i n g P B S T T h e t u b e w a s s o n i c a t e d f o r f i v e m i n u t e s i n a B r a n s o n 1 5 1 0 S o n i c a t o r f r o m B r a n s o n U l t r a s o n i c C o r p o r a t i o n ( D a n b u r y C T ) a n d c o u n t e d d i r e c t l y u s i n g a d i s p o s a b l e c o u n t i n g c h a m b e r c e l l o m e t e r ( N e x c e l o m L a w r e n c e M A ) W e s t e r n B l o t s A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s E c o l i K 1 2 H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s P r o t e u s m i r a b i l i s P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s C a n d i d a a l b i c a n s M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e a n d M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e w e r e p r e p a r e d s o t h a t e a c h s t o c k c o n c e n t r a t i o n w a s 1 2 x 1 08 C F U / m l A l l M y c o b a c t e r i u m c o n c e n t r a t i o n s w e r e a d j u s t e d b y d i l u t i n g i n P B S T

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2 5 O t h e r b a c t e r i a w e r e d i l u t e d i n P B S B a c t e r i a l s u s p e n s i o n s w e r e m i x e d w i t h e q u a l v o l u m e s o f s a m p l e b u f f e r a n d e l e c t r o p h o r e s e d a t 2 0 0 v o l t s f o r 3 0 m i n u s i n g N u P A G E S D S r u n n i n g b u f f e r ( N u P A G E ) o n 1 0 % N u P A G E S D S g e l s ( N u P A G E I n v i t r o g e n L i f e T e c h n o l o g i e s C a r l s b a d C A ) T h e g e l s w e r e t h e n e l e c t r o p h o r e t i c a l l y t r a n s f e r r e d t o 0 4 5 m p o r e s i z e d n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s ( S i g m a ) T h e m e m b r a n e w a s b l o c k e d f o r 3 0 m i n a t 2 4 C u s i n g 5 % s k i m m i l k i n P B S T h e m e m b r a n e w a s t h e n i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n a t 2 4 C w i t h a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y a t a c o n c e n t r a t i o n o f 2 5 g / m l A f t e r w a s h i n g t h e m e m b r a n e w i t h P B S T b o u n d a n t i b o d i e s w e r e d e t e c t e d u s i n g a n a l k a l i n e p h o s p h a t a s e c o n j u g a t e d g o a t a n t i r a b b i t I g G i n 5 % s k i m m i l k a t c o n c e n t r a t i o n 0 3 5 g / m l T h e a n t i b o d y w a s i n c u b a t e d w i t h t h e m e m b r a n e f o r 3 0 m i n a t 2 4 C A f t e r w a s h i n g w i t h P B S T t h e m e m b r a n e w a s d e v e l o p e d f o r 3 0 m i n u t e s u s i n g o r t h o d i a n i s i d i n e a n d B n a p t h y l a c i d p h o s p h a t e i n B o r a t e b u f f e r ( 1 1 4 4 g B o r a x p H 9 7 0 6 g M g S O4 7 H2O 5 0 0 m l w a t e r 1 3 m g o r t h o d i a n i s i d i n e a n d 1 3 m g B n a p t h y l a c i d p h o s p h a t e ) W a v e g u i d e P r e p a r a t i o n P o l y s t y r e n e w a v e g u i d e s ( R e s e a r c h I n t e r n a t i o n a l M o n r o e W A ) w e r e s o n i c a t e d f o r 3 0 s e c o n d s i n a s o n i c a t i n g b a t h ( U l t r a s o n i c C l e a n e r M o d e l 2 5 0 E / M C C o r p H a u p p a u g h N Y ) c o n t a i n i n g i s o p r o p a n o l a n d d i p p e d i n t o d e i o n i z e d w a t e r t o r i n s e T h e w a v e g u i d e s w e r e a l l o w e d t o a i r d r y i n a w a v e g u i d e s t a n d T h e d i s t a l t i p s o f t h e w a v e g u i d e s w e r e p a i n t e d w i t h f l a t b l a c k m o d e l p a i n t ( T e s t o r s R o c k f o r d I L ) t o p r o v i d e a l i g h t d u m p P a i n t w a s a l l o w e d t o d r y T h e w a v e g u i d e s w e r e t h e n i n s e r t e d i n t o c u t g l a s s c a p i l l a r y t u b e s a n d i n c u b a t e d a t 4 C f o r 1 2 h o u r s w i t h a 1 0 0 g / m l s o l u t i o n o f s t r e p t a v i d i n W a v e g u i d e s w e r e r i n s e d w i t h P B S T B i o t i n l a b e l e d a n t i M t u b e r c u l o s i s

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2 6 a n t i b o d y w a s u s e d a s t h e c a p t u r e a n t i b o d y ( B i o d e s i g n I n t e r n a t i o n a l ) C a p t u r e a n t i b o d y a t 1 0 0 g / m l i n P B S w a s a d d e d t o a n d i n c u b a t e d w i t h w a v e g u i d e s f o r 3 0 m i n C a p t u r e a n t i b o d y s o l u t i o n w a s t h e n r e p l a c e d w i t h f r e s h c a p t u r e a n t i b o d y s o l u t i o n a n d i n c u b a t e d f o r a n o t h e r 3 0 m i n b e f o r e u s i n g i n a n a s s a y W a v e g u i d e s w e r e d i p p e d i n P B S t e n t i m e s b e f o r e i n s e r t i o n i n t o c o u p o n s t o r e m o v e e x c e s s b i o t i n l a b e l e d a n t i b o d y F i g u r e 1 s h o w s a w a v e g u i d e F i g u r e 1 : W a v e g u i d e A n a l y t e 2 0 0 0 T h e A n a l y t e 2 0 0 0 ( R e s e a r c h I n t e r n a t i o n a l M o n r o e W A ) i s o n e o f t w o b i o s e n s o r s u s e d i n t h i s s t u d y T h i s b i o s e n s o r i s a s m a l l p o r t a b l e m a n u a l m o d e f i b e r o p t i c b i o s e n s o r t h a t h a s b e e n u s e d t o r a p i d l y d e t e c t b a c t e r i a A s a n d w i c h i m m u n o a s s a y i s t h e

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2 7 b a s i s f o r t h e b i o s e n s o r ’ s d e t e c t i o n p l a t f o r m T h i s b i o s e n s o r u s e s p o l y s t y r e n e w a v e g u i d e s c o a t e d w i t h s t r e p t a v i d i n ( a p r o t e i n p r o d u c e d b y S t r e p t o m y c e s a v i d i n i i w h i c h h a s f o u r b i n d i n g s i t e s f o r b i o t i n ) A b i o t i n l a b e l e d p o l y c l o n a l c a p t u r e a n t i b o d y i s t h e n i n c u b a t e d o n t h e w a v e g u i d e s T h e s a m p l e o f i n t e r e s t i s a p p l i e d t o t h e w a v e g u i d e s a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e A C y a n i n e 5 ( C y 5 ) l a b e l e d d e t e c t i o n p o l y c l o n a l a n t i b o d y i s t h e n i n c u b a t e d o n t h e w a v e g u i d e T h e A n a l y t e 2 0 0 0 i s a n e v a n e s c e n t w a v e f i b e r o p t i c b i o s e n s o r t h a t h a s a l a s e r t h a t e m i t s a 6 3 5 n m b e a m o f l i g h t T h e l a s e r e x c i t e s t h e f l u o r e s c e n t m o l e c u l e c y a n i n e 5 ( C y 5 ) c a u s i n g t h e C y 5 t o e m i t l i g h t a t w a v e l e n g t h s a b o v e 6 7 0 n m T h e e m i t t e d l i g h t i s r e c o r d e d i n p i c o A m p s b y t h e b i o s e n s o r T h e s i g n a l i n c r e a s e s i n p r o p o r t i o n t o t h e a m o u n t o f t a r g e t b a c t e r i a p r e s e n t o n a w a v e g u i d e T h i s b i o s e n s o r h a s b e e n u s e d t o d e t e c t S t a p h y l o c o c c a l e n t e r o t o x i n B r i c i n C l o s t r i d i u m b o t u l i n u m t o x i n A E c o l i l i p o p o l y s a c c h a r i d e e n d o t o x i n B a c i l l u s a n t h r a c i s E s c h e r i c h i a c o l i O 1 5 7 : H 7 S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m V a c c i n i a v i r u s F r a n c i s e l l a t u l a r e n s i s C r y p t o s p o r i d i u m p a r v u m m a t r i c e s i n a p p l e j u i c e g r o u n d b e e f o t h e r f o o d s d r i n k i n g w a t e r s e a w a t e r a n d h u m a n c l i n i c a l s p e c i m e n s ( 2 1 2 2 5 2 ) R e s e a r c h I n t e r n a t i o n a l w a s t h e s o u r c e o f a l l b i o s e n s o r a c c e s s o r i e s i n c l u d i n g c u v e t t e s s o f t w a r e a d a p t o r s a n d w a v e g u i d e s T h e A n a l y t e 2 0 0 0 i s s h o w n i n F i g u r e 2

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2 8 F i g u r e 2 : A n a l y t e 2 0 0 0 A n a l y t e 2 0 0 0 A s s a y T h e A n a l y t e 2 0 0 0 w a s i n i t i a l l y u s e d t o d e t e r m i n e t h e c o n c e n t r a t i o n o f p r e p a r e d F r e u n d ’ s a d j u v a n t o f M t u b e r c u l o s i s t h a t c o u l d b e d e t e c t e d w h e n a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w a s u s e d a s c a p t u r e a n d d e t e c t i o n m o l e c u l e s ( F i g u r e 3 ) W a v e g u i d e s a d s o r b e d w i t h s t r e p t a v i d i n a n d b i o t i n l a b e l e d a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w e r e i n s e r t e d i n t o c u v e t t e s a n d l o c k e d i n t o p l a c e W a v e g u i d e s w e r e r i n s e d w i t h 1 m l P B S T A v o l u m e o f 0 5 m l o f s a m p l e w a s a p p l i e d t o t h e w a v e g u i d e a n d i n c u b a t e d f o r 5 m i n A n o t h e r 0 5 m l v o l u m e o f s a m p l e w a s a p p l i e d t o t h e w a v e g u i d e a n d i n c u b a t e d f o r 5 m o r e m i n T h e w a v e g u i d e w a s t h e n r i n s e d w i t h 1 m l P B S T D e t e c t i o n a n t i b o d y ( C y 5 l a b e l e d a n t i M t u b e r c u l o s i s a t 1 0 g / m l ) a t a v o l u m e o f 0 2 m l w a s t h e n i n c u b a t e d o n e a c h w a v e g u i d e f o r 5 m i n W a v e g u i d e s w e r e r i n s e d t w o t i m e s w i t h P B S T a n d t h e l a s e r w a s a c t i v a t e d

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2 9 T h e s i g n a l w a s r e c o r d e d i n p i c o a m p e r e s ( p A ) R e a d i n g s w e r e t h e n t a k e n a t 1 0 s e c o n d s F o u r b a s e l i n e s w e r e r u n w i t h P B S a n d t h e n s a m p l e s w e r e r u n t h r o u g h t h e A n a l y t e S a m p l e s o f F r e u n d ’ s a d j u v a n t a n d l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s s a m p l e s w e r e r u n t h r o u g h t h e A n a l y t e 2 0 0 0 T h e s e w e r e a l w a y s s e p a r a t e a s s a y s b u t t h e c o n c e n t r a t i o n s f o r F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e w e r e a p p r o x i m a t e l y 1 05, 1 06, 1 07 a n d 1 08 C F U / m l T h e c o n c e n t r a t i o n s f o r l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s w e r e 1 06, 1 07 a n d 1 08 C F U / m l YYYYYYYYYYYY Y YYYY YYYYYYYYYYYY Y YYYY YYYYYYYYYYYY Y YYYY Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y YYYYYYYYYYYY Y YYYY Y Y L a s e r o n ( ( ) )( ( ) )( ( ) )( ( ) ) ( ( ) )( ( ) )( ( ) ) ( ( ) ) ( ( ) ) ( ( ) ) ( ( ) ) ( ( ) )( ( ) )( ( ) ) ( ( ) ) ( ( ) ) ( ( ) ) C a p t u r e a n t i b o d y S a m p l e a p p l i e d a n t i g e n b i n d s t o c a p t u r e a n t i b o d y O t h e r c e l l s a n d d e b r i s w a s h e d a w a y D e t e c t i o n a n t i b o d y b i n d s t o a n t i g e n a n d f l u o r e s c e s w h e n l a s e r t u r n e d o n a n t i g e n F i g u r e 3 : A s s a y f o r m a t u s i n g b i o s e n s o r w a v e g u i d e R A P T O R T h e R A P T O R ( R e s e a r c h I n t e r n a t i o n a l M o n r o e W A ) i s o n e o f t w o b i o s e n s o r s u s e d i n t h i s s t u d y T h i s b i o s e n s o r i s a s m a l l p o r t a b l e a u t o m a t e d f i b e r o p t i c b i o s e n s o r t h a t h a s b e e n u s e d t o r a p i d l y d e t e c t b a c t e r i a A s a n d w i c h i m m u n o a s s a y i s t h e b a s i s f o r t h e b i o s e n s o r ’ s d e t e c t i o n p l a t f o r m T h i s b i o s e n s o r u s e s p o l y s t y r e n e w a v e g u i d e s c o a t e d

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3 0 w i t h s t r e p t a v i d i n ( a p r o t e i n p r o d u c e d b y S t r e p t o m y c e s a v i d i n i i w h i c h h a s f o u r b i n d i n g s i t e s f o r b i o t i n ) A b i o t i n l a b e l e d p o l y c l o n a l c a p t u r e a n t i b o d y i s t h e n i n c u b a t e d o n t h e w a v e g u i d e s T h e s a m p l e o f i n t e r e s t i s a p p l i e d t o t h e w a v e g u i d e s a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e A C y a n i n e 5 ( C y 5 ) l a b e l e d d e t e c t i o n p o l y c l o n a l a n t i b o d y i s t h e n i n c u b a t e d o n t h e w a v e g u i d e T h e R A P T O R i s a n e v a n e s c e n t w a v e f i b e r o p t i c b i o s e n s o r t h a t h a s a l a s e r t h a t e m i t s a 6 3 5 n m b e a m o f l i g h t T h e l a s e r e x c i t e s t h e f l u o r e s c e n t m o l e c u l e c y a n i n e 5 ( C y 5 ) c a u s i n g t h e C y 5 t o e m i t l i g h t a t w a v e l e n g t h s a b o v e 6 7 0 n m T h e e m i t t e d l i g h t i s r e c o r d e d i n p i c o A m p s b y t h e b i o s e n s o r T h e s i g n a l i n c r e a s e s i n p r o p o r t i o n t o t h e a m o u n t o f t a r g e t b a c t e r i a p r e s e n t o n a w a v e g u i d e T h i s b i o s e n s o r h a s b e e n u s e d t o d e t e c t S t a p h y l o c o c c a l e n t e r o t o x i n B r i c i n C l o s t r i d i u m b o t u l i n u m t o x i n A E c o l i l i p o p o l y s a c c h a r i d e e n d o t o x i n B a c i l l u s a n t h r a c i s E s c h e r i c h i a c o l i O 1 5 7 : H 7 S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m V a c c i n i a v i r u s F r a n c i s e l l a t u l a r e n s i s a n d C r y p t o s p o r i d i u m p a r v u m i n c o m p l e x m a t r i c e s i n c l u d i n g a p p l e j u i c e g r o u n d b e e f o t h e r f o o d s d r i n k i n g w a t e r s e a w a t e r a n d h u m a n c l i n i c a l s p e c i m e n s ( 5 2 ) R e s e a r c h I n t e r n a t i o n a l w a s t h e s o u r c e o f a l l b i o s e n s o r a c c e s s o r i e s i n c l u d i n g c u v e t t e s s o f t w a r e a d a p t o r s a n d w a v e g u i d e s T h e R A P T O R i s s h o w n i n F i g u r e 4

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3 1 F i g u r e 4 : R A P T O R R A P T O R A s s a y T h e R A P T O R f i b e r o p t i c b i o s e n s o r i s t h e s i z e o f a c a r b a t t e r y W a v e g u i d e s c o a t e d w i t h a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w e r e i n s e r t e d i n t o a R A P T O R c o u p o n g l u e d a n d t h e c o u p o n w a s s e a l e d w i t h t a p e T h e R A P T O R c o u p o n i s s h o w n i n F i g u r e 5 T h e R A P T O R w a s p r o g r a m m e d t o r u n a u t o m a t i c a l l y u s i n g t h e f o l l o w i n g s a m p l e r e c i p e S a m p l e s p u t i n t o t h e R A P T O R ’ s s a m p l e p o r t w e r e a u t o m a t i c a l l y p u m p e d o v e r t h e w a v e g u i d e s a n d i n c u b a t e d S a m p l e f l u i d w a s a u t o m a t i c a l l y r e f r e s h e d e v e r y 2 5 m i n f o r a t o t a l o f 1 0 m i n o f s a m p l e i n c u b a t i o n S a m p l e s w e r e t h e n a u t o m a t i c a l l y r i n s e d w i t h P B S T C y 5 l a b e l e d p o l y c l o n a l d e t e c t i o n a n t i b o d y a t 2 5 g / m l i n b l o c k i n g b u f f e r w a s t h e n a u t o m a t i c a l l y p u m p e d o v e r t h e w a v e g u i d e s a n d i n c u b a t e d f o r 5 m i n D e t e c t i o n a n t i b o d y w a s t h e n s e n t b a c k t o d e t e c t i o n a n t i b o d y s u p p l y a n d w a v e g u i d e s w e r e t h e n r i n s e d t w o t i m e s w i t h a p p r o x i m a t e l y 1 m l o f P B S T T h e R A P T O R l a s e r w a s t u r n e d o n

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3 2 a n d t h e r e s u l t i n g p A s i g n a l w a s l o g g e d i n t o a d a t a f i l e T h e s a m e a u t o m a t e d a s s a y w a s u s e d t o t e s t b o t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s s u s p e n d e d i n P B S T a n d a s w e l l a s l u n g t i s s u e s e e d e d w i t h M t u b e r c u l o s i s F i v e s a m p l e s c o n t a i n i n g o n l y P B S T w e r e r u n t o c a l c u l a t e t h e L O D F i g u r e 5 : R A P T O R c o u p o n L i v e A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s P r e p a r a t i o n f o r R A P T O R P r e p a r a t i o n w a s t h e s a m e a s A n a l y t e 2 0 0 0 p r o t o c o l s F i v e P B S T b a s e l i n e s s e r v e d a s b l a n k s T h e C y 5 l a b e l e d d e t e c t i o n a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n u s e d w a s 2 5 g / m l L u n g P r e p a r a t i o n A d o n a t e d t u b e r c u l o s i s f r e e h u m a n l u n g w a s o b t a i n e d f r o m T i s s u e T r a n s f o r m a t i o n T e c h n o l o g i e s ( E d i s o n N J ) o f a 5 6 y e a r o l d C a u c a s i a n f e m a l e w i t h a

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3 3 w e i g h t o f 1 3 9 l b s w i t h n o h i s t o r y o f H I V H e p a t i t i s B H e p a t i t i s C r e s p i r a t o r y d i s e a s e n e u r o l o g i c a l p r o b l e m s c a n c e r d i a b e t e s h y p e r t e n s i o n g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t p r o b l e m s k i d n e y d i s e a s e o r d r u g u s e A d d i t i o n a l d o n o r i n f o r m a t i o n i n c l u d e d A+ b l o o d t y p e a n d l i v e r d i s e a s e w i t h c i r r h o s i s T h e l u n g w a s r e m o v e d f r o m a 8 0 C f r e e z e r i n w h i c h i t w a s s t o r e d l e f t o u t a t 2 4 C f o r 1 8 h o u r s a n d t r a n s p o r t e d t o t h e H i l l s b o r o u g h C o u n t y M e d i c a l E x a m i n e r ’ s O f f i c e i n a s t y r o f o a m c o o l e r T h e l u n g w a s s e c t i o n e d u n d e r a s e p t i c c o n d i t i o n s u n d e r t h e s u p e r v i s i o n o f D r J a c q u e l i n e L e e A s s o c i a t e M e d i c a l E x a m i n e r H i l l s b o r o u g h C o u n t y F l o r i d a T h e c u t t i n g b o a r d w a s c o v e r e d w i t h a s t e r i l e h o m i c i d e s h e e t a n d b y a s t e r i l e s u r g i c a l g o w n K n i f e s c a l p e l s a n d s u r r o u n d i n g a r e a w e r e s t e r i l i z e d w i t h 7 5 % i s o p r o p a n o l T h e l u n g w a s s e c t i o n e d w h i l e p l a c e d o n t h e g o w n T h e t h r e e d i f f e r e n t l o b e s o f r i g h t l u n g w e r e s e p a r a t e d i n t o 5 0 m l c o n i c a l t u b e s a n d l a b e l e d t o s i g n i f y u p p e r l o b e m i d d l e l o b e o r l o w e r l o b e A p p r o x i m a t e l y 2 0 g o f t i s s u e w a s p l a c e d i n t o e a c h t u b e T h e s a m p l e s w e r e t r a n s p o r t e d b a c k t o t h e U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a a n d s t o r e d i n t h e 8 0 C f r e e z e r f o r f u t u r e u s e L i v e A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s P r e p a r a t i o n f o r U s e i n S e e d i n g i n t o L u n g T i s s u e f o r U s e i n t h e R A P T O R L i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s f o r u s e i n l u n g t i s s u e R A P T O R a s s a y s w a s p r e p a r e d a s d e s c r i b e d f o r p r e v i o u s p r o c e d u r e s b u t b e f o r e s e e d i n g i n t o l u n g t i s s u e w a s h o m o g e n i z e d i n a g l a s s h o m o g e n i z e r w i t h P B S T f o r a p p r o x i m a t e l y 2 5 m i n u t e s t o b r e a k u p c l u m p i n g t h a t h a d b e e n s h o w n t o c l o g t h e R A P T O R D i r e c t c o u n t s w e r e p e r f o r m e d O n e m l a l i q u o t s w e r e p l a c e d i n t h e 8 0 C f r e e z e r f o r f u t u r e u s e i n a s s a y s

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3 4 R A P T O R A s s a y s w i t h M t u b e r c u l o s i s S e e d e d i n t o L u n g T i s s u e S a m p l e s o f l u n g w e r e d e f r o s t e d a n d c u t i n t o s m a l l e r p i e c e s o f f o u r g r a m s e a c h w i t h s c i s s o r s a n d a l i q u o t e d A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s a t s p e c i f i c c o n c e n t r a t i o n s w e r e a d d e d t o 5 0 m l t i s s u e g r i n d e r s ( F i s h e r H o u s t o n T X ) a l o n g w i t h P B S T a n d l u n g t i s s u e T h e s a m p l e s w e r e g r o u n d f o r t w o m i n u t e s a n d a l l o w e d t o s i t f o r f i v e m i n u t e s P i e c e s o f l u n g t i s s u e w e r e r e m o v e d w i t h f o r c e p s T h e s u s p e n s i o n i n P B S T w a s s e n t t h r o u g h t h e s e n s o r a f t e r b e i n g h o m o g e n i z e d i n a g l a s s h o m o g e n i z e r S p e c i f i c i t y T e s t i n g U s i n g t h e R A P T O R T h e a u t o m a t e d R A P T O R a s s a y p r e v i o u s l y d e s c r i b e d w a s f o l l o w e d W a v e g u i d e p r e p a r a t i o n a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n s a n d b a c t e r i a p r e p a r a t i o n s w e r e t h e s a m e a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d H o w e v e r f o u r P B S T s a m p l e s s e r v i n g a s b a s e l i n e s w e r e u s e d t o c a l c u l a t e t h e L O D B a c t e r i a w e r e d i l u t e d i n P B S o r i n t h e c a s e o f M y c o b a c t e r i u m s p e c i e s w e r e d i l u t e d i n P B S T W h e n b a c t e r i a o t h e r t h a n M t u b e r c u l o s i s w e r e t e s t e d c o n c e n t r a t i o n s o f 1 06, 1 07 a n d 1 08 C F U / m l w e r e u s e d a s s a m p l e s f o l l o w e d b y a s a m p l e o f M t u b e r c u l o s i s a t 1 08 C F U / m l E a c h e x p e r i m e n t c o n s i s t e d o f t h e s e r i a l d i l u t i o n s o f o n l y o n e t y p e o f b a c t e r i a f o l l o w e d b y M t u b e r c u l o s i s a t 1 08 C F U / m l T h e v a r i o u s b a c t e r i a t e s t e d f o r c r o s s r e a c t i v i t y w i t h a n t i b o d y t o M t u b e r c u l o s i s w e r e E c o l i K 1 2 H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s P r o t e u s m i r a b i l i s P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s C a n d i d a a l b i c a n s M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e a n d M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e

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3 5 A n a l y t e 2 0 0 0 a n d R A P T O R C a l c u l a t i o n s T h e p A s i g n a l w a s r e c o r d e d f o r a l l b a s e l i n e s a n d s a m p l e s a t t h e 1 0 s e c o n d r e a d i n g T h e p A v a l u e f o r e a c h r e a d i n g w a s s u b t r a c t e d f r o m t h e s u b s e q u e n t r e a d i n g ; t h e c a l c u l a t e d v a l u e w a s d e s i g n a t e d a s t h e s i g n a l c h a n g e ( p A ) f r o m t h e p r e v i o u s r e a d i n g T h e l i m i t o f d e t e c t i o n ( L O D ) w a s c a l c u l a t e d a s t h e m e a n s i g n a l c h a n g e ( p A ) f r o m t h e p r e v i o u s r e a d i n g f o r b a s e l i n e s ( m e a n b a s e l i n e v a l u e ) p l u s t h r e e t i m e s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n ( S D ) A p o s i t i v e s i g n a l w a s d e s i g n a t e d a s t h e v a l u e o f s i g n a l c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g t h a t i s > L O D C l e a n i n g o f t h e A n a l y t e 2 0 0 0 a n d R A P T O R T h e A n a l y t e 2 0 0 0 w a s d i s a s s e m b l e d a f t e r e a c h a s s a y L y s o l w a s u s e d t o f i r s t s o a k a n d t h e n w a s h t h e t u b i n g a n d c h a m b e r s A f t e r r i n s i n g w i t h d e i o n i z e d w a t e r t h e t u b i n g a n d c h a m b e r s w e r e a l l o w e d t o d r y A t t h e e n d o f a R A P T O R a s s a y t h e c o u p o n u s e d d u r i n g t h e a s s a y t e s t i n g w a s r e m o v e d A c l e a n i n g c o u p o n ( a c o u p o n c o n t a i n i n g c l e a n w a v e g u i d e s w i t h o u t a n y a n t i b o d y o r b a c t e r i a ) w a s i n s e r t e d T h r e e c l e a n i n g c y c l e s w e r e p r o g r a m m e d i n t o t h e R A P T O R F o r c y c l e o n e t h e w a s h c o n t a i n e r h a d L y s o l a d d e d F o r c y c l e s t w o a n d t h r e e d e i o n i z e d w a t e r w a s u s e d f o r r i n s i n g

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3 6 R e s u l t s F r e u n d ’ s A d j u v a n t C o m p l e t e T e s t i n g R a p i d d e t e c t i o n o f M t u b e r c u l o s i s a t a u t o p s y u s i n g l u n g t i s s u e f r o m d e c e d e n t s w o u l d b e a h e l p f u l d i a g n o s t i c t o o l T h e o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y w a s t o d e v e l o p a b i o s e n s o r a s s a y t o d e t e c t M t u b e r c u l o s i s i n d e c e d e n t l u n g t i s s u e I n i t i a l l y t r e a t e d F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e w a s u s e d a s a s u r r o g a t e f o r M t u b e r c u l o s i s s i n c e i t w a s n o n v i a b l e a n d i t s u s e i n v o l v e d m i n i m u m r i s k A n E L I S A w a s p e r f o r m e d u s i n g F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e p o r t i o n o f a d j u v a n t t h a t w a s b o u n d b y t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y ( T a b l e 1 F i g u r e 6 ) W h e n t h e F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e w a s c e n t r i f u g e d t w o l a y e r s f o r m e d : a y e l l o w o i l l a y e r o n t h e t o p a n d a w h i t e p e l l e t a t t h e b o t t o m o f t h e t u b e T h e w h i t e p e l l e t w a s w a s h e d t w i c e w i t h P B S T a n d r e s u s p e n d e d i n 1 m l o f P B S T S e r i a l d i l u t i o n s a d s o r b e d t o w e l l s o f 9 6 w e l l p l a t e s o f t h e o i l l a y e r r e s u s p e n d e d p e l l e t a n d i n t a c t a d j u v a n t w e r e t e s t e d u s i n g E L I S A T h e r e a c t i v i t y o f t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y t o F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e t h e o i l l a y e r o r t o t h e p e l l e t l a y e r w a s d e t e r m i n e d b y c a l c u l a t i n g t h e s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d T h e s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s c a l c u l a t e d b y d i v i d i n g t h e r e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s p r o d u c e d i n e a c h w e l l b y t h e R F U o f P B S t h e n e g a t i v e c o n t r o l ( b a c k g r o u n d ) T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s c a l c u l a t e d f r o m t w o E L I S A s p e r f o r m e d w i t h F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e t o t e s t t h e r e a c t i v i t y w i t h a n t i b o d y t o M t u b e r c u l o s i s A n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n s f o r a l l w e l l s w e r e

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3 7 1 0 g / m l i n P B S S e r i a l d i l u t i o n s w e r e p e r f o r m e d f o r t h e o i l l a y e r p e l l e t a n d F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e f r o m 1 00 t o 1 06. T a b l e 1 : F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e r e a c t i v i t y w i t h M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e c o n c e n t r a t i o n E L I S A r e a d i n g sa ( g / m l ) O i l l a y e r P e l l e t F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e 1 0 0 0 6 8 8 0 4 2 1 0 0 2 6 6 9 3 3 1 0 4 3 3 3 4 2 1 2 2 2 0 1 8 0 1 2 3 1 7 1 9 0 0 1 2 0 0 8 1 3 0 0 0 1 1 7 0 8 1 3 0 1 0 1 0 1 0 a M e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0O i l L a y e r P e l l e t a n d A d j u v a n t C o n c e n t r a t i o n ( g / m l ) S i g n a l O v e r B a c k g r o u n d O i l l a y e r P e l l e t A d j u v a n t F i g u r e 6 : E L I S A r e s u l t s o f a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y r e a c t i v i t y t o F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e

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3 8 T h e r e a c t i v i t y o f a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y t o F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e o i l l a y e r p e l l e t o r i n t a c t a d j u v a n t w a s t e s t e d T h e E L I S A d e m o n s t r a t e d t h a t t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y s h o w e d g r e a t e s t r e a c t i v i t y t o t h e r e s u s p e n d e d p e l l e t T h e a n t i b o d y a l s o b o u n d t o t h e o i l l a y e r a n d b o u n d o n l y s l i g h t l y t o t h e F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e S i n c e t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w a s m o s t r e a c t i v e t o t h e p e l l e t t h e p e l l e t w a s u s e d f o r f u r t h e r b i o s e n s o r t e s t i n g A n a l y t e 2 0 0 0 T e s t i n g w i t h P e l l e t f r o m F r e u n d ’ s A d j u v a n t C o m p l e t e T h e A n a l y t e 2 0 0 0 w a s i n i t i a l l y u s e d f o r b i o s e n s o r d e t e c t i o n o f t h e p e l l e t f r o m F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e S a m p l e s c o n t a i n i n g o n l y P B S w e r e u s e d t o r e c o r d b a s e l i n e s R e p r e s e n t a t i v e c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g w a s c a l c u l a t e d o f d a t a f r o m a n A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y s h o w i n g d e t e c t i o n o f p e l l e t f r o m F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e u s i n g a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y f o r c a p t u r e a n d d e t e c t i o n ( T a b l e 2 ) T a b l e 2 : A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y w i t h F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e A n a l y t e 2 0 0 0 r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 3 0 9 3 7 1 3 0 4 1 5 8 4 7 4 3 B a s e l i n e s B 2 0 5 4 2 4 2 8 0 3 0 3 B 3 1 5 9 2 0 5 1 5 3 1 2 7 B 4 4 6 1 2 8 1 5 2 1 9 2 P e l l e t c o n c e n t r a t i o n ( g / m l ) 0 1 3 2 4c 1 6 8 1 4 8 1 2 6 1 4 6 3 5 1 6 4 1 2 6 0 1 1 0 4 8 5 7 3 0 4 0 2 2 8 9 2 4 8 5 1 0 0 1 6 5 6 1 1 1 3 6 8 7 6 8 2 1 2 3 2 5 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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3 9 B a s e l i n e 2 ( B 2 ) t h r o u g h B a s e l i n e 4 ( B 4 ) c o n s i s t o f t h e c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g o f P B S B i o t i n l a b e l e d c a p t u r e a n t i b o d y w a s u s e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 g / m l C y 5 l a b e l e d d e t e c t i o n a n t i b o d y w a s s u s p e n d e d i n b l o c k i n g b u f f e r a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 g / m l T h e c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g s t h a t a r e p o s i t i v e ( > L O D ) a r e i n b o l d t y p e i n T a b l e 2 C o n c e n t r a t i o n o f p e l l e t w a s b a s e d o n t h e 1 m g / m l c o n c e n t r a t i o n o f M t u b e r c u l o s i s i n F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e O n e o f t h e A n a l y t e 2 0 0 0 b i o s e n s o r f o u r c h a n n e l s w a s p o s i t i v e a t 0 1 g / m l T w o o u t o f f o u r c h a n n e l s w e r e p o s i t i v e a t 1 g / m l A l l c h a n n e l s w e r e p o s i t i v e w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f p e l l e t w a s 1 0 g / m l a n d 1 0 0 g / m l T h e e x a c t c o n c e n t r a t i o n o f c e l l s i n t h e r e s u s p e n d e d p e l l e t c o u l d n o t b e d e t e r m i n e d b y d i r e c t l y c o u n t i n g c e l l s u s i n g a h e m o c y t o m e t e r T h e o i l c a r r i e d o v e r f r o m t h e c o m p l e t e a d j u v a n t i n t e r f e r e d w i t h t h e v i s u a l i z a t i o n o f c e l l s T h e a s s a y w a s r e p e a t e d t w o m o r e t i m e s y i e l d i n g s i m i l a r r e s u l t s T h r e e A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y s w e r e p e r f o r m e d T a b l e 3 s h o w s t h e n u m b e r o f c h a n n e l s t h a t g a v e p o s i t i v e r e s u l t s o f t h e t h r e e A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y s t e s t i n g w i t h M t u b e r c u l o s i s p e l l e t f r o m F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e C o n c e n t r a t i o n i s b a s e d o n t h e 1 m g / m l o f M t u b e r c u l o s i s i n t h e F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e T a b l e 3 : R e s u l t s o f t h r e e A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y s w i t h F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e P e l l e t c o n c e n t r a t i o n N u m b e r o f p o s i t i v e c h a n n e l sa ( g / m l ) A s s a y 1 A s s a y 2 A s s a y 3 0 1 1 / 4 0 / 4 1 / 4 1 2 / 4 2 / 4 2 / 4 1 0 4 / 4 4 / 4 4 / 4 1 0 0 4 / 4 4 / 4 4 / 4 a N u m b e r o f p o s i t i v e c h a n n e l s o u t o f t h e t o t a l p o s s i b l e p o s i t i v e c h a n n e l s i n a n a s s a y

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4 0 A n a l y t e 2 0 0 0 T e s t i n g w i t h L i v e A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s T h e a n t i M t u b e r c u l o s i s w a s c a p a b l e o f c a p t u r i n g a n d d e t e c t i n g t h e k i l l e d M t u b e r c u l o s i s f o u n d i n F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e u s i n g t h e A n a l y t e 2 0 0 0 b i o s e n s o r a s s a y T h e s e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t t h e a n t i b o d y w o u l d a l s o w o r k w e l l i n c a p t u r i n g a n d d e t e c t i n g l i v e M t u b e r c u l o s i s S a m p l e s c o n t a i n i n g s e r i a l d i l u t i o n s o f v i a b l e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s ( A T C C 2 5 1 7 7 ) w e r e t e s t e d u s i n g t h e A n a l y t e 2 0 0 0 b i o s e n s o r T h e p r o t o c o l f o l l o w e d w a s i d e n t i c a l t o t h e A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d I t w a s p o s s i b l e t o d i r e c t l y c o u n t t h e l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s p r i o r t o p e r f o r m i n g t h e a s s a y R e p r e s e n t a t i v e c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g w a s c a l c u l a t e d o f d a t a f r o m a n A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y f o r d e t e c t i o n o f l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s s u s p e n d e d i n P B S T T h e c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g s t h a t a r e p o s i t i v e ( > L O D ) a r e i n b o l d t y p e A s s a y r e s u l t s a r e s h o w n i n T a b l e 4 T a b l e 4 : A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y w i t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s A n a l y t e 2 0 0 0 r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 2 2 5 1 1 1 9 6 5 0 6 1 1 B a s e l i n e s B 2 1 3 4 4 7 9 3 1 1 2 5 4 B 3 9 9 1 7 2 1 5 5 3 1 B 4 4 6 2 0 3 0 6 1 0 9 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 2 0 8 x 1 06 5 0 8c 1 3 4 3 1 5 4 5 1 3 4 8 2 0 8 x 1 07 1 6 6 9 3 1 4 5 1 3 1 4 4 6 8 3 1 0 1 2 0 8 x 1 08 3 2 3 4 0 2 6 1 2 5 2 8 9 3 0 1 4 6 1 7 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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4 1 A l l c h a n n e l s w e r e p o s i t i v e a t 2 0 8 x 1 06, 2 0 8 x 1 07 a n d 2 0 8 x 1 08 C F U / m l T h e a s s a y w a s r e p e a t e d T a b l e 5 s h o w s t h e n u m b e r o f c h a n n e l s t h a t t e s t e d p o s i t i v e i n t h e t w o A n a l y t e 2 0 0 0 b i o s e n s o r a s s a y s f o r t h e d e t e c t i o n o f l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s T a b l e 5 : R e s u l t s o f t w o A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y s w i t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n N u m b e r o f p o s i t i v e c h a n n e l sa ( C F U / m l ) A s s a y 1 A s s a y 2 1 06 4 / 4 3 / 4 1 07 4 / 4 4 / 4 1 08 4 / 4 4 / 4 a N u m b e r o f p o s i t i v e c h a n n e l s o u t o f t h e t o t a l p o s s i b l e p o s i t i v e c h a n n e l s i n a n a s s a y R A P T O R T e s t i n g w i t h L i v e A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s A R A P T O R b i o s e n s o r a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f M t u b e r c u l o s i s w a s d e v e l o p e d s o t h a t a r a p i d a u t o m a t e d u s e r f r i e n d l y a s s a y c o u l d u l t i m a t e l y b e u s e d d u r i n g a u t o p s y P B S T i n s t e a d o f P B S s a m p l e s w e r e u s e d t o t a k e b a s e l i n e r e a d i n g s T h e b i o t i n l a b e l e d M t u b e r c u l o s i s c a p t u r e a n t i b o d y w a s k e p t a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 g / m l I n i n i t i a l R A P T O R a s s a y s c o n c e n t r a t i o n s o f 5 a n d 1 0 g / m l f o r t h e C y 5 l a b e l e d d e t e c t i o n a n t i b o d y a n d 1 0 0 g / m l f o r c a p t u r e a n t i b o d y w e r e t e s t e d T h e s e c o n c e n t r a t i o n s r e s u l t e d i n e x t r e m e l y h i g h L O D s ( d a t a n o t s h o w n ) T a b l e 6 s h o w s a r e p r e s e n t a t i v e a s s a y u s i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f 5 0 g / m l f o r c a p t u r e a n t i b o d y a n d 2 5 g / m l f o r d e t e c t i o n a n t i b o d y F o u r P B S T s a m p l e s s e r v e d t o r e c o r d b a s e l i n e r e a d i n g s T h e R A P T O R w a s p r o g r a m m e d t o r u n a u t o m a t i c a l l y a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d R e p r e s e n t a t i v e c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g w a s c a l c u l a t e d o f d a t a f r o m a R A P T O R a s s a y f o r d e t e c t i o n o f l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s s u s p e n d e d i n P B S T T h e c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g s t h a t a r e p o s i t i v e ( > L O D ) a r e i n b o l d t y p e

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4 2 T a b l e 6 : R A P T O R a s s a y w i t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 2 4 6 3 4 4 7 6 3 2 7 1 3 8 6 0 B a s e l i n e s B 2 1 3 5 3 8 6 2 0 8 1 7 7 B 3 1 7 1 3 3 0 1 2 0 1 6 7 B 4 1 9 8 3 0 9 2 0 8 2 5 1 B 5 1 7 1 3 6 0 2 1 9 7 3 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 2 0 8 x 1 04 2 2 9 4 2 8 2 1 3 2 7 7 2 0 8 x 1 05 4 4 2c 5 5 6 2 5 6 3 1 4 2 0 8 x 1 06 1 1 9 0 1 1 1 8 6 0 9 1 0 9 1 2 0 8 x 1 07 1 8 5 1 2 1 4 2 9 9 9 1 7 7 6 2 0 8 x 1 08 3 0 2 5 2 5 8 5 1 4 6 3 2 4 1 4 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t C h a n n e l s 1 a n d 2 w e r e p o s i t i v e a t 2 0 8 x 1 05 C F U / m l A l l c h a n n e l s w e r e p o s i t i v e a t 2 0 8 x 1 06, 2 0 8 x 1 07 a n d 2 0 8 x 1 08 C F U / m l T h e a s s a y w a s r e p e a t e d e i g h t e e n m o r e t i m e s T a b l e 7 s h o w s t h e n u m b e r o f c h a n n e l s t h a t t e s t e d p o s i t i v e i n t h e s e v e n R A P T O R b i o s e n s o r a s s a y s f o r t h e d e t e c t i o n o f l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s

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4 3 T a b l e 7 : R e s u l t s o f n i n e t e e n R A P T O R a s s a y s w i t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n N u m b e r o f p o s i t i v e c h a n n e l sa ( C F U / m l ) A s s a y 1 A s s a y 2 A s s a y 3 A s s a y 4 1 06 4 / 4 4 / 4 0 / 4 4 / 4 1 07 4 / 4 4 / 4 2 / 4 4 / 4 1 08 4 / 4 4 / 4 4 / 4 4 / 4 A s s a y 5 A s s a y 6 A s s a y 7 A s s a y 8 1 06 4 / 4 0 / 4 3 / 4 2 / 4 1 07 4 / 4 4 / 4 4 / 4 4 / 4 1 08 4 / 4 4 / 4 4 / 4 4 / 4 A s s a y 9 A s s a y 1 0 A s s a y 1 1 A s s a y 1 2 1 06 0 / 4 4 / 4 3 / 4 2 / 4 1 07 4 / 4 4 / 4 2 / 4 2 / 4 1 08 4 / 4 4 / 4 4 / 4 3 / 4 A s s a y 1 3 A s s a y 1 4 A s s a y 1 5 A s s a y 1 6 1 06 4 / 4 4 / 4 4 / 4 4 / 4 1 07 4 / 4 4 / 4 4 / 4 4 / 4 1 08 4 / 4 4 / 4 4 / 4 4 / 4 A s s a y 1 7 A s s a y 1 8 A s s a y 1 9 1 06 4 / 4 4 / 4 3 / 4 1 07 4 / 4 4 / 4 2 / 4 1 08 4 / 4 4 / 4 4 / 4 a N u m b e r o f p o s i t i v e c h a n n e l s o u t o f t h e t o t a l p o s s i b l e p o s i t i v e c h a n n e l s i n a n a s s a y R A P T O R T e s t i n g w i t h L i v e A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s S e e d e d i n t o D e c e d e n t L u n g T i s s u e A b i o s e n s o r a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s i n P B S T s e e d e d i n t o d e c e d e n t l u n g t i s s u e w a s p e r f o r m e d o n t h e R A P T O R T h e g o a l w a s t o d e v e l o p a r a p i d a u t o m a t i c a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f M t u b e r c u l o s i s i n l u n g t i s s u e S a m p l e p r e p a r a t i o n o f l u n g t i s s u e w a s f i r s t d e v e l o p e d V a r i o u s t e c h n i q u e s w e r e t r i e d u s i n g a m o d i f i e d l u n g p r e p a r a t i o n p r o c e d u r e o f t h e H i l l s b o r o u g h C o u n t y M e d i c a l E x a m i n e r ’ s O f f i c e a n d t h e F l o r i d a D e p a r t m e n t o f H e a l t h M y c o b a c t e r i o l o g y L a b o r a t o r y a s a f o u n d a t i o n L i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s a t 1 08 C F U / m l i n P B S T w a s s e r i a l d i l u t e d i n P B S T t o m a k e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f 1 06, 1 07 a n d 1 08 C F U / m l i n s e p a r a t e t i s s u e

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4 4 g r i n d e r s w i t h a f i n a l v o l u m e o f a p p r o x i m a t e l y f o u r m l i n e a c h g r i n d e r A p p r o x i m a t e l y f o u r g r a m s o f l u n g t i s s u e p i e c e s f r o m t h e u p p e r l o b e w e r e a d d e d t o t i s s u e g r i n d e r s M t u b e r c u l o s i s w a s g r o u n d w i t h l u n g p i e c e s i n t h e g r i n d e r s f o r t w o m i n u t e s T h e s a m p l e s w e r e i n c u b a t e d a t 2 5 C f o r a p p r o x i m a t e l y f i v e m i n u t e s U s i n g l o n g f o r c e p s e a c h c l u m p o f t i s s u e w a s r e m o v e d w h i l e b e i n g r i n s e d a n d s h a k e n i n t o t h e l i q u i d T h e r e m a i n i n g l i q u i d w a s t h e n t e s t e d u s i n g t h e R A P T O R T h e c o n c e n t r a t i o n s o f c a p t u r e a n d d e t e c t i o n a n t i b o d i e s w e r e k e p t a t 5 0 g / m l a n d 2 5 g / m l r e s p e c t i v e l y T h e r e s u l t s o f a r e p r e s e n t a t i v e R A P T O R a s s a y a r e s h o w n b e l o w i n T a b l e 8 R e p r e s e n t a t i v e c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g w a s c a l c u l a t e d o f d a t a f r o m a R A P T O R a s s a y f o r d e t e c t i o n o f l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s s u s p e n d e d i n P B S T s e e d e d i n t o d e c e d e n t l u n g t i s s u e T h e c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g s t h a t a r e p o s i t i v e ( > L O D ) a r e i n b o l d t y p e T a b l e 8 : R A P T O R a s s a y w i t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s i n d e c e d e n t l u n g t i s s u e R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 9 8 4 4 1 0 8 7 2 5 6 5 8 5 5 5 7 B a s e l i n e s B 2 7 9 0 9 1 2 4 2 1 3 9 2 B 3 5 9 8 7 8 3 2 3 0 3 6 6 B 4 5 6 7 7 6 7 3 4 3 2 9 8 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 6 x 1 06 1 3 6 7c 1 3 1 8 7 4 0 7 9 0 1 6 x 1 07 2 3 4 9 2 9 8 8 1 3 5 3 1 3 1 0 1 6 x 1 08 2 4 5 9 6 0 9 2 2 1 0 9 1 1 8 6 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t A l l c h a n n e l s w e r e p o s i t i v e a t 1 6 x 1 06, 1 6 x 1 07 a n d 1 6 x 1 08 C F U / m l T h e a s s a y w a s r e p e a t e d s i x m o r e t i m e s T a b l e 9 s h o w s t h e n u m b e r o f c h a n n e l s t h a t t e s t e d

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4 5 p o s i t i v e i n t h e s e v e n R A P T O R b i o s e n s o r a s s a y s f o r t h e d e t e c t i o n o f l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s s e e d e d i n t o d e c e d e n t l u n g t i s s u e T a b l e 9 : R e s u l t s o f s e v e n R A P T O R a s s a y s w i t h l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s i n d e c e d e n t l u n g t i s s u e M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n N u m b e r o f p o s i t i v e c h a n n e l sa ( C F U / m l ) A s s a y 1 A s s a y 2 A s s a y 3 A s s a y 4 1 06 4 / 4 0 / 4 0 / 4 0 / 4 1 07 4 / 4 3 / 4 3 / 4 4 / 4 1 08 4 / 4 4 / 4 4 / 4 4 / 4 A s s a y 5 A s s a y 6 A s s a y 7 1 06 2 / 4 0 / 4 0 / 4 1 07 4 / 4 3 / 4 3 / 4 1 08 4 / 4 4 / 4 4 / 4 a N u m b e r o f p o s i t i v e c h a n n e l s o u t o f t h e t o t a l p o s s i b l e p o s i t i v e c h a n n e l s i n a n a s s a y B a s e d o n t h e s e s e v e n a s s a y s t h e M t u b e r c u l o s i s R A P T O R a s s a y c o u l d d e t e c t M t u b e r c u l o s i s w h e n i t w a s p r e s e n t i n l u n g t i s s u e W h e n t h e b a c t e r i a w e r e p r e s e n t a t 1 06 C F U / g t h e R A P T O R a s s a y r e s u l t e d i n p o s i t i v e s i g n a l s 2 1 % o f t h e t i m e W h e n M t u b e r c u l o s i s w a s a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 07 C F U / g t h e R A P T O R a s s a y d e t e c t e d M t u b e r c u l o s i s i n 8 6 % o f t h e c h a n n e l s a n d w h e n p r e s e n t a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 08 C F U / g M t u b e r c u l o s i s w a s d e t e c t e d i n 1 0 0 % o f c h a n n e l s E L I S A T e s t i n g w i t h M t u b e r c u l o s i s A n t i b o d y E L I S A s w e r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y ’ s r e a c t i v i t y t o b a c t e r i a o t h e r t h a n M t u b e r c u l o s i s I n p r e p a r a t i o n f o r s p e c i f i c i t y s t u d i e s a d i r e c t E L I S A u s i n g d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w a s r u n u s i n g a s i n g l e c o n c e n t r a t i o n f o r M t u b e r c u l o s i s T r i p l i c a t e s w e r e r u n a t e a c h a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n M t u b e r c u l o s i s a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 2 x 1 08 C F U / m l w a s a d s o r b e d t o a l l w e l l s o f t h e E L I S A p l a t e A n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w a s d i l u t e d i n 1 : 2 d i l u t i o n s u s i n g b l o c k i n g

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4 6 b u f f e r N e g a t i v e c o n t r o l ( b a c k g r o u n d ) w e l l s c o n t a i n i n g o n l y b l o c k i n g b u f f e r w e r e a l s o t e s t e d T h e r e s u l t s a r e s h o w n i n T a b l e 1 0 a n d F i g u r e 7 T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s c a l c u l a t e d f o r s e r i a l d i l u t i o n s o f M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y b i n d i n g t o l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s a t 1 2 x 1 08 C F U / m l T a b l e 1 0 : M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y r e a c t i v i t y w i t h M t u b e r c u l o s i s M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n E L I S A r e a d i n g sa ( g / m l ) 1 / 1 0 0 1 2 5 7 1 / 2 0 0 1 2 6 8 1 / 4 0 0 1 2 6 8 1 / 8 0 0 1 1 6 4 1 / 1 6 0 0 1 0 5 1 1 / 3 2 0 0 8 4 1 / 6 4 0 0 5 4 8 a M e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 0 0 0 0 5 0 0 0 2 5 0 0 1 2 5 0 6 2 5 3 1 2 1 5 0 0 0 0A n t i M t u b e r c u l o s i s A n t i b o d y C o n c e n t r a t i o n ( g / m l ) S i g n a l O v e r B a c k g r o u n d F i g u r e 7 : E L I S A r e s u l t s o f a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y r e a c t i v i t y t o M t u b e r c u l o s i s

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4 7 T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s c a l c u l a t e d f o r s e r i a l d i l u t i o n s o f a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y b i n d i n g t o v i a b l e M t u b e r c u l o s i s a d s o r b e d t o w e l l s a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 2 x 1 08 C F U / m l E r r o r b a r s r e p r e s e n t o n e s t a n d a r d d e v i a t i o n f r o m t r i p l i c a t e r e a d i n g s T h e E L I S A s h o w e d a s i g n a l t o b a c k g r o u n d v a l u e o f > 1 2 w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w a s 2 5 1 0 0 g / m l B a s e d o n t h e s e r e s u l t s t h e 2 5 g / m l a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n w a s u s e d i n E L I S A t o d e t e c t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f M t u b e r c u l o s i s T h e r e s u l t s a r e s h o w n i n T a b l e 1 1 a n d F i g u r e 8 T r i p l i c a t e s w e r e r u n a t e a c h c o n c e n t r a t i o n o f M t u b e r c u l o s i s T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s c a l c u l a t e d f o r t h e r e a c t i v i t y o f M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y t o v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s T a b l e 1 1 : A n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y r e a c t i v i t y a t v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f M t u b e r c u l o s i s M t u b e r c u l o s i s C o n c e n t r a t i o n E L I S A r e a d i n g sa ( C F U / m l ) 0 1 1 2 x 1 02 1 0 4 1 2 x 1 03 1 5 5 1 2 x 1 04 2 1 7 1 2 x 1 05 5 0 2 1 2 x 1 06 8 1 2 x 1 07 9 2 6 1 2 x 1 08 1 0 0 5 a M e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d

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4 8 0 2 4 6 8 1 0 1 2 0 2 3 4 5 6 7 8 M t u b e r c u l o s i s A T C C 2 5 1 7 7 ( L o g C F U / m l o r 0 f o r n o c e l l s ) S i g n a l O v e r B a c k g r o u n d F i g u r e 8 : E L I S A r e s u l t s o f a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y r e a c t i v i t y a t v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f M t u b e r c u l o s i s T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s c a l c u l a t e d f o r t h e d e t e c t i o n o f M t u b e r c u l o s i s a t v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s E r r o r b a r s r e p r e s e n t o n e s t a n d a r d d e v i a t i o n f r o m t r i p l i c a t e r e a d i n g s M e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d v a l u e s w e r e h i g h e r t h a n 2 0 w h e n t h e M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n w a s a t o r h i g h e r t h a n 1 04 C F U / m l S i g n a l o v e r b a c k g r o u n d v a l u e s w e r e g r e a t e r t h a n 8 0 w h e n t h e M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n w a s a t o r h i g h e r t h a n 1 06 C F U / m l T h e s a m e d i r e c t E L I S A f o r m a t w a s u s e d t o t e s t f o r c r o s s r e a c t i v i t y o f t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y t o d i f f e r e n t m i c r o o r g a n i s m s T h e s p e c i e s t e s t e d w e r e E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s

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4 9 P r o t e u s m i r a b i l i s P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s C a n d i d a a l b i c a n s M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e a n d M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e T h e s e v a r i o u s m i c r o o r g a n i s m s w e r e t e s t e d a s t h e y c a n b e p r e s e n t d u r i n g a M t u b e r c u l o s i s i n f e c t i o n o r m i m i c m y c o b a c t e r i a l i n f e c t i o n o f t h e l u n g s E L I S A s w e r e p e r f o r m e d u s i n g 9 6 w e l l p l a t e s C r o s s r e a c t i v i t y t o a l l b a c t e r i a w a s t e s t e d i n t r i p l i c a t e w e l l s p e r s e r i a l d i l u t i o n M t u b e r c u l o s i s A T C C 2 5 1 7 7 w a s i n c l u d e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l f o r e v e r y p l a t e t e s t e d T h e r e f o r e o n l y n i n e c o l u m n s p e r p l a t e w e r e a v a i l a b l e f o r t e s t i n g o t h e r b a c t e r i a S e v e r a l p l a t e s w e r e u s e d i n E L I S A s s o t h a t a l l o r g a n i s m s p r e v i o u s l y l i s t e d c o u l d b e t e s t e d B a c t e r i a w e r e d i r e c t l y a d s o r b e d t o w e l l s o f E L I S A p l a t e s a n d t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w a s u s e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 2 5 g / m l a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d R e s u l t s a r e s h o w n i n F i g u r e s 9 t h r o u g h 1 3

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5 0 F i g u r e 9 : E L I S A r e s u l t s o f t h e r e a c t i v i t y o f M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w i t h a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e a n d S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e T h e l o g C F U / m l i s s h o w n f o r t h e c e l l c o n c e n t r a t i o n H o w e v e r t h e C F U / m l w a s s l i g h t l y d i f f e r e n t f o r e a c h b a c t e r i u m T h e a c t u a l c o n c e n t r a t i o n ( i n C F U / m l ) i s s h o w n i n t h e l e g e n d f o r e a c h b a c t e r i u m M t u b e r c u l o s i s m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s g r e a t e r t h a n 2 0 w h e n c e l l c o n c e n t r a t i o n w a s 1 04 a n d g r e a t e r C F U / m l T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s g r e a t e r t h a n 6 0 w h e n c e l l c o n c e n t r a t i o n w a s 1 06, 1 07 a n d 1 08 C F U / m l T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d v a l u e r e m a i n e d b e l o w 2 0 w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 c e l l s b e i n g t e s t e d w a s b e l o w 1 06 C F U / m l T h e m e a n s i g n a l o v e r A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s 1 2 x 1 08 C F U / m l E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 2 0 x 1 08 C F U / m l H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e 2 4 x 1 08 C F U / m l S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e 2 0 x 1 08 C F U / m l

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5 1 b a c k g r o u n d n e v e r i n c r e a s e d a b o v e 6 0 e v e n w h e n h i g h c o n c e n t r a t i o n s ( 1 07 1 08 C F U / m l ) o f c e l l s w e r e t e s t e d T h i s w a s a l s o t r u e f o r H i n f l u e n z a e a n d S a g a l a c t i a e 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 2 3 4 5 6 7 8 C o n c e n t r a t i o n o f C e l l s ( L o g C F U / m l ) S i g n a l O v e r B a c k g r o u n d A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s 1 2 x 1 0 C F U / m l K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s 1 2 x 1 08 C F U / m l K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e 2 4 x 1 08 C F U / m l S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e 1 6 x 1 0 8 C F U / m l S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s 2 4 x 1 08 C F U / m l F i g u r e 1 0 : E L I S A r e s u l t s o f t h e r e a c t i v i t y o f M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w i t h a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e a n d S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s T h e l o g C F U / m l i s s h o w n f o r t h e c e l l c o n c e n t r a t i o n H o w e v e r t h e C F U / m l w a s s l i g h t l y d i f f e r e n t f o r e a c h b a c t e r i u m T h e a c t u a l c o n c e n t r a t i o n ( i n C F U / m l ) i s s h o w n i n t h e l e g e n d f o r e a c h b a c t e r i u m M t u b e r c u l o s i s m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s g r e a t e r t h a n 2 0 w h e n c e l l c o n c e n t r a t i o n w a s 1 02, 1 04, 1 05, 1 06, 1 07 a n d 1 08 C F U / m l T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s g r e a t e r t h a n 6 0 w h e n c e l l c o n c e n t r a t i o n w a s 1 06, 1 07 a n d 1 08 C F U / m l T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d v a l u e r e m a i n e d b e l o w 2 0 w h e n t h e

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5 2 c o n c e n t r a t i o n o f K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e c e l l s t e s t e d w a s b e l o w 1 07 C F U / m l T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d v a l u e r e m a i n e d b e l o w 6 0 w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e c e l l s t e s t e d w a s b e l o w 1 07 C F U / m l T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d v a l u e r e m a i n e d b e l o w 4 0 w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s c e l l s t e s t e d w a s b e l o w 1 06 C F U / m l 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 2 3 4 5 6 7 8 C o n c e n t r a t i o n o f C e l l s ( L o g C F U / m l ) S i g n a l O v e r B a c k g r o u n d A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s P r o t e u s m i r a b i l i s P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s 1 2 x 1 0 8 C F U / m l M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s 2 0 x 1 08 C F U / m l P r o t e u s M i r a b i l i s 2 1 x 1 08 C F U / m l P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a 2 1 x 1 0 8 C F U / m l F i g u r e 1 1 : E L I S A r e s u l t s o f t h e r e a c t i v i t y o f M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w i t h a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s P r o t e u s m i r a b i l i s a n d P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a T h e l o g C F U / m l i s s h o w n f o r t h e c e l l c o n c e n t r a t i o n H o w e v e r t h e C F U / m l w a s s l i g h t l y d i f f e r e n t f o r e a c h b a c t e r i u m T h e a c t u a l c o n c e n t r a t i o n ( i n C F U / m l ) i s s h o w n i n t h e l e g e n d f o r e a c h b a c t e r i u m M t u b e r c u l o s i s m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s g r e a t e r

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5 3 t h a n 2 0 w h e n c e l l c o n c e n t r a t i o n w a s 1 03 a n d g r e a t e r C F U / m l T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d v a l u e r e m a i n e d b e l o w 2 0 f o r a l l c o n c e n t r a t i o n s o f M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d n e v e r i n c r e a s e d a b o v e 6 0 e v e n w h e n h i g h c o n c e n t r a t i o n s ( 1 07 1 08 C F U / m l ) o f c e l l s w e r e t e s t e d o f P r o t e u s m i r a b i l i s T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d v a l u e w a s g r e a t e r t h a n 6 0 w h e n c e l l c o n c e n t r a t i o n w a s 1 07 a n d 1 08 C F U / m l f o r P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 3 4 5 6 7 8 C o n c e n t r a t i o n o f C e l l s ( L o g C F U / m l ) S i g n a l O v e r B a c k g r o u n d A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s C a n d i d a a l b i c a n s M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s 1 2 x 1 08 C F U / m l M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s 1 2 x 1 0 8 C F U / m l C a n d i d a a l b i c a n s 1 2 x 1 08 C F U / m l M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e 2 0 x 1 08 C F U / m l F i g u r e 1 2 : E L I S A r e s u l t s o f t h e r e a c t i v i t y o f M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w i t h a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s C a n d i d a a l b i c a n s a n d M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e T h e l o g C F U / m l i s s h o w n f o r t h e c e l l c o n c e n t r a t i o n H o w e v e r t h e C F U / m l w a s s l i g h t l y d i f f e r e n t f o r e a c h m i c r o o r g a n i s m T h e a c t u a l c o n c e n t r a t i o n ( i n C F U / m l ) i s

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5 4 s h o w n i n t h e l e g e n d f o r e a c h m i c r o b e M t u b e r c u l o s i s m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s g r e a t e r t h a n 2 0 w h e n c e l l c o n c e n t r a t i o n w a s 1 05 C F U / m l o r h i g h e r T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s g r e a t e r t h a n 6 0 w h e n c e l l c o n c e n t r a t i o n w a s 1 07 C F U / m l o r h i g h e r T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d v a l u e r e m a i n e d b e l o w 2 0 w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s c e l l s t e s t e d w a s l e s s t h a n 1 07 C F U / m l T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d n e v e r i n c r e a s e d a b o v e 6 0 e v e n w h e n h i g h c o n c e n t r a t i o n s ( 1 07 1 08 C F U / m l ) o f C a n d i d a a l b i c a n s w e r e t e s t e d T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d v a l u e r e m a i n e d b e l o w 4 0 w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e t e s t e d w a s b e l o w 1 07 C F U / m l 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 3 4 5 6 7 8 C o n c e n t r a t i o n o f C e l l s ( L o g C F U / m l )S i g n a l O v e r B a c k g r o u n d A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e 1 2 x 1 08 C F U / m l A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s 1 2 x 1 08 C F U / m l F i g u r e 1 3 : E L I S A r e s u l t s o f t h e r e a c t i v i t y o f M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y w i t h a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s a n d M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e

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5 5 T h e l o g C F U / m l i s s h o w n f o r t h e c e l l c o n c e n t r a t i o n T h e a c t u a l c o n c e n t r a t i o n ( i n C F U / m l ) i s s h o w n i n t h e l e g e n d f o r e a c h b a c t e r i u m M t u b e r c u l o s i s m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d w a s g r e a t e r t h a n 2 0 w h e n c e l l c o n c e n t r a t i o n w a s 1 05 C F U / m l o r h i g h e r T h e m e a n s i g n a l o v e r b a c k g r o u n d n e v e r i n c r e a s e d a b o v e 6 0 e v e n w h e n h i g h c o n c e n t r a t i o n s ( 1 07 – 1 08 C F U / m l ) o f M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e w e r e t e s t e d B a s e d o n t h e c r o s s r e a c t i v i t y o f t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y t o t h e s e o r g a n i s m s c r o s s r e a c t i v i t y s t u d i e s i n t h e R A P T O R w e r e p e r f o r m e d M t u b e r c u l o s i s A n t i b o d y S p e c i f i c i t y S t u d i e s U s i n g t h e R A P T O R R A P T O R a s s a y s p e c i f i c i t y s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y a s t h e c a p t u r e a n d d e t e c t i o n m o l e c u l e a t 5 0 g / m l a n d a t 2 5 g / m l r e s p e c t i v e l y a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d E a c h e x p e r i m e n t c o n s i s t e d o f f i r s t t e s t i n g s e r i a l d i l u t i o n s c o n t a i n i n g a s p e c i f i c b a c t e r i u m o t h e r t h a n M t u b e r c u l o s i s I n o r d e r t o v e r i f y t h a t t h e R A P T O R a s s a y w a s o p e r a t i n g c o r r e c t l y a f t e r a l l d i l u t i o n s o f t h e b a c t e r i u m w e r e a s s a y e d a h i g h c o n c e n t r a t i o n ( 1 08 C F U / m l ) o f M t u b e r c u l o s i s A T C C 2 5 1 7 7 w a s t h e n a s s a y e d u s i n g t h e s a m e c o u p o n T h e M t u b e r c u l o s i s a s s a y r e s u l t e d i n a h i g h i n c r e a s e i n t h e c h a n g e f r o m p r e v i o u s s i g n a l T h e r e s u l t s a r e s h o w n i n T a b l e s 1 2 a t h r o u g h 1 2 m a n d T a b l e 1 3 I n T a b l e s 1 2 a t h r o u g h 1 2 m t h e c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g s t h a t a r e p o s i t i v e ( > L O D ) a r e i n b o l d t y p e

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5 6 T a b l e 1 2 a : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 1 4 2 5 7 5 5 4 8 1 1 0 4 3 B a s e l i n e s B 2 7 9 6 4 4 8 3 6 9 6 1 6 B 3 3 7 4 5 9 8 2 6 1 1 9 4 B 4 8 2 7 4 5 3 3 2 3 2 4 5 S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 2 4 x 1 06 3 1 1 2 9 1 9 2 2 3 0 2 4 x 1 07 6 6 0 5 1 5 1 7 7 2 3 5 2 4 x 1 08 5 4 5 5 7 7 4 3 2 2 4 0 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 1 6 7 4c 2 2 7 7 1 6 9 8 2 0 4 8 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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5 7 T a b l e 1 2 b : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 6 2 0 1 0 4 4 1 0 8 0 8 8 4 B a s e l i n e s B 2 4 9 4 6 1 8 6 5 1 3 7 0 B 3 3 6 4 4 9 0 3 2 3 1 6 3 B 4 4 0 0 2 2 6 2 1 3 5 1 7 S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 6 x 1 06 2 4 5 3 8 1 3 6 5 2 8 8 1 6 x 1 07 5 0 9 2 9 9 1 2 5 5 0 7 1 6 x 1 08 4 2 1 2 8 8 2 3 9 2 6 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 2 5 2 1c 2 6 9 4 1 6 6 6 1 7 6 6 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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5 8 T a b l e 1 2 c : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 6 1 8 1 0 9 5 1 0 2 1 1 0 3 1 B a s e l i n e s B 2 2 2 4 7 5 0 6 8 2 2 6 1 B 3 4 1 6 9 1 0 3 3 8 6 4 8 B 4 3 4 3 7 2 7 4 1 1 3 3 4 E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 2 0 x 1 06 1 2 4 4 6 3 2 6 6 3 7 1 2 0 x 1 07 2 8 6 6 3 9 2 2 9 4 2 8 2 0 x 1 08 1 4 1 6 1 3 3 3 8 3 0 3 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 1 9 3 8c 2 5 5 9 2 2 3 4 2 4 5 0 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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5 9 T a b l e 1 2 d : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 7 7 5 1 1 5 7 6 6 3 4 9 2 B a s e l i n e s B 2 6 4 4 7 4 7 4 3 2 4 6 4 B 3 5 8 3 3 3 0 2 2 9 4 5 0 B 4 5 1 4 4 2 2 3 8 0 4 7 0 H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 2 4 x 1 06 3 2 3 1 9 0 5 4 7 2 1 4 2 4 x 1 07 8 3 3 8 6 3 1 3 4 0 2 4 x 1 08 4 9 4 1 0 9 4 9 4 3 7 6 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 2 5 3 6c 2 6 1 6 1 8 2 7 2 2 2 5 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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6 0 T a b l e 1 2 e : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 6 7 2 6 6 8 9 0 3 5 1 2 B a s e l i n e s B 2 4 3 7 5 5 1 3 4 9 3 5 5 B 3 5 3 0 5 4 1 4 8 4 4 2 8 B 4 3 8 4 4 5 9 9 4 3 4 5 K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 2 4 x 1 06 3 6 4 3 0 8 5 2 5 2 5 1 2 4 x 1 07 4 6 8 4 1 3 2 4 0 1 5 6 2 4 x 1 08 2 3 9 3 9 1 3 5 9 2 9 3 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 1 9 9 6c 2 8 2 2 2 0 6 7 2 1 2 1 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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6 1 T a b l e 1 2 f : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 4 5 8 5 6 9 4 0 0 3 7 0 B a s e l i n e s B 2 3 3 3 3 0 0 2 0 0 2 8 7 B 3 3 2 2 2 4 6 1 8 3 3 2 9 B 4 3 9 0 4 1 0 2 9 1 3 0 5 S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 2 0 x 1 06 1 2 0 2 0 2 2 3 4 2 5 0 2 0 x 1 07 1 4 5 2 2 8 2 4 2 2 2 7 2 0 x 1 08 9 4 1 6 0 1 9 6 2 0 0 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 1 3 7 2c 2 5 0 1 1 5 9 0 2 0 0 2 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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6 2 T a b l e 1 2 g : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 8 1 1 6 0 2 6 2 5 3 8 1 B a s e l i n e s B 2 5 3 1 2 1 1 3 9 5 2 9 8 B 3 2 4 4 3 6 6 1 6 2 2 3 0 B 4 3 1 7 3 8 1 2 0 8 2 1 4 P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 2 4 x 1 06 4 1 1 1 1 3 2 0 3 2 6 1 2 4 x 1 07 3 0 7 3 5 0 2 3 4 1 2 0 2 4 x 1 08 5 1 9 1 9 6 1 7 2 3 7 6 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 1 8 8 7c 1 7 3 0 1 5 4 1 1 4 5 8 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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6 3 T a b l e 1 2 h : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o C a n d i d a a l b i c a n s R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 7 8 7 1 1 7 0 1 1 1 5 6 0 1 B a s e l i n e s B 2 6 8 1 9 8 4 5 6 8 5 0 0 B 3 7 2 2 8 6 0 6 2 4 4 5 2 B 4 6 5 5 7 9 3 2 2 9 4 0 0 C a n d i d a a l b i c a n s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 06 2 7 1 5 6 1 3 1 3 3 6 5 1 2 x 1 07 5 0 4 5 8 7 3 6 4 4 4 3 1 2 x 1 08 1 7 7 3 4 6 1 7 7 4 2 0 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 2 5 5 7c 2 9 7 6 2 1 5 0 2 0 0 0 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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6 4 T a b l e 1 2 i : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 8 1 8 9 4 1 6 1 2 6 2 0 B a s e l i n e s B 2 6 2 3 6 7 0 3 8 5 3 2 9 B 3 6 5 5 7 9 3 4 1 7 4 7 5 B 4 5 1 5 6 4 4 5 0 0 3 5 5 M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 2 0 x 1 06 5 5 1 5 6 6 4 6 2 4 1 2 0 x 1 07 4 1 6 6 1 8 3 9 1 2 8 2 2 0 x 1 08 6 0 3 6 4 4 3 0 2 2 5 6 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 2 0 0 0c 1 9 5 3 2 3 3 7 1 6 8 1 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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6 5 T a b l e 1 2 j : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o P r o t e u s m i r a b i l i s R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 7 5 1 9 9 4 1 1 4 2 1 1 0 1 B a s e l i n e s B 2 5 0 0 6 0 2 2 0 0 6 3 7 B 3 3 7 8 6 5 0 5 4 3 5 7 0 B 4 2 5 0 8 0 0 6 3 2 2 5 4 P r o t e u s m i r a b i l i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 2 1 x 1 06 4 5 0 5 6 4 2 2 0 3 0 2 2 1 x 1 07 3 4 8 6 3 3 1 7 7 4 0 3 2 1 x 1 08 5 2 0 8 1 4 2 4 5 1 8 2 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 2 9 6 3c 4 3 0 1 3 1 2 4 2 2 8 8 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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6 6 T a b l e 1 2 k : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 1 2 9 1 7 6 9 1 0 3 9 8 2 9 B a s e l i n e s B 2 8 1 6 6 5 4 6 4 6 4 6 0 B 3 8 0 0 5 3 6 5 3 1 8 4 B 4 4 6 3 5 7 1 2 8 6 2 4 5 M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 06 5 1 0 2 4 2 4 0 1 3 6 6 1 2 x 1 07 4 5 7 3 9 2 2 7 1 3 1 8 1 2 x 1 08 3 8 5 6 2 8 3 0 1 6 3 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 1 7 8 8c 1 7 9 2 1 8 1 7 1 3 6 8 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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6 7 T a b l e 1 2 l : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 1 0 3 6 1 4 1 5 9 0 3 9 3 0 B a s e l i n e s B 2 7 4 9 1 0 5 6 6 8 7 3 7 6 B 3 6 7 0 6 9 5 5 0 0 2 9 7 B 4 4 8 9 7 5 7 4 7 3 6 1 7 M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 2 0 x 1 06 5 2 5 8 4 0 3 2 3 3 3 4 2 0 x 1 07 8 3 2 5 9 2 4 2 2 3 9 7 2 0 x 1 08 5 5 1 6 7 5 4 8 4 4 7 0 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 2 2 3 5c 3 1 7 7 2 2 9 6 1 6 9 3 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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6 8 T a b l e 1 2 m : R A P T O R a s s a y t o t e s t a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i v i t y t o M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e R A P T O R r e a d i n g sa C h a n n e l s 1 2 3 4 L O Db 9 4 7 1 1 8 9 5 3 7 5 5 1 B a s e l i n e s B 2 5 8 8 7 5 7 3 8 0 4 8 6 B 3 6 1 3 5 3 6 2 1 9 4 4 9 B 4 3 5 4 8 4 4 2 7 6 4 9 6 M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 06 3 8 9 3 3 0 4 7 2 2 5 1 2 x 1 07 4 5 2 4 5 3 2 4 4 3 6 0 1 2 x 1 08 4 2 7 4 0 7 1 7 7 3 0 4 M t u b e r c u l o s i s c o n c e n t r a t i o n ( C F U / m l ) 1 2 x 1 08 1 4 8 1c 1 9 6 2 1 3 3 8 1 3 8 4 a C a l c u l a t e d c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g ( p A ) b L i m i t o f d e t e c t i o n c B o l d f a c e d n u m b e r s i n d i c a t e p o s i t i v e r e s u l t

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6 9 T a b l e 1 3 : S u m m a r y o f c r o s s r e a c t i v i t y s t u d i e s u s i n g R A P T O R B a c t e r i u m a s s a y e d C o n c e n t r a t i o n s t e s t e d ( C F U / m l ) N u m b e r o f p o s i t i v e c h a n n e l s T o t a l c h a n n e l s t e s t e d S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s 2 4 x 1 06 0 4 2 4 x 1 07 0 4 2 4 x 1 08 0 4 S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e 1 6 x 1 06 0 4 1 6 x 1 07 0 4 1 6 x 1 08 0 4 E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 2 0 x 1 06 0 4 2 0 x 1 07 0 4 2 0 x 1 08 0 4 H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e 2 4 x 1 06 0 4 2 4 x 1 07 0 4 2 4 x 1 08 0 4 K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e 2 4 x 1 06 0 4 2 4 x 1 07 0 4 2 4 x 1 08 0 4 S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e 2 0 x 1 06 0 4 2 0 x 1 07 0 4 2 0 x 1 08 0 4 P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a 2 4 x 1 06 0 4 2 4 x 1 07 0 4 2 4 x 1 08 0 4 C a n d i d a a l b i c a n s 1 2 x 1 06 0 4 1 2 x 1 07 0 4 1 2 x 1 08 0 4 M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s 2 0 x 1 06 0 4 2 0 x 1 07 0 4 2 0 x 1 08 0 4 P r o t e u s m i r a b i l i s 2 1 x 1 06 0 4 2 1 x 1 07 0 4 2 1 x 1 08 0 4 M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s 1 2 x 1 06 0 4 1 2 x 1 07 0 4 1 2 x 1 08 0 4 M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e 2 0 x 1 06 0 4 2 0 x 1 07 0 4 2 0 x 1 08 0 4 M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e 1 2 x 1 06 0 4 1 2 x 1 07 0 4 1 2 x 1 08 0 4 V a l i d i t y o f e a c h e x p e r i m e n t w a s c o n f i r m e d b y o b t a i n i n g a p o s i t i v e v a l u e f o r c h a n g e f r o m p r e v i o u s r e a d i n g a f t e r M t u b e r c u l o s i s s a m p l e a t ~ 1 08 C F U / m l w a s t e s t e d a t

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7 0 t h e e n d o f e a c h e x p e r i m e n t T h e r e w a s n o p o s i t i v e d e t e c t i o n o b s e r v e d w h e n m i c r o o r g a n i s m s o t h e r t h a n M t u b e r c u l o s i s w e r e t e s t e d u s i n g t h e M t u b e r c u l o s i s R A P T O R a s s a y W e s t e r n B l o t A n t i b o d y S t u d y W e s t e r n b l o t s w e r e u s e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t e d w i t h a n y p r o t e i n s a n d o t h e r m o l e c u l e s f o u n d i n w h o l e c e l l s o f t h e b a c t e r i a s t u d i e d i n R A P T O R a s s a y s A l l b a c t e r i a c o n c e n t r a t i o n s w e r e a d j u s t e d t o 1 2 x 1 08 C F U / m l b y d i l u t i n g c e l l s i n P B S ( o r i n P B S T f o r M y c o b a c t e r i u m s p e c i e s ) C e l l s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d u s i n g S D S P A G E t h e n t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s A f t e r b l o c k i n g t h e m e m b r a n e s w e r e p r o b e d w i t h a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y a t 2 5 g / m l S e c o n d a r y a n t i b o d y a n t i r a b b i t I g G c o n j u g a t e d t o a l k a l i n e p h o s p h a t a s e w a s u s e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 0 5 g / m l O n l y M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s s h o w e d c r o s s r e a c t i v e p r o t e i n s i n W e s t e r n b l o t s R e s u l t s a r e s h o w n i n F i g u r e 1 4 M o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s a r e v i s i b l e i n F i g u r e 1 4 L a n e 1 c o n t a i n s M t u b e r c u l o s i s c e l l s a n d L a n e 2 c o n t a i n s M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s c e l l s T h e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s a n d M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s b o t h h a d b a n d s a t 1 9 m m a n d 2 8 m m B a n d 1 i n t h e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s a n d M s m e g m a t i s l a n e s a p p e a r s t o b e 2 4 k D a a n d f a i n t B a n d 2 h e l d i n c o m m o n b y b o t h b a c t e r i a a p p e a r s t o b e 4 5 k D a B o t h b a c t e r i a h a d t w o b a n d s i n c o m m o n O t h e r c e l l s t h a t w e r e t e s t e d w e r e : a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s P r o t e u s m i r a b i l i s P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s C a n d i d a a l b i c a n s M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e a n d M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e

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7 1 F i g u r e 1 4 : W e s t e r n b l o t s h o w i n g a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y c r o s s r e a c t i o n w i t h M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s p r o t e i n s T h e s a n d w i c h i m m u n o a s s a y s d e v e l o p e d f o r u s e i n b o t h t h e A n a l y t e 2 0 0 0 a n d t h e R A P T O R a r e r a p i d a n d v e r y s p e c i f i c N o c r o s s r e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d w i t h t h e m i c r o o r g a n i s m s o f C a n d i d a a l b i c a n s E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e 1 2 2 2 0 5 1 1 6 6 6 4 5 2 9 2 0 1 4 2 K D a

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7 2 M y c o b a c t e r i u m r h o d o c h r o u s M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s P r o t e u s m i r a b i l i s P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e a n d S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e w i t h t h e p o l y c l o n a l M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d i e s u s e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f a n i m m u n o a s s a y f o r r a p i d d e t e c t i o n o f M t u b e r c u l o s i s i n t h e s e b i o s e n s o r s S o m e c r o s s r e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d w i t h t e s t i n g o n E L I S A s

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7 3 D i s c u s s i o n D e v e l o p m e n t o f a r a p i d m e t h o d t o d e t e c t M t u b e r c u l o s i s f r o m l u n g t i s s u e a t a u t o p s y w o u l d b e a s i g n i f i c a n t b e n e f i t t o m e d i c a l e x a m i n e r s ’ o f f i c e s a n d p a t h o l o g i s t s w o r l d w i d e R a p i d d i a g n o s i s w o u l d a l l o w a u t o p s y p e r s o n n e l e x p o s e d t o a n i n f e c t e d d e c e d e n t t o o b t a i n r e s u l t s w i t h i n h o u r s f o r p o s s i b l e e x p o s u r e t o M t u b e r c u l o s i s T h e p e r s o n n e l c o u l d t h e n b e c l o s e l y m o n i t o r e d f o r i n f e c t i o n a n d b e g i n t r e a t m e n t e a r l i e r i f n e e d e d R A P T O R r e s u l t s o n l u n g t i s s u e c o u l d b e o b t a i n e d p o t e n t i a l l y w i t h i n t h r e e h o u r s T h i s s t u d y s h o w s i t i s p o s s i b l e t o d e t e c t M t u b e r c u l o s i s i n t h r e e h o u r s u s i n g t h e R A P T O R b i o s e n s o r i n s t e a d o f o n e m o n t h u s i n g c u r r e n t c o n v e n t i o n a l t e s t s S a m p l e p r e p a r a t i o n a n d a s s a y p r o t o c o l s i n v o l v e c o m m o n l a b o r a t o r y p r a c t i c e s a n d c o u l d e a s i l y a n d q u i c k l y b e l e a r n e d a n d i m p l e m e n t e d b y l a b o r a t o r y s t a f f T h e R A P T O R i s u s e r f r i e n d l y a n d c o u l d b e u s e d b y m e d i c a l e x a m i n e r s t a f f a t t i m e o f n e e d A p r o b l e m e n c o u n t e r e d d u r i n g a s s a y d e v e l o p m e n t w a s t h e s l i g h t l y e l e v a t e d l i m i t o f d e t e c t i o n a s c o m p a r e d t o E c o l i O 1 5 7 : H 7 b i o s e n s o r a s s a y s T h e b i o t i n a n d C y 5 l a b e l e d a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n s w e r e l o w e r e d w h i c h h e l p e d b u t l i m i t o f d e t e c t i o n s w e r e s t i l l s l i g h t l y e l e v a t e d a s c o m p a r e d t o E c o l i O 1 5 7 : H 7 a s s a y s I t i s t h o u g h t t h e a n t i b o d y t o M t u b e r c u l o s i s h a s s o m e n o n s p e c i f i c b i n d i n g w h i c h w o u l d c o n t r i b u t e t o h i g h e r l i m i t s o f d e t e c t i o n B e f o r e p l a c i n g a s a m p l e i n t o t h e A n a l y t e o r R A P T O R i t w a s n e c e s s a r y t o e n s u r e c l u m p s w e r e n o t i n t h e s a m p l e t o b e t e s t e d f o r M t u b e r c u l o s i s R e m o v a l o f c l u m p s w a s

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7 4 p e r f o r m e d b y s o n i c a t i o n a n d / o r h o m o g e n i z i n g I f c l u m p s w e r e n o t r e m o v e d c l o g g i n g o c c u r r e d i n t h e s a m p l e p o r t l e a d i n g t o i n c o n c l u s i v e r e s u l t s I t w a s n e c e s s a r y t o r e m o v e l u n g p i e c e s f r o m a s a m p l e g r o u n d w i t h M t u b e r c u l o s i s b e f o r e r u n n i n g t h e s a m p l e t h r o u g h t h e R A P T O R t o p r e v e n t c l o g g i n g o f t h e s a m p l e p o r t a n d / o r t h e c h a n n e l s o f t h e c o u p o n C o n s i s t e n t d e t e c t i o n w a s o b t a i n e d a t 1 06, 1 07 a n d 1 08 C F U / m l w i t h M t u b e r c u l o s i s i n P B S T H o w e v e r w h e n t e s t i n g l u n g t i s s u e w i t h M t u b e r c u l o s i s c o n s i s t e n t d e t e c t i o n w a s o b t a i n e d o n l y a t 1 07 a n d 1 08 C F U / m l T h i s d i f f e r e n c e i s t h o u g h t t o b e c a u s e d b y d i l u t i o n o f t h e M t u b e r c u l o s i s b y l u n g b l o o d d u r i n g g r i n d i n g T h e r a p i d d e t e c t i o n o f M t u b e r c u l o s i s u s i n g t h e R A P T O R t a k e s t h r e e h o u r s T h r e e h o u r s i s r a p i d w h e n c o m p a r e d t o t h e m i n i m u m o f o n e m o n t h f o r r e s u l t s b a s e d o n c o n v e n t i o n a l t e s t s E v e n t h o u g h t h e R A P T O R i s f u l l y a u t o m a t e d i t w o u l d b e d e s i r a b l e t o d e v e l o p a n e v e n m o r e r a p i d R A P T O R a s s a y t o d e t e c t M t u b e r c u l o s i s D e v e l o p m e n t o f a n e v e n m o r e r a p i d R A P T O R a s s a y w o u l d i n v o l v e q u i c k e r s a m p l e p r e p a r a t i o n p r o c e d u r e s a n d s h o r t e r i n c u b a t i o n t i m e s A n E L I S A w a s p e r f o r m e d w i t h a n t i M t u b e r c u l o s i s a n d F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e t o d e t e r m i n e w h i c h o f t h e d i f f e r e n t l a y e r s t h a t r e s u l t e d a f t e r c e n t r i f u g a t i o n o f F r e u n d ’ s a d j u v a n t w e r e m o s t r e a c t i v e w i t h a n t i M t u b e r c u l o s i s T h e w h i t e b o t t o m p e l l e t w a s m o s t r e a c t i v e T h e r e s u l t s o b t a i n e d e n a b l e d s i m i l a r c o n c e n t r a t i o n s t o b e u s e d d u r i n g d e v e l o p m e n t o f t h e A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y f o r M t u b e r c u l o s i s A d i r e c t c o u n t c o u l d n o t b e p e r f o r m e d w i t h F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e d u e t o t h e o i l E v e n w h e n t h e p e l l e t w a s r i n s e d a n d s u s p e n d e d i n P B S T t h e o i l c a u s e d i n t e r f e r e n c e i n c o u n t i n g S e r i a l d i l u t i o n s w e r e p e r f o r m e d a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e p e l l e t w a s b a s e d o n t h e S i g m a C h e m i c a l

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7 5 C o m p a n y a p p r o x i m a t e d 1 m g / m l c o n c e n t r a t i o n o f t h e F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e T h e A n a l y t e 2 0 0 0 a s s a y u s i n g F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e w a s d e v e l o p e d f o r r a p i d d e t e c t i o n o f M t u b e r c u l o s i s T h e F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e w a s s u b s e q u e n t l y t r i e d i n t h e R A P T O R w i t h u n s u c c e s s f u l r e s u l t s T h e o i l c o a t e d t h e w a v e g u i d e s c o u p o n t u b i n g a n d o t h e r p a r t s o f t h e R A P T O R i n t e r f e r i n g i n d e t e c t i o n T h e o i l c o a t i n g d i d o c c u r i n t h e A n a l y t e 2 0 0 0 b u t n o t t o t h e e x t e n t o b s e r v e d i n t h e R A P T O R A n a l y t e 2 0 0 0 a n d R A P T O R a s s a y s w e r e s u c c e s s f u l l y d e v e l o p e d u s i n g l i v e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s D i r e c t c o u n t s w e r e p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e a p p r o x i m a t e c o n c e n t r a t i o n s o f M t u b e r c u l o s i s T h e s e n s i t i v i t y o f b o t h a s s a y s w a s 1 06 C F U / m l A R A P T O R a s s a y w i t h M t u b e r c u l o s i s s e e d e d i n t o d e c e d e n t l u n g t i s s u e w a s t h e n s u c c e s s f u l l y d e v e l o p e d w i t h a s e n s i t i v i t y o f 1 07 C F U / m l S p e c i f i c i t y s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d w i t h v a r i o u s m i c r o o r g a n i s m s a n d t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y F i r s t a n E L I S A w a s p e r f o r m e d T h e r e w a s s l i g h t c r o s s r e a c t i v i t y o b s e r v e d w i t h s o m e o f t h e o t h e r m i c r o o r g a n i s m s : E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s P r o t e u s m i r a b i l i s P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s C a n d i d a a l b i c a n s M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e a n d M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e T h i s c r o s s r e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d a t t h e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f m i c r o o r g a n i s m s R A P T O R a s s a y s p e c i f i c i t y w a s p e r f o r m e d o n t h e s e m i c r o b e s N o c r o s s r e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d w i t h a n y o f t h e m i c r o o r g a n i s m s M t u b e r c u l o s i s w a s r u n a s a p o s i t i v e c o n t r o l a t t h e e n d o f e a c h a s s a y a n d w a s d e t e c t e d i n a l l a s s a y s

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7 6 A W e s t e r n b l o t w a s p e r f o r m e d o n t h e s e m i c r o o r g a n i s m s I t w a s d e t e r m i n e d t h a t t h e r e w a s s l i g h t c r o s s r e a c t i v i t y w i t h a n t i M t u b e r c u l o s i s a n d M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s M t u b e r c u l o s i s a n d M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s e a c h s h o w e d t w o b a n d s s i g n i f y i n g t h e y c o n t a i n t w o s i m i l a r p r o t e i n s t h a t a r e r e a c t i v e w i t h a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y P o t e n t i a l c r o s s r e a c t i v i t y i s s u e s w i t h o t h e r m i c r o o r g a n i s m s a n d a n t i M t u b e r c u l o s i s m a y p o s s i b l y b e r e s o l v e d b y t e s t i n g w i t h a m o n o c l o n a l M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y H o w e v e r f u r t h e r s t u d y w o u l d b e n e c e s s a r y A n i m p o r t a n t a s p e c t d e t e r m i n e d w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f t h e M t u b e r c u l o s i s R A P T O R a s s a y i s t h a t t h e s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y o f t h e a s s a y i s d e p e n d e n t o n t h e a n t i b o d i e s u s e d E v e n t h o u g h p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s w e r e u s e d i n t h i s s t u d y a n d n o c r o s s r e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d w h e n t e s t i n g s p e c i f i c i t y i n t h e R A P T O R a s s a y s t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y d i d e x h i b i t c r o s s r e a c t i v i t y t o o t h e r m i c r o o r g a n i s m s w h e n E L I S A w a s u s e d f o r t e s t i n g E L I S A s t u d i e s s h o w e d s m a l l a m o u n t s o f c r o s s r e a c t i v i t y w h e n h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f o t h e r m i c r o b e s w e r e t e s t e d I t m a y b e t h a t t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y h a d a g r e a t e r c h a n c e o f s t i c k i n g n o n s p e c i f i c a l l y t o w e l l s o f E L I S A p l a t e s t h a n t o t h e w a v e g u i d e s u s e d i n R A P T O R a s s a y s T h e W e s t e r n b l o t d e m o n s t r a t e d t h a t t h e a n t i M t u b e r c u l o s i s a n t i b o d y d i d b i n d t o s p e c i f i c m o l e c u l e s f o u n d i n M s m e g m a t i s a n d i n M t u b e r c u l o s i s T h e W e s t e r n b l o t a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t t h e a n t i b o d y w a s n o t c r o s s r e a c t i v e w i t h t h e m i c r o o r g a n i s m s : E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 H a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s P r o t e u s m i r a b i l i s P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a C a n d i d a a l b i c a n s M y c o b a c t e r i u m g o r d o n a e a n d M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e l l u l a r e D u r i n g a M t u b e r c u l o s i s i n f e c t i o n o f t h e l u n g s o n e m a y a l s o h a v e o t h e r m i c r o b i a l i n f e c t i o n s i n t h e l u n g s S o m e

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7 7 m i c r o b e s a l o n e c a n c a u s e i n f e c t i o n s o f t h e l u n g s w i t h s y m p t o m s s i m i l a r t o M t u b e r c u l o s i s i n f e c t i o n s V a r i o u s m i c r o o r g a n i s m s w e r e t e s t e d b u t d o n o t r e p r e s e n t a l l p o s s i b l e m i c r o b i a l i n f e c t i o n s t h a t m a y b e f o u n d i n t h e l u n g s C r o s s r e a c t i v i t y s t u d i e s w e r e a l s o p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e i f o t h e r m i c r o o r g a n i s m s t h a t m a y b e p r e s e n t w o u l d g i v e f a l s e p o s i t i v e d e t e c t i o n f o r M t u b e r c u l o s i s w i t h o r w i t h o u t t h e p r e s e n c e o f M t u b e r c u l o s i s T h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t o n l y M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s h a s t h e p o t e n t i a l t o p r o d u c e f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s i n R A P T O R a s s a y s H o w e v e r n o f a l s e p o s i t i v e s w e r e d i s c o v e r e d w h e n p e r f o r m i n g s p e c i f i c i t y R A P T O R a s s a y s w i t h M y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s F r e u n d ’ s a d j u v a n t c o m p l e t e w a s u s e d i n t h i s s t u d y p r i o r t o U S F B i o s a f e t y C o m m i t t e e a p p r o v a l o f a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s T h e a d j u v a n t w h i c h c o n t a i n e d h e a t k i l l e d M t u b e r c u l o s i s H 3 7 R v c o u l d b e u s e d p r i o r t o s u c h a p p r o v a l H o w e v e r t h e o i l p r e s e n t e d p r o b l e m s i n d i r e c t c o u n t s a n d i n R A P T O R a s s a y s A t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s ( 3 7 6 8 7 2 ) w a s u s e d i n t h i s s t u d y b e c a u s e w o r k w a s p e r f o r m e d i n a B i o s a f e t y L e v e l 2 f a c i l i t y M t u b e r c u l o s i s H 3 7 R v w a s n o t u s e d ; i t s t e s t i n g r e q u i r e s a B i o s a f e t y L e v e l 3 l a b o r a t o r y I t i s p o s s i b l e t h a t R A P T O R r e s u l t s m a y b e d i f f e r e n t w h e n H 3 7 R v i s t e s t e d H 3 7 R v m a y t e s t w i t h b e t t e r s e n s i t i v i t y a s i t c o n t a i n s a l l v i r u l e n t g e n e t i c m a t e r i a l T h e s t u d i e s d e s c r i b e d u s i n g H 3 7 R a h o w e v e r d o s u g g e s t t h a t t h e R A P T O R a s s a y w i l l d e t e c t t h e H 3 7 R v s t r a i n a t c o n c e n t r a t i o n s o f > 1 07 C F U / m l F u t u r e w o r k c o u l d i n c l u d e d e v e l o p i n g a r a p i d a s s a y t o d e t e c t M t u b e r c u l o s i s a t c o n c e n t r a t i o n s l o w e r t h a n 1 07 C F U / m l b y i m p r o v i n g c a p t u r e e f f i c i e n c y o f M t u b e r c u l o s i s o n t h e w a v e g u i d e s I n a M t u b e r c u l o s i s i n f e c t i o n o f t h e l u n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f M t u b e r c u l o s i s i s u s u a l l y i n t h e r a n g e o f 1 07 t o 1 09 C F U / m l ( 3 1 )

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7 8 C u r r e n t t e s t i n g p e r f o r m e d a t t h e S t a t e L a b o r a t o r y r e q u i r e s p o s i t i v e d e t e c t i o n u s i n g D N A p r o b i n g a n d c o n f i r m a t i o n o f g r o w t h o n L o w e n s t e i n J e n s e n s l a n t s T h e g r o w t h i s a c o n f i r m a t i o n o f v i a b l e M t u b e r c u l o s i s T h e b i o s e n s o r a s s a y t h a t w a s d e v e l o p e d i n t h i s s t u d y w o u l d b e u s e d a s a s c r e e n i n g t e s t I f M t u b e r c u l o s i s w e r e d e t e c t e d P C R c o n f i r m a t i o n a n d v i a b i l i t y t e s t i n g w o u l d s u b s e q u e n t l y b e p e r f o r m e d S i n c e M t u b e r c u l o s i s g r o w s s o s l o w l y ( a g e n e r a t i o n t i m e o f 1 5 2 0 h o u r s ) c o n f i r m a t i o n o f v i a b i l i t y u s u a l l y t a k e s a t l e a s t a w e e k H o w e v e r P C R c o n f i r m a t i o n a n d v i a b i l i t y t e s t s c o u l d b e i m m e d i a t e l y p e r f o r m e d o n M t u b e r c u l o s i s r e c o v e r e d f r o m b i o s e n s o r w a v e g u i d e s a s r e p o r t e d i n p r e v i o u s s t u d i e s f r o m o u r l a b o r a t o r y ( 4 5 6 9 7 6 ) T h e r e i s p o t e n t i a l f o r d e v e l o p m e n t f o r r a p i d d e t e c t i o n a n d d i a g n o s i s u s i n g t h e R A P T O R f o r c l i n i c a l s p e c i m e n s f r o m l i v i n g i n d i v i d u a l s p o s s i b l y c e r e b r o s p i n a l f l u i d b l o o d u r i n e a n d s p u t u m C l i n i c a l s p e c i m e n s w i t h o u t M t u b e r c u l o s i s i n f e c t i o n c o u l d b e s e e d e d w i t h a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s a n d s i m i l a r p r o c e d u r e s c o u l d b e f o l l o w e d a s w a s d o n e w i t h t h e R A P T O R a s s a y s t h a t u s e d s e e d e d d e c e d e n t l u n g t i s s u e C e r e b r o s p i n a l f l u i d b l o o d a n d u r i n e m a y b e c h a l l e n g i n g m a t r i c e s t o t e s t T h e s e s p e c i m e n s m a y c a u s e o v e r w h e l m i n g b a c k g r o u n d i n t e r f e r e n c e w h e n t e s t e d i n t h e l a b o r a t o r y o n t h e R A P T O R I f b a c k g r o u n d i n t e r f e r e n c e c a n b e m a n a g e d v a r i a n c e s i n p r o t o c o l s m a y h a v e t o b e d e v e l o p e d t o a d j u s t f o r t h e d i f f e r e n t m a t r i c e s U r i n e s a m p l e s m a y r e q u i r e p H a d j u s t m e n t a n d s p u t u m s a m p l e s m a y r e q u i r e d e c o n t a m i n a t i o n s t e p s I t m a y b e t h a t M t u b e r c u l o s i s i n c e r e b r o s p i n a l f l u i d b l o o d u r i n e a n d s p u t u m m a y n o t b e f o u n d i n s u f f i c i e n t c o n c e n t r a t i o n s t o d e t e c t u s i n g t h e R A P T O R T h e s e n s i t i v i t y o f M t u b e r c u l o s i s a s s a y s m a y n e e d t o b e i m p r o v e d b e f o r e d e t e c t i o n c o u l d b e a c h i e v e d

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7 9 I n o r d e r t o d e t e r m i n e i f t h e b i o s e n s o r a s s a y w i t h l u n g t i s s u e s e e d e d w i t h a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s i n t h i s s t u d y i s a n a c c u r a t e r e p r e s e n t a t i o n o f a n a t u r a l l y i n f e c t e d l u n g w i t h M t u b e r c u l o s i s l u n g t i s s u e f r o m a n a t u r a l l y i n f e c t e d l u n g w i t h M t u b e r c u l o s i s s h o u l d b e t e s t e d o n t h e b i o s e n s o r A B i o s a f e t y L e v e l 3 f a c i l i t y w o u l d b e r e q u i r e d f o r t e s t i n g A r a p i d R A P T O R a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f M t u b e r c u l o s i s i n d e c e d e n t l u n g t i s s u e w a s d e v e l o p e d i n t h i s s t u d y T h i s a s s a y o f f e r s p o t e n t i a l f o r f u r t h e r d e v e l o p m e n t i n r a p i d l y d e t e c t i n g M t u b e r c u l o s i s i n d e c e d e n t s a s w e l l a s p o s s i b l y i n l i v i n g i n d i v i d u a l s

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8 0 R e f e r e n c e s 1 A b r e u M 1 9 2 6 T e s t o n a n e w v a s c u l a r r a d i o l o g y M a s s o n P a r i s 2 A g u a d o J J R a m o s a n d C L u m b r e r a s 1 9 9 6 T r a n s m i s s i o n o f t u b e r c u l o s i s d u r i n g a l o n g a i r p l a n e f l i g h t N E n g l J M e d 3 3 5 ( 9 ) : 6 7 5 3 A l b e r t H A H e y d e n r y c h R M o l e A T r o l l i p a n d L B l u m b e r g 2 0 0 1 E v a l u a t i o n o f F A S T P l a q u e T B R I F a r a p i d m a n u a l t e s t f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f r i f a m p i c i n r e s i s t a n c e f r o m M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s c u l t u r e s I n t J T u b e r c L u n g D i s 5 : 9 0 6 9 1 1 4 A l b e r t H A T r o l l i p R M o l e J H a t c h a n d L B l u m b e r g 2 0 0 2 R a p i d i n d i c a t i o n o f m u l t i d r u g r e s i s t a n t t u b e r c u l o s i s f r o m l i q u i d c u l t u r e s u s i n g F A S T P l a q u e T B R I F a m a n u a l p h a g e b a s e d t e s t I n t J T u b e r c L u n g D i s 6 : 5 2 3 5 2 8 5 B a r n e s P a n d S B a r r o w s 1 9 9 3 T u b e r c u l o s i s i n t h e 1 9 9 0 s A n n I n t e r n M e d 1 1 9 : 5 : 4 0 0 4 1 0 6 B e e r s M a n d R B e r k o w 2 0 0 1 I n f e c t i o u s d i s e a s e s c a u s e d b y m y c o b a c t e r i a M e r c k M a n u a l o f D i a g n o s i s a n d T h e r a p y M e r c k R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s W h i t e h o u s e S t a t i o n N J 7 B e m e r P F P a l i c o v a S R u s c h G e r d e s H D r u g e o n a n d G P f y f f e r 2 0 0 2 M u l t i c e n t e r e v a l u a t i o n o f f u l l y a u t o m a t e d B A C T E C M y c o b a c t e r i a G r o w t h I n d i c a t o r T u b e 9 6 0 s y s t e m f o r s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s J C l i n M i c r o b i o l 4 0 : 1 5 0 1 5 4 8 B h a t i a A S K u m a r a n d B H a r i n a t h 2 0 0 3 I m m u n o d i a g n o s i s o f t u b e r c u l o s i s : a n u p d a t e I n d i a n J C l i n B i o c h e m 1 8 : 1 5 9 B r o s c h R e t a l 1 9 9 9 G e n o m i c a n a l y s i s r e v e a l s v a r i a t i o n b e t w e e n M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s H 3 7 R v a n d t h e a t t e n u a t e d M t u b e r c u l o s i s H 3 7 R a s t r a i n I n f e c t I m m u n 6 7 : 5 7 6 8 5 7 7 4 1 0 C a l m e t t e A 1 9 2 7 L a V a c c i n a t i o n P r e v e n t i v e c o n t r e l a T u b e r c u l o s e p a r l e B C G M a s s o n P a r i s

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8 1 1 1 C a v e A 1 9 3 9 T h e e v i d e n c e f o r t h e i n c i d e n c e o f t u b e r c u l o s i s i n a n c i e n t E g y p t B r J T u b e r c 3 3 : 1 4 2 1 5 2 1 2 C a v e M K E i s e n a c h P M c D e r m o t t J B a t e s a n d J C r a w f o r d 1 9 9 1 I S 6 1 1 0 : c o n s e r v a t i o n o f s e q u e n c e i n t h e M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s c o m p l e x a n d i t s u t i l i z a t i o n i n D N A f i n g e r p r i n t i n g M o l C e l l P r o b e s 5 : 7 3 8 0 1 3 C a v e M K E i s e n a c h a n d G T e m p l e t o n 1 9 9 4 S t a b i l i t y o f D N A f i n g e r p r i n t p a t t e r n p r o d u c e d w i t h I S 6 1 1 0 i n s t r a i n s o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s J C l i n M i c r o b i o l 3 2 : 2 6 2 2 6 6 1 4 C a v i e d e s L J D e l g a d o a n d R G i l m a n 2 0 0 2 T e t r a z o l i u m m i c r o p l a t e a s s a y a s a r a p i d a n d i n e x p e n s i v e c o l o r i m e t r i c m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n o f a n t i b i o t i c s u s c e p t i b i l i t y o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s J C l i n M i c r o b i o l 4 0 : 1 8 7 3 1 8 7 4 1 5 C D C 2 0 0 6 R e p o r t e d T u b e r c u l o s i s i n t h e U n i t e d S t a t e s 2 0 0 5 A t l a n t a G A : U S D e p a r t m e n t o f H e a l t h a n d H u m a n S e r v i c e s C D C w w w c d c g o v 1 6 C o l e S K E i s e n a c h D M c M u r r a y a n d W J a c o b s 2 0 0 5 T u b e r c u l o s i s a n d t h e T u b e r c l e B a c i l l u s A S M P r e s s W a s h i n g t o n D C 1 7 C o l l i n s F 1 9 9 8 M y c o b a c t e r i a l p a t h o g e n e s i s : a h i s t o r i c a l p e r s p e c t i v e F r o n t i e r s i n B i o s c i e n c e 3 : 1 2 3 1 3 2 1 8 C o m s t o c k G 1 9 8 2 E p i d e m i o l o g y o f t u b e r c u l o s i s A m R e v R e s p i r D i s 1 2 5 ( S u p p l ) : 8 1 6 1 9 D a v i s A 1 9 9 6 H i s t o r y o f t h e S a n a t o r i u m M o v e m e n t I n : W R o m a n d S G a r a y E d i t o r s T u b e r c u l o s i s L i t t l e B r o w n a n d C o m p a n y N e w Y o r k N Y 2 0 D e a n S 2 0 0 5 M e d i c a l L a b o r a t o r y S c i e n t i s t I V F l o r i d a D e p a r t m e n t o f H e a l t h B u r e a u o f L a b o r a t o r i e s M y c o b a c t e r i o l o g y L a b o r a t o r y J a c k s o n v i l l e F l o r i d a ( p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n s ) 2 1 D e M a r c o D a n d D L i m 2 0 0 1 D i r e c t d e t e c t i o n o f E s c h e r i c h i a c o l i 0 1 5 7 : H 7 i n u n p a s t e u r i z e d a p p l e j u i c e w i t h a n e v a n e s c e n t w a v e b i o s e n s o r J R a p M e t h A u t o M i c r o b i o l 9 : 2 4 1 2 5 7 2 2 D e M a r c o D a n d D L i m 2 0 0 2 D e t e c t i o n o f E s c h e r i c h i a c o l i 0 1 5 7 : H 7 i n 1 0 a n d 2 5 g r a m g r o u n d b e e f s a m p l e s w i t h a n e v a n e s c e n t w a v e b i o s e n s o r w i t h s i l i c a a n d p o l y s t y r e n e w a v e g u i d e s J F o o d P r o t 6 5 : 5 9 6 6 0 2 2 3 D r a k e T J H i n d l e r O B e r l i n a n d D B r u c k n e r 1 9 8 7 R a p i d i d e n t i f i c a t i o n o f M y c o b a c t e r i u m a v i u m c o m p l e x i n c u l t u r e u s i n g D N A p r o b e s J C l i n M i c r o b i o l 2 5 : 1 4 4 2 1 4 4 5

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8 2 2 4 D u b o s R a n d J D u b o s 1 9 5 2 T u b e r c u l o s i s M a n a n d S o c i e t y : T h e W h i t e P l a g u e L i t t l e B r o w n a n d C o B o s t o n M A 2 5 D y e C S S c h e e l e P D o l i n V P a t h a n i a a n d M R a v i g l i o n e 1 9 9 9 G l o b a l b u r d e n o f t u b e r c u l o s i s : e s t i m a t e d i n c i d e n c e p r e v a l e n c e a n d m o r t a l i t y b y c o u n t r y J A m M e d A s s o c 2 8 2 : 6 7 7 6 8 6 2 6 F a r e r L L L o w e l l a n d M M e a d o r 1 9 7 9 E x t r a p u l m o n a r y t u b e r c u l o s i s i n t h e U n i t e d S t a t e s A m J E p i d e m i o l 1 0 9 : 2 0 5 2 1 7 2 7 F i e l d M 2 0 0 1 T u b e r c u l o s i s i n t h e W o r k p l a c e N a t i o n a l A c a d e m y P r e s s W a s h i n g t o n D C 2 8 F l a v i n R N G i b b o n s a n d D O ’ B r i a i n 2 0 0 6 M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s a t a u t o p s y e x p o s u r e a n d p r o t e c t i o n : a n o l d a d v e r s a r y r e v i s i t e d J C l i n P a t h o l 1 : 1 1 4 2 9 G e r s t o n K L B l u m b e r g V T s h a b a l a l a a n d J M u r r a y 2 0 0 4 V i a b i l i t y o f m y c o b a c t e r i a i n f o r m a l i n f i x e d l u n g s H u m P a t h 3 5 : 5 7 1 5 7 5 3 0 G o t t o M S O k a a n d K O k u z u m i 1 9 9 1 E v a l u a t i o n o f a c r i d i n i u m e s t e r l a b e l e d D N A p r o b e s f o r i d e n t i f i c a t i o n o f M y c o b a c t e r i u m a v i u m i n t r a c e l l u l a r e c o m p l e x i n c u l t u r e J C l i n M i c r o b i o l 2 1 9 : 2 4 7 3 2 4 7 6 3 1 G r o s s e t J 1 9 8 0 B a c t e r i o l o g i c b a s i s o f s h o r t c o u r s e c h e m o t h e r a p y f o r t u b e r c u l o s i s C l i n C h e s t M e d 1 : 2 3 1 – 2 3 2 3 2 G u e r r a n t G M L a m b e r t a n d C M o s s 1 9 8 1 G a s c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s o f m y c o l i c a c i d c l e a v a g e p r o d u c t s i n m y c o b a c t e r i a J C l i n M i c r o b i o l 1 3 : 8 9 9 9 0 7 3 3 H a v l i r D a n d P B a r n e s 1 9 9 9 T u b e r c u l o s i s i n p a t i e n t s w i t h h u m a n i m m u n o d e f i c i e n c y v i r u s i n f e c t i o n N E n g l J M e d 3 4 0 : 3 6 7 3 7 3 3 4 H e r m a n s P A S c h u t t e m a a n d D V a n S o o l s i n g e n 1 9 9 0 S p e c i f i c d e t e c t i o n o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s c o m p l e x s t r a i n s b y p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n J C l i n M i c r o b i o l 2 8 : 1 2 0 4 1 2 1 3 3 5 H i n s h a w H W F e l d m a n a n d K P f u e t z e 1 9 4 6 T r e a t m e n t o f t u b e r c u l o s i s w i t h s t r e p t o m y c i n : a s u m m a r y o f o b s e r v a t i o n s o n o n e h u n d r e d c a s e s J A m M e d A s s o c 1 3 2 : 7 7 8 7 8 2 3 6 J e n s e n K 1 9 3 2 Z e n t r a l b B a k t e r i o l P a r a s i t e n k d I n f e k t i o n s k r H y g A b t 1 O r i g 1 2 5 2 2 2

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8 3 3 7 K a t o M a e d a M P J B i f a n i B N K r e i s w i r t h a n d P M S m a l l 2 0 0 1 T h e n a t u r e a n d c o n s e q u e n c e o f g e n e t i c v a r i a b i l i t y w i t h i n M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s J C l i n I n v e s t 1 0 7 : 5 3 3 5 3 7 3 8 K e n y o n T e t a l 1 9 9 6 T r a n s m i s s i o n o f m u l t i d r u g r e s i s t a n t M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s d u r i n g a l o n g a i r p l a n e f l i g h t N E n g l J M e d 3 3 4 : 9 3 3 9 3 8 3 9 K i e h n T a n d F E d w a r d s 1 9 8 7 R a p i d i d e n t i f i c a t i o n u s i n g a s p e c i f i c D N A p r o b e o f M y c o b a c t e r i u m a v i u m c o m p l e x f r o m p a t i e n t s w i t h a c q u i r e d i m m u n o d e f i c i e n c y s y n d r o m e J C l i n M i c r o b i o l 2 5 : 1 5 5 1 1 5 5 2 4 0 K i s a O A A l b a y O B e d i r O B a y l a n a n d L D o g a n c i 2 0 0 3 E v a l u a t i o n o f F A S T P l a q u e T B R I F f o r d e t e r m i n a t i o n o f r i f a m p i c i n r e s i s t a n c e i n M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s c o m p l e x i s o l a t e s I n t J T u b e r c L u n g D i s 7 : 2 8 4 2 8 8 4 1 K o c h R 1 8 8 2 D i e a e t i o l o g i e d e r t u b e r c u l o s e B e r l K l i n W o c h e n s c h r 1 9 : 2 2 1 2 3 0 4 2 K o c h R 1 9 0 1 T h e c o m b a t t i n g o f t u b e r c u l o s i s i n t h e l i g h t o f e x p e r i e n c e t h a t h a s b e e n g a i n e d i n t h e s u c c e s s f u l c o m b a t t i n g o f o t h e r i n f e c t i o u s d i s e a s e s L a n c e t I I : 1 8 7 1 9 1 4 3 K o c h R 1 9 3 2 D i e a e t i o l o g i e d e r t u b e r c u l o s e t r a n s l a t i o n b y B P i n n e r a n d M P i n n e r w i t h a n i n t r o d u c t i o n b y A K r a u s e A m R e v T u b e r c 2 5 : 2 8 5 3 2 3 4 4 K o n e m a n E S A l l e n W J a n d a P S c h r e c k e n b e r g e r a n d W W i n n 1 9 9 7 C o l o r A t l a s a n d T e x t b o o k o f D i a g n o s t i c M i c r o b i o l o g y 5t h E d L i p p i n c o t t – R a v e n P u b l i s h e r s P h i l a d e l p h i a P A p p 8 9 3 – 9 5 2 4 5 K r a m e r M T T i m s D D e M a r c o a n d D L i m 2 0 0 2 R e c o v e r y o f E s c h e r i c h i a c o l i O 1 5 7 : H 7 f r o m f i b e r o p t i c w a v e g u i d e s u s e d f o r r a p i d b i o s e n s o r d e t e c t i o n J R a p M e t h A u t o M i c r o b i o l 1 0 : 9 3 1 0 6 4 6 K u b i c a G e t a l 1 9 8 7 L a b o r a t o r y s e r v i c e s f o r M y c o b a c t e r i a l d i s e a s e s A m R e v R e s p i r D i s 1 0 7 : 9 2 1 4 7 L a n d o w s k i C H G o d f r e y S B e n t l e y H i b b e r t X L i u Z H u a n g R S e p u l v e d a K I t u y g e n M G e n n a r o F M o y S L e s l e y a n d M H a a k – f r e n d s c h o 2 0 0 1 C o m b i n a t o r i a l u s e o f a n t i b o d i e s t o s e c r e t e d m y c o b a c t e r i a l p r o t e i n s i n a h o s t i m m u n e s y s t e m – i n d e p e n d e n t t e s t f o r t u b e r c u l o s i s J C l i n M i c r o b i o l 3 9 : 2 4 1 8 2 4 2 4 4 8 L a u z a r d o M P L e e H D u n c a n a n d Y H a l e 2 0 0 1 T r a n s m i s s i o n o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s t o a f u n e r a l d i r e c t o r d u r i n g r o u t i n e e m b a l m i n g C h e s t 1 1 9 : 6 4 0 6 4 2

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8 4 4 9 L e b r u n L F E s p i n a s s e a n d J P o v e d a 1 9 9 2 E v a l u a t i o n o f n o n r a d i o a c t i v e D N A p r o b e s f o r i d e n t i f i c a t i o n o f m y c o b a c t e r i a J C l i n M i c r o b i o l 3 0 : 2 4 7 6 2 4 7 8 5 0 L e e J 2 0 0 5 A s s o c i a t e M e d i c a l E x a m i n e r M e d i c a l E x a m i n e r D e p a r t m e n t H i l l s b o r o u g h C o u n t y T a m p a F l o r i d a ( p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n s ) 5 1 L i m D 2 0 0 3 M i c r o b i o l o g y 3r d E d K e n d a l l / H u n t P u b l i s h i n g C o m p a n y D u b u q u e I A 5 2 L i m D 2 0 0 3 D e t e c t i o n o f m i c r o o r g a n i s m s a n d t o x i n s w i t h e v a n e s c e n t w a v e f i b e r o p t i c b i o s e n s o r s P r o c I E E E 9 1 : 9 0 2 9 0 7 5 3 L i m D G S t e w a r t a n d M L e v e r o n e 1 9 9 5 I n t r o d u c t i o n t o M i c r o b i o l o g y C o n t e m p o r a r y P u b l i s h i n g C o m p a n y R a l e i g h N C 5 4 L o k K W B e n j a m i n M K i m e r l i n g V P r u i t t M L a t h a n J R a q u e z N H o o p e r W C r o n i n a n d N D u n l a p 2 0 0 2 M o l e c u l a r d i f f e r e n t i a t i o n o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s s t r a i n s w i t h o u t I S 6 1 1 0 i n s e r t i o n s E m e r g I n f e c t D i s 8 : 1 3 1 0 1 3 1 3 5 5 L o w e n s t e i n L 1 9 3 1 Z e n t r a l b l B a k t e r i o l P a r a s i t e n k d I n f e k t i o n s k r H y g A b t 1 O r i g 1 2 0 1 2 7 5 6 M a n t o u x C 1 9 1 0 L i n t r a d e r m o r e a c t i o n a l a t u b e r c u l i n e e t s o n i n t e r p r e t a t i o n c l i n i q u e L a P r e s s e M e d 1 8 : 1 0 3 5 7 M a t e r i a l S a f e t y D a t a S h e e t ( M S D S ) 2 0 0 1 O f f i c e o f L a b o r a t o r y S e c u r i t y M S D S I n f e c t i o u s S u b s t a n c e s S e c t i o n 1 I n f e c t i o u s a g e n t M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s P u b l i c H e a l t h A g e n c y o f C a n a d a H e a l t h C a n a d a 5 8 M e d i c a l E x a m i n e r M i s s i o n S t a t e m e n t H i l l s b o r o u g h C o u n t y F l o r i d a 2 0 0 6 H i l l s b o r o u g h C o u n t y G o v e r n m e n t o n l i n e M e d i c a l E x a m i n e r h t t p : / / w w w h i l l s b o r o u g h c o u n t y o r g / m e d e x a m / 5 9 M u s i a l C L T i c e L S t o c k m a n a n d G R o b e r t s 1 9 8 8 I d e n t i f i c a t i o n o f m y c o b a c t e r i a f r o m c u l t u r e b y u s i n g t h e G e n P r o b e r a p i d d i a g n o s t i c s y s t e m f o r M y c o b a c t e r i u m a v i u m c o m p l e x a n d M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s c o m p l e x J C l i n M i c r o b i o l 2 6 : 2 1 2 0 2 1 2 3 6 0 N o l t e F B M e t c h o c k a n d J M c G o w a n 1 9 9 3 D i r e c t d e t e c t i o n o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s i n s p u t u m b y p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n a n d D N A h y b r i d i z a t i o n J C l i n M i c r o b i o l 3 1 : 1 7 7 7 1 7 8 2 6 1 N o l t e K D T a y l o r a n d J R i c h m o n d 2 0 0 2 B i o s a f e t y c o n s i d e r a t i o n s f o r a u t o p s y A m J F o r e n s i c M e d P a t h o l 2 3 : 1 0 7 1 2 2

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8 5 6 2 N o l t e K 2 0 0 5 S u r v i v a l o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s o r g a n i s m s f o r 8 d a y s i n f r e s h l u n g t i s s u e f r o m a n e x h u m e d b o d y H u m a n P a t h 3 6 : 9 1 5 9 1 6 6 3 P a l o m i n o J a n d F P o r t a e l s 1 9 9 9 S i m p l e p r o c e d u r e f o r d r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s u s i n g a c o m m e r c i a l c o l o r i m e t r i c a s s a y E u r J C l i n M i c r o b i o l I n f e c t D i s 1 8 : 3 8 0 3 8 3 6 4 P i e r s i m o n i C C S c a r p a r o A C a l l e g a r o C T o s i D N i s t a S B o r n i g i a M S c a g n e l l i A R i g o n G R u g g i e r o a n d A G o g l i o 2 0 0 1 C o m p a r i s o n o f M B / B a c T A L E R T 3 D s y s t e m w i t h r a d i o m e t r i c B A C T E C s y s t e m a n d L o w e n s t e i n J e n s e n m e d i u m f o r r e c o v e r y a n d i d e n t i f i c a t i o n o f m y c o b a c t e r i a f r o m c l i n i c a l s p e c i m e n s : a m u l t i c e n t e r s t u d y J C l i n M i c r o b i o l 3 9 : 6 5 1 6 5 7 6 5 R e i n e r E 1 9 6 5 I d e n t i f i c a t i o n o f b a c t e r i a l s t r a i n s b y p y r o l y s i s g a s l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y N a t u r e 2 0 6 : 1 2 7 2 1 2 7 4 6 6 R o b e r t s G N G o o d m a n L H e i f e t s H L a r s c h T L i n d n e r J M c C l a t c h y M M c G i n n i s S S i d d i q i a n d P W r i g h t 1 9 8 3 E v a l u a t i o n o f t h e B A C T E C r a d i o m e t r i c m e t h o d f o r r e c o v e r y o f m y c o b a c t e r i a a n d d r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s f r o m a c i d f a s t s m e a r p o s i t i v e s p e c i m e n s J C l i n M i c r o b i o l 1 8 : 6 8 9 6 9 6 6 7 R o b e r t s G E K o n e m a n a n d Y K i m 1 9 9 1 M y c o b a c t e r i u m M a n u a l o f C l i n i c a l M i c r o b i o l o g y 5t h E d C h a p 3 4 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y W a s h i n g t o n D C 6 8 S c h a f e r M J F e r n b a c k a n d M E r n s t 1 9 9 9 D e t e c t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a i r b o r n e M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s H 3 7 R a p a r t i c l e s a s u r r o g a t e f o r a i r b o r n e p a t h o g e n i c M t u b e r c u l o s i s A e r o s S c i T e c h n o l 3 0 : 1 6 1 1 7 3 6 9 S i m p s o n J a n d D L i m 2 0 0 5 R a p i d P C R c o n f i r m a t i o n o f E c o l i O 1 5 7 : H 7 a f t e r e v a n e s c e n t w a v e f i b e r o p t i c b i o s e n s o r d e t e c t i o n B i o s e n s B i o e l e c t 2 1 : 8 8 1 8 8 7 7 0 S m a l l P F S c h e c t e r C G o o d m a n M S a n d e R C h a i s s o n a n d P H o p e w e l l 1 9 9 1 T r e a t m e n t o f t u b e r c u l o s i s i n p a t i e n t s w i t h a d v a n c e d h u m a n i m m u n o d e f i c i e n c y v i r u s i n f e c t i o n N E n g l J M e d 3 2 4 : 2 8 9 2 9 4 7 1 S t a t e o f F l o r i d a D e p a r t m e n t o f H e a l t h B u r e a u o f L a b o r a t o r i e s 2 0 0 5 M y c o b a c t e r i o l o g y L a b o r a t o r y P r o c e d u r e s 7 2 S t e e n k e n W W H O a t w a y a n d S A P e t r o f f 1 9 3 4 B i o l o g i c a l s t u d i e s o f t h e t u b e r c l e b a c i l l u s I I I D i s s o c i a t i o n a n d p a t h o g e n i c i t y o f t h e R a n d S v a r i a n t s o f t h e h u m a n t u b e r c l e b a c i l l u s ( H 3 7 ) J E x p M e d 6 0 : 5 1 5 5 4 0

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8 6 7 3 S t r o n g M M S a w a y a S W a n g M P h i l l i p s D C a s c i o a n d D E i s e n b e r g 2 0 0 6 T o w a r d t h e s t r u c t u r a l g e n o m i c s c o m p l e x e s : c r y s t a l s t r u c t u r e o f a p r o t e i n c o m p l e x f r o m m y c o b a c t e r i u m P r o c N a t l A c a d S c U S A 1 0 3 : 8 0 6 0 8 0 6 5 7 4 T e m p l e t o n G L Y o u n g D C a v e W S t e a d a n d J B a t e s 1 9 9 5 T h e r i s k f o r t r a n s m i s s i o n o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s a t t h e b e d s i d e a n d d u r i n g a u t o p s y A n n I n t e r n M e d 1 2 2 : 1 2 : 9 2 2 9 2 5 7 5 T h i e r r y D M C a v e K E i s e n a c h J C r a w f o r d J B a t e s B G i c q u e l a n d J G u e s d o n 1 9 9 0 I S 6 1 1 0 a n I S l i k e e l e m e n t o f t h e M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s c o m p l e x N u c l e i c A c i d s R e s 1 8 : 1 8 8 7 6 T i m s T a n d D L i m 2 0 0 3 C o n f i r m a t i o n o f v i a b l e E c o l i O 1 5 7 : H 7 b y e n r i c h m e n t a n d P C R a f t e r r a p i d b i o s e n s o r d e t e c t i o n J M i c r o b i o l M e t h 5 5 : 1 4 1 1 4 7 7 7 T i s d a l l P G R o b e r t s a n d J A n h a l t 1 9 7 9 I d e n t i f i c a t i o n o f c l i n i c a l i s o l a t e s o f m y c o b a c t e r i a w i t h g a s l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a l o n e J C l i n M i c r o b i o l 1 0 : 5 0 6 5 1 4 7 8 T o d a r K 2 0 0 2 T u b e r c u l o s i s T o d a r ’ s O n l i n e T e x t b o o k o f B a c t e r i o l o g y h t t p : / / t e x t b o o k o f b a c t e r i o l o g y n e t / t u b e r c u l o s i s h t m l 7 9 U n i v e r s i t y o f M a s s 2 0 0 5 M y c o b a c t e r i o l o g y P r o c e d u r e f o r S p e c i m e n P r o c e s s i n g / W o r k u p M e m o r i a l H e a l t h C a r e M i c r o b i o l o g y L a b o r a t o r y 8 0 U s s e r y X J B i e r m a n S V a l w a y T S e i t z D i f e r d i n a n d o a n d S O s t r o f f 1 9 9 5 T r a n s m i s s i o n o f m u l t i d r u g r e s i s t a n t M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s a m o n g p e r s o n s e x p o s e d i n a m e d i c a l e x a m i n e r ’ s o f f i c e N e w Y o r k I n f e c t C o n t r o l H o s p E p i d e m 3 : 1 6 0 1 6 5 8 1 W i l s o n S Z a l S u w a i d i R M c N e r n e y J P o r t e r a n d F D r o b n i e w s k i 1 9 9 7 E v a l u a t i o n o f a n e w r a p i d b a c t e r i o p h a g e b a s e d m e t h o d f o r t h e d r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s N a t M e d 3 : 4 6 5 4 6 8 8 2 W o o d s G G F i s h M P l a u n t a n d T M u r p h y 1 9 9 7 C l i n i c a l e v a l u a t i o n o f D i f c o E S P C u l t u r e S y s t e m I I f o r g r o w t h a n d d e t e c t i o n o f m y c o b a c t e r i a J C l i n M i c r o b i o l 3 5 : 1 2 1 1 2 4 8 3 W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n ( W H O ) 2 0 0 6 T u b e r c u l o s i s f a c t s T u b e r c u l o s i s F a c t s S h e e t h a n d o u t 8 4 Y a n g Z P D e H a a s a n d D V a n S o o l i n g e n 1 9 9 4 R e s t r i c t i o n f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s s t r a i n s i s o l a t e d f r o m G r e e n l a n d d u r i n g 1 9 9 2 : e v i d e n c e o f t u b e r c u l o s i s t r a n s m i s s i o n b e t w e e n G r e e n l a n d a n d D e n m a r k J C l i n M i c r o b i o l 3 2 : 3 0 1 8 3 0 2 5


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2006.
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ABSTRACT: There is no rapid diagnostic technique at medical examiners' offices to determine if a decedent is infected with Mycobacterium tuberculosis. Present diagnostic testing requires at least one month for results. A biosensor-based sandwich immunoassay for the detection of M. tuberculosis was developed in this study. M. tuberculosis polyclonal antibody was used for target antigen capture and detection in the immunoassay. Live attenuated M. tuberculosis (ATCC 25177) suspended in phosphate-buffered saline with 0.1% Tween 20 was used as the antigen in the detection assay. The Analyte 2000 was the initial biosensor platform. Initial testing was of Freund's adjuvant complete. M. tuberculosis was detected 50% of the time at 1,000,000 CFU/ml and 100% of the time at 10,000,000 CFU/ml and 100,000,000 CFU/ml. Live attenuated M. tuberculosis was also tested using the Analyte 2000 biosensor. Detection was obtained 87.5% of the time at 1,000,000 CFU/ml and 100% of the time at 10,00 0,000 CFU/ml and 100,000,000 CFU/ml. The RAPTOR, an automated, portable instrument, was then tested as the fiber optic biosensor platform. Positive biosensor detection was obtained 75% of the time at cell concentrations of 1,000,000 CFU/ml, 95% of the time at 10,000,000 CFU/ml, and 99% of the time at 100,000,000 CFU/ml. Live attenuated M. tuberculosis suspended in PBST and seeded into decedent lung tissue was tested using the RAPTOR. Positive detection was obtained 21% of the time at cell concentrations of 1,000,000 CFU/ml, 86% of the time at 10,000,000 CFU/ml and 100% of the time at 100,000,000 CFU/ml. Antibody specificity studies using ELISA were performed to determine the anti-M. tuberculosis antibody's cross reactivity with microorganisms other than M. tuberculosis. M. tuberculosis actively growing in the lung of an individual is found at levels of 10,000,000 to 1,000,000,000 CFU in the lesions of the lung. This study determined that the RAPTOR biosensor assay was capable of ^detecting the presence of M. tuberculosis in lung tissue homogenate within three hours when the concentration of M. tuberculosis was 10,000,000 to 1,000,000,000 CFU/ml.
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Thesis (M.S.)--University of South Florida, 2006.
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Includes bibliographical references.
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538
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500
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590
Adviser: Daniel V. Lim, Ph.D.
653
Autopsy.
Biosensor.
Immunoassay.
Lung Tissue.
Tuberculosis.
690
Dissertations, Academic
z USF
x Biology
Masters.
773
t USF Electronic Theses and Dissertations.
4 856
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