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The proteoglycan perlecan regulates long bone growth through interactions with developmental proteins in the growth plate

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Material Information

Title:
The proteoglycan perlecan regulates long bone growth through interactions with developmental proteins in the growth plate
Physical Description:
Book
Language:
English
Creator:
Smith, Simone Marsha-Lee
Publisher:
University of South Florida
Place of Publication:
Tampa, Fla.
Publication Date:

Subjects

Subjects / Keywords:
Cartilage
Endochondral
FGF
FGFR
HSPG2
Dissertations, Academic -- Molecular Medicine -- Doctoral -- USF   ( lcsh )
Genre:
bibliography   ( marcgt )
theses   ( marcgt )
non-fiction   ( marcgt )

Notes

Summary:
ABSTRACT: Perlecan is the major heparan sulfate proteoglycan (HSPG) in growth plate cartilage and is critical for growth plate chondrocyte proliferation and proper skeletal development. Its core protein and attached chondroitin sulfate (CS) and heparan sulfate (HS) chains mediate interactions with many diverse proteins. Fibroblast growth factor (FGF)-2 and FGF-18 are other regulators of chondrocyte proliferation in the growth plate. Additionally, FGF-18 controls the hypertrophy and cartilage vascularization necessary for endochondral ossification. The research presented in this dissertation aimed to identify known and novel perlecan-binding proteins that are endogenous to the growth plate and to characterize their interactions with perlecan. FGF-2 (known to bind HSPGs) bound to perlecan in both a cationic filtration (CAF) assay and an immunoprecipitation (IP) assay primarily via the HS chains on perlecan.When digested with chondroitinase ABC to remove its CS chains, perlecan augmented binding of FGF-2 to the FGFR-1 and FGFR-3 receptors and increased FGF-2 -stimulated proliferation in BaF3 cells expressing these FGF receptors. Thus, growth plate perlecan binds to FGF-2 by its HS chains but can only deliver FGF-2 to FGF receptors when its CS chains are removed. FGF-18 (known to bind to heparin and to heparan sulfate from some sources) bound to growth plate perlecan. This binding was unchanged by chondroitinase or heparitinase digestion of perlecan, indicating that perlecan GAGs are not involved in FGF-18 binding. FGF-18 bound equally to recombinant domains I-III of perlecan (Alt1) and to full-length perlecan purified from the growth plate. Additionally, FGF-18 bound equally to recombinant domain III of perlecan, to Alt1 and to Alt2 (a domain I-III variant with no heparan sulfate). Therefore, binding sites for FGF-18 are present in domain III of perlecan.Affinity chromatography isolated histone H3 as a perlecan-binding protein from the chondrocyte matrix. CAF assays confirmed the interaction as specific, dependent primarily on HS chains of perlecan, although CS chains and the perlecan core were also involved. Immunohistochemistry detected perlecan and histone H3 colocalized in growth plate cartilage. These results can help us better understand the growth factor-independent control that perlecan exerts on endochondral ossification and, therefore, long bone growth.
Thesis:
Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2007.
Bibliography:
Includes bibliographical references.
System Details:
System requirements: World Wide Web browser and PDF reader.
System Details:
Mode of access: World Wide Web.
Statement of Responsibility:
by Simone Marsha-Lee Smith.
General Note:
Title from PDF of title page.
General Note:
Document formatted into pages; contains 168 pages.
General Note:
Includes vita.

Record Information

Source Institution:
University of South Florida Library
Holding Location:
University of South Florida
Rights Management:
All applicable rights reserved by the source institution and holding location.
Resource Identifier:
aleph - 001925101
oclc - 191567457
usfldc doi - E14-SFE0002155
usfldc handle - e14.2155
System ID:
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1 100
Smith, Simone Marsha-Lee.
4 245
The proteoglycan perlecan regulates long bone growth through interactions with developmental proteins in the growth plate
h [electronic resource] /
by Simone Marsha-Lee Smith.
260
[Tampa, Fla.] :
b University of South Florida,
2007.
520
ABSTRACT: Perlecan is the major heparan sulfate proteoglycan (HSPG) in growth plate cartilage and is critical for growth plate chondrocyte proliferation and proper skeletal development. Its core protein and attached chondroitin sulfate (CS) and heparan sulfate (HS) chains mediate interactions with many diverse proteins. Fibroblast growth factor (FGF)-2 and FGF-18 are other regulators of chondrocyte proliferation in the growth plate. Additionally, FGF-18 controls the hypertrophy and cartilage vascularization necessary for endochondral ossification. The research presented in this dissertation aimed to identify known and novel perlecan-binding proteins that are endogenous to the growth plate and to characterize their interactions with perlecan. FGF-2 (known to bind HSPGs) bound to perlecan in both a cationic filtration (CAF) assay and an immunoprecipitation (IP) assay primarily via the HS chains on perlecan.When digested with chondroitinase ABC to remove its CS chains, perlecan augmented binding of FGF-2 to the FGFR-1 and FGFR-3 receptors and increased FGF-2 -stimulated proliferation in BaF3 cells expressing these FGF receptors. Thus, growth plate perlecan binds to FGF-2 by its HS chains but can only deliver FGF-2 to FGF receptors when its CS chains are removed. FGF-18 (known to bind to heparin and to heparan sulfate from some sources) bound to growth plate perlecan. This binding was unchanged by chondroitinase or heparitinase digestion of perlecan, indicating that perlecan GAGs are not involved in FGF-18 binding. FGF-18 bound equally to recombinant domains I-III of perlecan (Alt1) and to full-length perlecan purified from the growth plate. Additionally, FGF-18 bound equally to recombinant domain III of perlecan, to Alt1 and to Alt2 (a domain I-III variant with no heparan sulfate). Therefore, binding sites for FGF-18 are present in domain III of perlecan.Affinity chromatography isolated histone H3 as a perlecan-binding protein from the chondrocyte matrix. CAF assays confirmed the interaction as specific, dependent primarily on HS chains of perlecan, although CS chains and the perlecan core were also involved. Immunohistochemistry detected perlecan and histone H3 colocalized in growth plate cartilage. These results can help us better understand the growth factor-independent control that perlecan exerts on endochondral ossification and, therefore, long bone growth.
502
Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2007.
504
Includes bibliographical references.
516
Text (Electronic dissertation) in PDF format.
538
System requirements: World Wide Web browser and PDF reader.
Mode of access: World Wide Web.
500
Title from PDF of title page.
Document formatted into pages; contains 168 pages.
Includes vita.
590
Advisor: John R. Hassell, Ph.D.
653
Cartilage.
Endochondral.
FGF.
FGFR.
HSPG2.
0 690
Dissertations, Academic
z USF
x Molecular Medicine
Doctoral.
773
t USF Electronic Theses and Dissertations.
856
u http://digital.lib.usf.edu/?e14.2155



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T h e P r o t e o g l y c a n P e r l e c a n R e g u l a t e s L o n g B o n e G r o w t h T h r o u g h I n t e r a c t i o n s w i t h D e v e l o p m e n t a l P r o t e i n s i n t h e G r o w t h P l a t e b y S i m o n e M a r s h a L e e S m i t h A d i s s e r t a t i o n s u b m i t t e d i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D o c t o r o f P h i l o s o p h y D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r M e d i c i n e C o l l e g e o f M e d i c i n e U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a M a j o r P r o f e s s o r : J o h n R H a s s e l l P h D P a u l G o t t s c h a l l P h D W i l l i a m R G o w e r J r P h D D a v i d M o r g a n P h D D a t e o f A p p r o v a l J u l y 6 2 0 0 7 K e y w o r d s : c a r t i l a g e e n d o c h o n d r a l f g f f g f r h s p g 2 C o p y r i g h t 2 0 0 7 S i m o n e S m i t h

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D e d i c a t i o n T h i s d i s s e r t a t i o n i s f o r m y f a m i l y i n J a m a i c a h e r e i n t h e U S a n d e v e r y w h e r e e l s e M y p a r e n t s s i s t e r s b r o t h e r n i e c e a n d a l l t h e f a m i l y a n d f r i e n d s w h o i n s p i r e a n d s u p p o r t m e I d e d i c a t e t h i s t o y o u R e m e m b e r T he bi gge s t adv e nt ur e y ou c an e v e r t ak e i s t o l i v e t he l i f e of y our dr e am s T hi nk l i k e k i ngs and que e ns no t af r ai d t o f ai l ; f ai l ur e i s anot he r s t e ppi ng s t one t o gr e at ne s s O pr a h!

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A c k n o w l e d g e m e n t s I c o u l d n e v e r h a v e c o m p l e t e d t h i s d i s s e r t a t i o n w i t h o u t t h e s u p p o r t o f m y f a m i l y M y p a r e n t s A u b r e y a n d J a c k i e I a m g r a t e f u l f o r t h e a c c e p t a n c e y o u h a v e s h o w n e v e n w h e n y o u p r o b a b l y d i d n t k n o w h o w o r w h e n g r a d u a t e s c h o o l f o r m e w o u l d e n d M y s i s t e r s S a n a n d S h e n a n d m y b r o t h e r K i s h y o u a r e ( a l m o s t ) a l l g r o w n u p a n d I c a n n o t w a i t t o s e e w h a t y o u r f u t u r e s w i l l b r i n g I a m s o t h a n k f u l f o r ( a n d p r o u d o f ) t h e t h r e e o f y o u M y b e a u t i f u l a n d b r i l l i a n t n i e c e S e r a y a h a m i l l i o n t h a n k s f o r t h e u n e x p e c t e d b u t i n v a l u a b l e l i f e l e s s o n s y o u h a v e t a u g h t a l l o f u s M y m e n t o r D r H a s s e l l t h a n k y o u f o r y o u r e x p e r t g u i d a n c e o v e r t h e y e a r s B r a d K a n e i t h a s r e a l l y b e e n f u n i n t h e l a b ; t h a n k y o u f o r a l l y o u r h e l p T o f o r m e r H a s s e l l l a b m e m b e r s B r i d g e t t e K u r t L e i g h a n d P r a s a n t h i I a p p r e c i a t e e v e r y s e c o n d t h a t e a c h o f y o u s p e n t t o e n t e r t a i n g u i d e h e l p a n d ( e s p e c i a l l y P r a s a n t h i ) i n s t r u c t m e T o D e b b i e H e l e n K a t h y a n d S u s a n t h a n k y o u f o r b e i n g s o c o m p e t e n t a n d c a r i n g T o t h e p r o f e s s o r s ( e s p e c i a l l y D r s B l a n c k G o t t s c h a l l G o w e r K e l l e r M o r g a n a n d S o l o m o n s o n ) f o r y o u r h e l p o v e r t h e y e a r s t h a n k y o u a l l Sc i e nc e has gr e at be aut y A s c i e nt i s t i n he r l abor at or y i s not onl y a t e c hni c i an: s he i s al s o a c hi l d pl ac e d be f or e nat ur al phe nom e na w hi c h i m pr e s s he r l i k e a f ai r y t al e M a r i e C ur i e F r e nc h ( P ol i s h bo r n) c he m i s t & phys i c i s t ( 1 867 1934 )

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N o t e t o R e a d e r T h e o r i g i n a l o f t h i s d o c u m e n t c o n t a i n s c o l o r t h a t i s n e c e s s a r y f o r u n d e r s t a n d i n g t h e d a t a T h e o r i g i n a l d i s s e r t a t i o n i s o n f i l e w i t h t h e U S F l i b r a r y i n T a m p a F l o r i d a

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i T a b l e o f C o n t e n t s L i s t o f F i g u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i i i A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v i C H A P T E R O N E : I N T R O D U C T I O N T h e G r o w t h P l a t e a n d L o n g B o n e G r o w t h . . . . . . . . . . . . 1 H o w L o n g i t u d i n a l B o n e G r o w t h O c c u r s . . . . . . . . . . . . . 1 2 P e r l e c a n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 F i b r o b l a s t G r o w t h F a c t o r ( F G F ) 2 . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 F G F 1 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 H i s t o n e H 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 O u t l i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 R e f e r e n c e s F o r I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 C H A P T E R T W O : P A P E R S P a p e r I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 P a p e r I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 3 P a p e r I I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 C H A P T E R T H R E E : C O N C L U S I O N S C o n c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 1 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 4

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i i A p p e n d i x : F o c u s o n P e r l e c a n F o c u s o n P e r l e c a n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 2 A b o u t t h e A u t h o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E n d P a g e

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i i i L i s t o f F i g u r e s F i g u r e 1 L o c a t i o n a n d o r g a n i z a t i o n o f t h e g r o w t h p l a t e . . . . 2 F i g u r e 2 S t r u c t u r e o f p e r l e c a n s h o w i n g i t s 5 d o m a i n s a n d t h e a t t a c h e d G A G s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 F i g u r e 3 B i o s y n t h e s i s o f P e r l e c a n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 F i g u r e 4 M o r p h o l o g y o f w i l d t y p e ( a c e ) v e r s u s h s p g 2 n u l l ( b d f ) m i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 F i g u r e 5 B i n d i n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 t o p e r l e c a n i n t h e c a t i o n i c f i l t r a t i o n ( C A F ) a s s a y . . . . . . . . . . . . . 6 9 F i g u r e 6 E f f e c t o f c h o n d r o i t i n a s e o r h e p a r i t i n a s e p r e t r e a t m e n t o f p e r l e c a n o n s p e c i f i c b i n d i n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 i n t h e C A F a s s a y . . . . . . . . . . . . 7 0 F i g u r e 7 E f f e c t o f c h o n d r o i t i n s u l f a t e o r h e p a r a n s u l f a t e o n s p e c i f i c F G F 2 b i n d i n g i n t h e C A F a s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 F i g u r e 8 B i n d i n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 t o p e r l e c a n i n t h e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a s s a y . . . . . . . . . . . . . 7 2 F i g u r e 9 E f f e c t s o f c h o n d r o i t i n a s e a n d h e p a r i t i n a s e p r e t r e a t m e n t o f p e r l e c a n o n [ 1 2 5 I ] F G F 2 b i n d i n g u s i n g t h e I P a s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3 F i g u r e 1 0 B i n d i n g o f F G F 2 t o s o l u b l e F G F R 1 c a n d F G F R 3 c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4 F i g u r e 1 1 H e p a r i n a n d p e r l e c a n a u g m e n t a t i o n o f [ 3 H ] t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n i n t o F G F 2 t r e a t e d B a F 3 c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 5

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i v F i g u r e 1 2 H y p o t h e t i c a l m o d e l o f F G F 2 b i n d i n g t o p e r l e c a n a n d d e l i v e r y t o F G F r e c e p t o r . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 F i g u r e 1 3 S a t u r a t i o n b i n d i n g o f 1 2 5 I F G F 1 8 t o g r o w t h p l a t e p e r l e c a n i n t h e c a t i o n i c f i l t r a t i o n ( C A F ) a s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 9 F i g u r e 1 4 E f f e c t o f c h o n d r o i t i n a s e o r h e p a r i t i n a s e p r e t r e a t m e n t o f g r o w t h p l a t e p e r l e c a n o n 1 2 5 I F G F 1 8 b i n d i n g u s i n g t h e C A F a s s a y . . . . . . . . 1 0 0 F i g u r e 1 5 E f f e c t s o f c h o n d r o i t i n a s e a n d h e p a r i t i n a s e p r e t r e a t m e n t o f p e r l e c a n o n 1 2 5 I F G F 1 8 b i n d i n g u s i n g t h e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a s s a y . . . . . 1 0 1 F i g u r e 1 6 E f f e c t o f g r o w t h p l a t e p e r l e c a n c o r e p r o t e i n d e n a t u r a t i o n a n d r e d u c t i o n / a l k y l a t i o n o n 1 2 5 I F G F 1 8 b i n d i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 F i g u r e 1 7 B i n d i n g o f 1 2 5 I F G F 1 8 t o n a t i v e f u l l l e n g t h p e r l e c a n a n d t o r e c o m b i n a n t p e r l e c a n d o m a i n s I I I I i n t h e C A F a s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 3 F i g u r e 1 8 B i n d i n g o f 1 2 5 I F G F 1 8 t o d i f f e r e n t p e r l e c a n d o m a i n s i n t h e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a s s a y . . 1 0 4 F i g u r e 1 9 A f f i n i t y p u r i f i c a t i o n o f p e r l e c a n s b i n d i n g p a r t n e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 F i g u r e 2 0 C a t i o n i c F i l t r a t i o n ( C A F ) A s s a y s s h o w t h a t p e r l e c a n b i n d s t o 1 2 5 I h i s t o n e H 3 . . . . . . . . . . . 1 2 5 F i g u r e 2 1 E f f e c t o f c h o n d r o i t i n a s e a n d h e p a r i t i n a s e p r e t r e a t m e n t o n t h e b i n d i n g o f p e r l e c a n t o 1 2 5 I h i s t o n e H 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 6 F i g u r e 2 2 I m m u n o l o c a l i z a t i o n o f H i s t o n e H 3 a n d P e r l e c a n i n t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e . . . . . . 1 2 7 F i g u r e 2 3 D i f f e r r i n g a f f i n i t i e s o f F G F 1 8 a n d F G F 2 f o r G r o w t h P l a t e P e r l e c a n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 8

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v F i g u r e 2 4 P e r l e c a n c o r e p r o t e i n : D e t e r m i n e d d o m a i n s t r u c t u r e a n d G A G a t t a c h m e n t . . . . . . . . . . . . . 1 6 8

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vi T h e P r o t e o g l y c a n P e r l e c a n R e g u l a t e s L o n g B o n e G r o w t h t h r o u g h I n t e r a c t i o n s w i t h R e g u l a t o r y P r o t e i n s i n t h e D e v e l o p i n g G r o w t h P l a t e S i m o n e M a r s h a L e e S m i t h A B S T R A C T P e r l e c a n i s t h e m a j o r h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n ( H S P G ) i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e a n d i s c r i t i c a l f o r g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d p r o p e r s k e l e t a l d e v e l o p m e n t I t s c o r e p r o t e i n a n d a t t a c h e d c h o n d r o i t i n s u l f a t e ( C S ) a n d h e p a r a n s u l f a t e ( H S ) c h a i n s m e d i a t e i n t e r a c t i o n s w i t h m a n y d i v e r s e p r o t e i n s F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) 2 a n d F G F 1 8 a r e o t h e r r e g u l a t o r s o f c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n i n t h e g r o w t h p l a t e A d d i t i o n a l l y F G F 1 8 c o n t r o l s t h e h y p e r t r o p h y a n d c a r t i l a g e v a s c u l a r i z a t i o n n e c e s s a r y f o r e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n T h e r e s e a r c h p r e s e n t e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n a i m e d t o i d e n t i f y k n o w n a n d n o v e l p e r l e c a n b i n d i n g p r o t e i n s t h a t a r e e n d o g e n o u s t o t h e g r o w t h p l a t e a n d t o c h a r a c t e r i z e t h e i r i n t e r a c t i o n s w i t h p e r l e c a n F G F 2 ( k n o w n t o b i n d H S P G s ) b o u n d t o p e r l e c a n i n b o t h a c a t i o n i c f i l t r a t i o n ( C A F ) a s s a y a n d a n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a s s a y p r i m a r i l y v i a t h e H S c h a i n s o n p e r l e c a n W h e n d i g e s t e d w i t h c h o n d r o i t i n a s e A B C t o r e m o v e i t s C S c h a i n s p e r l e c a n a u g m e n t e d b i n d i n g o f F G F 2 t o t h e F G F R 1 a n d F G F R 3 r e c e p t o r s a n d i n c r e a s e d F G F 2 s t i m u l a t e d p r o l i f e r a t i o n i n B a F 3 c e l l s e x p r e s s i n g

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vi i t h e s e F G F r e c e p t o r s T h u s g r o w t h p l a t e p e r l e c a n b i n d s t o F G F 2 b y i t s H S c h a i n s b u t c a n o n l y d e l i v e r F G F 2 t o F G F r e c e p t o r s w h e n i t s C S c h a i n s a r e r e m o v e d F G F 1 8 ( k n o w n t o b i n d t o h e p a r i n a n d t o h e p a r a n s u l f a t e f r o m s o m e s o u r c e s ) b o u n d t o g r o w t h p l a t e p e r l e c a n T h i s b i n d i n g w a s u n c h a n g e d b y c h o n d r o i t i n a s e o r h e p a r i t i n a s e d i g e s t i o n o f p e r l e c a n i n d i c a t i n g t h a t p e r l e c a n G A G s a r e n o t i n v o l v e d i n F G F 1 8 b i n d i n g F G F 1 8 b o u n d e q u a l l y t o r e c o m b i n a n t d o m a i n s I I I I o f p e r l e c a n ( A l t 1 ) a n d t o f u l l l e n g t h p e r l e c a n p u r i f i e d f r o m t h e g r o w t h p l a t e A d d i t i o n a l l y F G F 1 8 b o u n d e q u a l l y t o r e c o m b i n a n t d o m a i n I I I o f p e r l e c a n t o A l t 1 a n d t o A l t 2 ( a d o m a i n I I I I v a r i a n t w i t h n o h e p a r a n s u l f a t e ) T h e r e f o r e b i n d i n g s i t e s f o r F G F 1 8 a r e p r e s e n t i n d o m a i n I I I o f p e r l e c a n A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y i s o l a t e d h i s t o n e H 3 a s a p e r l e c a n b i n d i n g p r o t e i n f r o m t h e c h o n d r o c y t e m a t r i x C A F a s s a y s c o n f i r m e d t h e i n t e r a c t i o n a s s p e c i f i c d e p e n d e n t p r i m a r i l y o n H S c h a i n s o f p e r l e c a n a l t h o u g h C S c h a i n s a n d t h e p e r l e c a n c o r e w e r e a l s o i n v o l v e d I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y d e t e c t e d p e r l e c a n a n d h i s t o n e H 3 c o l o c a l i z e d i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e T h e s e r e s u l t s c a n h e l p u s b e t t e r u n d e r s t a n d t h e g r o w t h f a c t o r i n d e p e n d e n t c o n t r o l t h a t p e r l e c a n e x e r t s o n e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n a n d t h e r e f o r e l o n g b o n e g r o w t h

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1 C H A P T E R O N E I N T R O D U C T I O N T h e G r o w t h P l a t e a n d L o n g B o n e G r o w t h T h e g r o w t h p l a t e i s t h e p r i n c i p a l r e g u l a t o r o f l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h i n h u m a n s a n d a n i m a l s L o n g i t u d i n a l g r o w t h i s c o n t r o l l e d b y m u l t i p l e e n v i r o n m e n t a l g e n e t i c h o r m o n a l a n d n u t r i t i o n a l f a c t o r s T o g e t h e r t h e s e f a c t o r s d e t e r m i n e a d u l t h e i g h t b y i n f l u e n c i n g t h e p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f c h o n d r o c y t e s i n t h e g r o w t h p l a t e T h e r e g i o n o f c a r t i l a g e k n o w n a s t h e g r o w t h p l a t e i s p r e s e n t o n l y i n b o n e s t h a t f o r m t h r o u g h a c a r t i l a g e p r e c u r s o r t h a t i s b y e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n I n t h e s e e n d o c h o n d r a l b o n e s ( s u c h a s t h e m a n d i b l e r i b s l i m b s a n d d i g i t s ) a g r o w t h p l a t e i s s i t u a t e d b e t w e e n t h e e p i p h y s e a l a n d m e t a p h y s e a l r e g i o n s o f b o n e a t t h e d i s t a l e n d s o f t h e l o n g b o n e s ( F i g u r e 1 ) T h e G r o w t h P l a t e 1 a O r i g i n T h e f o r m a t i o n o f c h o n d r o c y t e s ( c h o n d r o g e n e s i s ) i s a h i g h l y r e g u l a t e d p r o c e s s T h e c h o n d r o p r o g e n i t o r c e l l s a r e m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s ( M S C s ) T h e M S C s a r i s e f r o m d i f f e r e n t l o c a t i o n s d e p e n d i n g o n t h e i r t a r g e t s i n e m b r y o g e n e s i s F o r e x a m p l e c e l l s t h a t w i l l b e c o m e c h o n d r o c y t e s i n v e r t e b r a e a n d r i b s o r i g i n a t e f r o m t h e p a r a x i a l m e s o d e r m w h e r e a s c e l l s d e s t i n e d f o r l i m b c a r t i l a g e

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2 o r i g i n a t e f r o m t h e l a t e r a l m e s o d e r m ( d e C r o m b r u g g h e L e f e b v r e e t a l 2 0 0 0 ) I n t h e e m b r y o e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n i n i t i a t e s w i t h M S C c o n d e n s a t i o n ( t h a t i s t h e M S C s f o r m c l u s t e r s a n d a d h e r e v i a a d h e s i o n m o l e c u l e s ) ( H a l l a n d M i y a k e 2 0 0 0 ) a n d p r o g r e s s e s t o t h e s u b s e q u e n t d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e M S C s i n t o c h o n d r o g e n i c c e l l s E v e n a f t e r d e v e l o p m e n t e n d s M S C s a r e k n o w n t o p e r s i s t a s s t e m c e l l s i n t h e b o n e m a r r o w o f a d u l t m a m m a l s w h e r e t h e y r e t a i n t h e c a p a c i t y t o b e c o m e c h o n d r o c y t e s ( M a g n e J u l i e n e t a l 2 0 0 5 ) F i g u r e 1 : L o c a t i o n a n d o r g a n i z a t i o n o f t h e g r o w t h p l a t e F r o m v a n d e r E e r d e n B C J e t a l E n d o c r R e v 2 0 0 3 ; 2 4 : 7 8 2 8 0 1 A s i n a d i p o g e n e s i s m y o g e n e s i s o r o s t e o g e n e s i s M S C d i f f e r e n t i a t i o n i n t o c h o n d r o c y t e s i s c o n t r o l l e d b y D N A t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s I n c h o n d r o g e n e s i s t h i s f a c t o r i s S o x 9 ( O l s e n R e g i n a t o e t a l 2 0 0 0 ) M S C s i n r e s p o n s e t o T G F a n d f i b r o n e c t i n s t a r t f o r m i n g p r e c h o n d r o c y t i c c o n d e n s a t i o n s a t d i f f e r e n t s i t e s i n t h e e m b r y o T h i s o c c u r s a t a r o u n d m i d g e s t a t i o n ( ~ E 1 0 5 ) i n m i c e

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3 ( L e f e b v r e L i e t a l 1 9 9 8 ) B y E 1 2 5 c a r t i l a g e i s f o r m i n g a c t i v e l y i n a l l d e s t i n e d c a r t i l a g i n o u s ( s u c h a s e a r a n d n o s e c a r t i l a g e ) a n d e n d o c h o n d r a l ( s u c h a s r i b a n d l i m b b o n e ) s t r u c t u r e s I n i n t r a m e m b r a n o u s o s s i f i c a t i o n ( w h i c h g i v e s r i s e t o b o n e s s u c h a s t h e f l a t b o n e s o f t h e s k u l l ) t h e c o n d e n s e d c e l l s d i f f e r e n t i a t e i n t o b o n e f o r m i n g o s t e o b l a s t s w h i c h t h e n s e c r e t e a b o n y m a t r i x r i c h i n t y p e 1 c o l l a g e n H o w e v e r i n t h e m o r e c o m m o n e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n t h e c e l l s i n t h e m i d d l e o f t h e c o n d e n s a t i o n c l u s t e r b e c o m e c h o n d r o c y t e s a n d c e l l s o n t h e b o r d e r f o r m a p e r i c h o n d r i u m S c i e n t i s t s f i r s t r e a l i z e d t h e i m p o r t a n c e o f S o x 9 i n c h o n d r o g e n e s i s o n d i s c o v e r i n g S o x 9 m u t a t i o n s a s t h e e t i o l o g y f o r c a m p o m e l i c d y s p l a s i a ( C D ) C D i s a r a r e s e v e r e l e t h a l d w a r f i s m i n h u m a n s ( F o s t e r D o m i n g u e z S t e g l i c h e t a l 1 9 9 4 ; W a g n e r W i r t h e t a l 1 9 9 4 ) C D p a t i e n t s h a v e a b n o r m a l i t i e s i n e s s e n t i a l l y a l l c a r t i l a g e d e r i v e d b o n e s i n c l u d i n g t h e c r a n i o f a c i a l b o n e s v e r t e b r a l c o l u m n r i b s a n d l i m b s T h e b o w e d a n g u l a t e d b o n e s a n d o t h e r s k e l e t a l d e f e c t s o f C D p a t i e n t s r e s u l t f r o m d e f e c t i v e c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n w i t h i n t h e M S C c o n d e n s a t i o n s a n d t h e r e s u l t i n g d e f i c i e n t p r o d u c t i o n o f c h o n d r o c y t e s T h e S o x 9 g e n e i s u b i q u i t o u s i n c h o n d r o p r o g e n i t o r c e l l s a n d i n t h e c h o n d r o c y t e s t h e y b e c o m e ( d e C r o m b r u g g h e L e f e b v r e e t a l 2 0 0 0 ) S o x 9 c o n t a i n s a D N A b i n d i n g d o m a i n a n d a s t r o n g t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t i o n d o m a i n m a k i n g i t a p o t e n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r t h a t b i n d s t o t h e g e n e s f o r c h o n d r o c y e s p e c i f i c m a r k e r s s u c h a s c o l l a g e n T y p e I I a n d a g g r e c a n I f S o x 9 i s m u t a t e d o r a b s e n t i n m o u s e m o d e l s t h e s e m a r k e r p r o t e i n s a r e n o t e x p r e s s e d i n t h e M S C a n d a b l o c k o c c u r s a t t h e p o i n t w h e r e c o n d e n s a t i o n w o u l d n o r m a l l y o c c u r ( d e C r o m b r u g g h e L e f e b v r e e t a l 2 0 0 0 ) m a k i n g t h e c e l l s u n a b l e t o d i f f e r e n t i a t e i n t o c h o n d r o g e n i c p r e c u r s o r s e v e n t h o u g h t h e i r m i g r a t i o n t o t h e w o u l d b e c o n d e n s a t i o n s i t e i s u n a f f e c t e d ( B i

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4 D e n g e t a l 1 9 9 9 ) T h e p e r i c h o n d r i u m i s t h e o n l y f i n a l l o c a t i o n o f s u c h S o x 9 n u l l c e l l s ; t h e M S C s t h u s m i g r a t e t o t h e c o n d e n s a t i o n c e n t e r f i n e w i t h o u t S o x 9 b u t d o n o t d i f f e r e n t i a t e i n t o c h o n d r o c y t e s w i t h o u t S o x 9 d r i v i n g i t s c h o n d r o c y t e s p e c i f i c g e n e t i c p r o g r a m 1 b G r o w t h P l a t e S t r u c t u r e T h e g r o w t h p l a t e c o n t a i n s o n l y o n e t y p e o f c e l l t h e c h o n d r o c y t e H o w e v e r t h e c h o n d r o c y t e s a r e o f t h r e e d i f f e r e n t s u b t y p e s c o m p r i s i n g t h e t h r e e d i s t i n c t h o r i z o n t a l l a y e r s o f t h e g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e t h e r e s t i n g ( w h e r e t h e s t e m c e l l s a r e ) p r o l i f e r a t i v e a n d p r e h y p e r t r o p h i c / h y p e r t r o p h i c z o n e s ( F i g u r e 1 ) T h e g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e e x i s t s o n l y d u r i n g t h e g r o w t h p e r i o d o f m o s t a n i m a l s f o r e x a m p l e u p t o p u b e r t y i n h u m a n s A f t e r t h e g r o w t h p e r i o d t h e c a r t i l a g e i s c o m p l e t e l y r e s o r b e d a n d r e p l a c e d b y b o n e T h e t h r e e t y p e s o f c h o n d r o c y t e s i n t h e g r o w t h p l a t e a r e b i o c h e m i c a l l y f u n c t i o n a l l y a n d m o r p h o l o g i c a l l y d i s t i n c t T h e m o s t e p i p h y s e a l o f t h e z o n e s i s t h e r e s t i n g z o n e H e r e c h o n d r o c y t e s a r e s m a l l e s t r a r e l y m i t o t i c a n d a r e a r r a n g e d i r r e g u l a r l y i n t h e i r s p a r s e c a r t i l a g e m a t r i x T h e r e s t i n g z o n e c e l l s a r e r e l a t i v e l y q u i e s c e n t b u t t h e y a r e c r u c i a l f o r p r o p e r a r r a n g e m e n t o f t h e o t h e r u n d e r l y i n g c o l u m n s o f c e l l s a n d t h u s f o r p r o m o t i o n o f u n i d i r e c t i o n a l l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h T h e r e s t i n g z o n e i s t h o u g h t t o c o n t a i n s t e m l i k e c e l l s w i t h a u n i p o t e n t a b i l i t y t o g e n e r a t e n e w c e l l s o f t h e p r o l i f e r a t i v e z o n e ( H u n z i k e r 1 9 9 4 ) O n s o m e y e t u n k n o w n s t i m u l u s t h e m o r e m a t u r e r e s t i n g c e l l s d i v i d e t o p r o d u c e t w o c e l l s ; o n e r e t a i n s t h e s t e m l i k e r e s t i n g c e l l p h e n o t y p e a n d t h e o t h e r b e c o m e s p r o l i f e r a t i v e U p o n d i v i s i o n o f a c e l l i n t h e p r o l i f e r a t i v e z o n e ( a c e l l t h a t i s n o w f i v e t i m e s b i g g e r t h a n a r e s t i n g c e l l ( N o o n a n H u n z i k e r e t a l 1 9 9 8 ) ) t h e n e w l y f o r m e d c l o n e l i n e s u p p a r a l l e l t o t h e l o n g a x i s o f t h e b o n e T h i s r e s u l t s i n

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5 e x p a n s i o n o f c o l u m n s o f c e l l s o r i e n t e d a l o n g t h e l e n g t h o f t h e b o n e l e a d i n g t o b o n e e l o n g a t i o n T h i s a l i g n m e n t o f t h e p r o l i f e r a t i v e c e l l s i n t o c o l u m n s p a r a l l e l t o t h e e l o n g a t i o n d i r e c t i o n o f t h e b o n e i s d i r e c t e d b y a m o r p h o g e n s y n t h e s i z e d b y r e s t i n g c e l l s ( A b a d M e y e r s e t a l 2 0 0 2 ) I n t h e p r o l i f e r a t i n g z o n e t h e c e l l s n o t o n l y a l i g n i n t o c o l u m n s b u t t h e y a l s o f l a t t e n d i v i d e r a p i d l y a n d s y n t h e s i z e l a r g e a m o u n t s o f e x t r a c e l l u l a r m a t r i x o r E C M ( u p t o 4 6 % m o r e t h a n r e s t i n g c e l l s ) w h i c h i n t u r n m a i n t a i n s t h e s t r u c t u r e o f t h e g r o w t h p l a t e T h e s t i m u l u s f o r p r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e s t o p r o g r e s s t h r o u g h t h e f i n a l m a t u r e p h a s e o f t h e h y p e r t r o p h i c z o n e i s t h o u g h t t o b e e x p o s u r e t o l o c a l g r o w t h f a c t o r s i n t h e g r o w t h p l a t e T h e I n d i a n h e d g e h o g / P a r a t h y r o i d h o r m o n e r e l a t e d p e p t i d e ( I h h / P T H r P ) p a t h w a y c a u s e s p r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e s t o s t o p d i v i d i n g a n d s t a r t d i f f e r e n t i a t i n g t o e n t e r t h e n e x t p h a s e : h y p e r t r o p h y ( M i n i n a K r e s c h e l e t a l 2 0 0 2 ) W i t h t h i s p h a s e a l s o c o m e s a m a r k e d i n c r e a s e i n c e l l s i z e ( a c e l l t h a t i s u p t o t e n t i m e s t h e s i z e o f a r e s t i n g c e l l ) ( N o o n a n H u n z i k e r e t a l 1 9 9 8 ) T h i s t r a n s i t i o n e v e n t u a l l y r e s u l t s i n l a r g e r r o u n d h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s t h a t s e c r e t e v a s t a m o u n t s o f E C M ( u p t o 6 0 % m o r e t h a n a r e s t i n g c e l l ) ( N o o n a n H u n z i k e r e t a l 1 9 9 8 ) i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m a n d v e s i c l e s c o n t a i n i n g c a l c i u m p h o s p h a t e s h y d r o x y a p a t i t e a n d m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s w h i c h a l l c a u s e m i n e r a l i z a t i o n o f t h e c a r t i l a g e E C M i n t h i s h y p e r t r o p h i c z o n e ( N i l s s o n M a r i n o e t a l 2 0 0 5 ) M i n e r a l i z a t i o n c a u s e s b l o o d v e s s e l s t o e n t e r f r o m t h e b o n e a d j a c e n t t o t h e g r o w t h p l a t e T h e v e s s e l s b r i n g i n o s t e o b l a s t s a n d o s t e o c l a s t s : t h e o s t e o c l a s t s d e g r a d e t h e s t r u c t u r e s t h a t p r e v i o u s l y k e p t t h e h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s a r r a n g e d i n c o l u m n s w h i l e t h e o s t e o b l a s t s r e m o d e l t h e s c a f f o l d c r e a t e d b y t h e a p o p t o s e d m i n e r a l i z e d h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s i n t o n e w m e t a p h y s e a l b o n e W i t h t h i s e f f e c t i v e d e l e t i o n o f t h e

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6 t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d h y p e r t r o p h i c c e l l s a n d t h e c r e a t i o n o f b o n e t h e g r o w t h p l a t e s i z e i s m a i n t a i n e d w h e n m a t u r e p r o l i f e r a t i v e c e l l s s t a r t t o b e c o m e h y p e r t r o p h i c m a t u r e r e s t i n g c e l l s b e c o m e p r o l i f e r a t i v e a n d m o r e M S C s c o n d e n s e a n d d i f f e r e n t i a t e i n t o n e w r e s t i n g c e l l s W i t h t h i s c o n t i n u a l r e p l e n i s h m e n t d u r i n g p e r i o d s o f g r o w t h t h e g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e c a u s e s l o n g i t u d i n a l g r o w t h o f e n d o c h o n d r a l b o n e s 1 c E C M P r o t e i n s F r o m t h e r e s t i n g t o t h e h y p e r t r o p h i c z o n e c h o n d r o c y t e s a r e e m b e d d e d i n a m a t r i x k n o w n a s t h e E C M w h i c h i s i n t e g r a l t o b o n e g r o w t h n o t o n l y b y i t s s h e e r a c c u m u l a t i o n b u t a l s o b y t h e v a r i e t y o f m o l e c u l e s t h a t i t c o n t a i n s C o l l a g e n s : T h e p r o l i f e r a t i n g c e l l s e x p r e s s p r i m a r i l y c o l l a g e n t y p e I I ( C o l 2 ) w h i l e t h e p r e h y p e r t r o p h i c c e l l s e x p r e s s C o l 9 a n d t h e h y p e r t r o p h i c c e l l s e x p r e s s C o l 1 0 C o l 2 a n d C o l 9 a r e u n i q u e t o c a r t i l a g e ( W a t a n a b e Y a m a d a e t a l 1 9 9 8 ) M u t a t i n g a n y o f t h e s e c o l l a g e n s c a u s e s w e l l c h a r a c t e r i z e d h u m a n c a r t i l a g e m a t r i x d i s o r d e r s t h a t a l l r e s u l t i n d w a r f i s m F o r e x a m p l e m u t a t i o n s i n h u m a n C o l l a g e n I I c a u s e s k e l e t a l d i s o r d e r s s u c h a s c h o n d r o d y s p l a s i a s e p i p h y s e a l d y s p l a s i a a n d S c h m i d t y p e m e t a p h y s e a l c h o n d r o d y s p l a s i a ( S p r a n g e r W i n t e r p a c h t e t a l 1 9 9 4 ; M u r a g a k i M a r i m a n e t a l 1 9 9 6 ; W a l l i s R a s h e t a l 1 9 9 6 ) M u t a t i o n s i n m o u s e m o d e l s h a v e a l s o s h o w n t h e i m p o r t a n c e o f c o l l a g e n t o l o n g b o n e g r o w t h ( S t a c e y B a t e m a n e t a l 1 9 8 8 ; G a r o f a l o V u o r i o e t a l 1 9 9 1 ; M e t s a r a n t a G a r o f a l o e t a l 1 9 9 2 ) P r o t e o g l y c a n s : C a r t i l a g e a l s o c o n t a i n s v a r i o u s p r o t e o g l y c a n s s u c h a s t h e c e l l s u r f a c e s y n d e c a n a n d g l y p i c a n t h e s m a l l b i g l y c a n d e c o r i n a n d l u m i c a n a n d t h e l a r g e r a g g r e c a n a n d p e r l e c a n ( K n u d s o n a n d K n u d s o n 2 0 0 1 ) A p r o t e o g l y c a n ( P G ) i s c o m p o s e d o f a c o r e

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7 p r o t e i n w i t h g l y c o s a m i n o g l y c a n ( G A G ) c h a i n s c o v a l e n t l y a t t a c h e d ( H a s c a l l C a l a b r o e t a l 1 9 9 4 ) T h e d i f f e r e n t P G s h a v e v a r i o u s t y p e s o f G A G s a t t a c h e d ( f o r e x a m p l e c h o n d r o i t i n h e p a r a n a n d k e r a t a n ) a n d a r e a l l s u l f a t e d ( h e n c e c h o n d r o i t i n s u l f a t e o r C S h e p a r a n s u l f a t e o r H S e t c ) T h e m a j o r c h o n d r o i t i n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n ( C S P G ) i n c a r t i l a g e i s a g g r e c a n T h e m a j o r h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n ( H S P G ) i n c a r t i l a g e i s p e r l e c a n w h i c h i s t h e s u b j e c t o f m y d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h a n d w h i c h I w i l l d i s c u s s i n d e t a i l l a t e r T h e r o l e s o f t h e P G s a r e t o b i n d c a r t i l a g e p r o t e i n s w i t h t h e i r s u l f a t e d G A G g r o u p s a n d w i t h t h e i r c o r e p r o t e i n s t h e r e b y c r o s s l i n k i n g t h e E C M T h e s u l f a t i o n o f t h e s e P G s i s c r u c i a l t h e n f o r c a r t i l a g e i n t e g r i t y a s i s s h o w n i n t h e m a n y s k e l e t a l d y s p l a s i a s t h a t r e s u l t i n d w a r f i s m i f d i a s t r o p h i c d y s p l a s i a s u l f a t e t r a n s p o r t e r ( D T D S T ) a k e y P G s u l f a t i o n e n z y m e i n t h e g r o w t h p l a t e i s m u t a t e d ( R o s s i a n d S u p e r t i F u r g a 2 0 0 1 ) A l s o t h e d i s o r d e r h e r e d i t a r y m u l t i p l e e x o s t o s e s ( H M E ) o c c u r s f r o m t h e m i s e x p r e s s i o n o f t h e E X T 1 o r 2 g e n e s w h i c h e n c o d e g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s t h a t s y n t h e s i z e h e p a r a n s u l f a t e G A G s ( S i m m o n s M u s y e t a l 1 9 9 9 ) H M E p a t i e n t s p r e s e n t w i t h l i m b d e f o r m i t i e s l e g l e n g t h d i s c r e p a n c i e s a n d o t h e r s k e l e t a l d e f e c t s a l l r e s u l t i n g f r o m t h e l o s s o f H S o n t h e c h o n d r o c y t e s a n d t h u s l o s s o f t h e s e G A G s a s c o r e c e p t o r s f o r g r o w t h f a c t o r s r e s u l t i n g i n a b e r r a n t p r o l i f e r a t i o n o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s ( f o r i n s t a n c e w h e r e H S : F G F b i n d i n g i s l o s t ) o r o f d i f f e r e n t i a t i o n o f p r o l i f e r a t i n g t o h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s ( f o r i n s t a n c e w h e r e H S : I h h b i n d i n g i s l o s t ) T h e s p e c i f i c c o r e p r o t e i n s c a n a l s o r e g u l a t e c a r t i l a g e m a i n t a i n i n g p r o c e s s e s s u c h a s c o l l a g e n f i b r i l f o r m a t i o n ( f o r d e c o r i n ) a n d a n c h o r i n g o f t h e c h o n d r o c y t e t o i t s c y t o s k e l e t o n ( f o r s y n d e c a n ) ( B a l l o c k a n d O K e e f e 2 0 0 3 ) P e r l e c a n i s a l s o e s s e n t i a l f o r c a r t i l a g e i n t e g r i t y a n d g r o w t h f a c t o r s i g n a l i n g a s w i l l b e d i s c u s s e d l a t e r

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8 A g g r e c a n a l s o p l a y s a m a j o r r o l e i n c a r t i l a g e W i t h i t s ~ 2 3 0 k D a c o r e p r o t e i n a n d u p t o 1 3 0 G A G c h a i n s ( C S a n d k e r a t a n s u l f a t e o r K S ) a g g r e c a n c a n r e a c h a t o t a l m o l e c u l a r m a s s o f ~ 2 2 0 0 k D a i n s o m e t i s s u e s ( H a s c a l l C a l a b r o e t a l 1 9 9 4 ) C a r t i l a g e m a t r i x d e f i c i e n c y ( C m d ) i n m i c e i s a l e t h a l c h o n d r o d y s p l a s i a t h a t r e s u l t s w h e n t h e a g g r e c a n g e n e i s m u t a t e d T h e c m d m u t a t i o n i n t h e g l o b u l a r d o m a i n I o f a g g r e c a n i s l e t h a l w h e n h o m o z y g o u s c a u s i n g e a r l y p o s t n a t a l d e a t h f r o m r e s p i r a t o r y f a i l u r e ( R i t t e n h o u s e D u n n e t a l 1 9 7 8 ; W a t a n a b e K i m a t a e t a l 1 9 9 4 ) T h e s e m i c e w i t h 4 1 % o f t h e n o r m a l a g g r e c a n m R N A h a v e s h o r t s n o u t s c l e f t p a l a t e s k e l e t a l d w a r f i s m a n d m i s a l i g n e d s p i n e s d u e t o t h e a b s e n c e o f a g g r e c a n i n t h e i r c a r t i l a g e T h e c h o n d r o c y t e s i n t h e c m d n u l l g r o w t h p l a t e s a r e i r r e g u l a r l y p a c k e d t o g e t h e r w i t h r o u g h c o l l a g e n f i b r i l s a r r a n g e d a r o u n d t h e m T h i s d i s o r g a n i z e s t h e c e l l s i n c o m p a r i s o n t o t h e o r d e r l y c o l u m n a r a r r a n g e m e n t o f c h o n d r o c y t e s i n w i l d t y p e I t i s n o t s u r p r i s i n g t h e n t h a t t h e s e m i c e h a v e r e d u c e d g r o w t h o f t h e i r l o n g b o n e s A n o t h e r m u t a t i o n i n t h e a g g r e c a n g e n e i n c h i c k e n s r e s u l t s i n t h e c h o n d r o d y s p l a s i a k n o w n a s n a n o m e l i a ( L i S c h w a r t z e t a l 1 9 9 3 ) T h e n a n o m e l i c c h i c k s h o w s s i m i l a r c a r t i l a g e a n d b o n e d e f e c t s a s t h e c m d m o u s e i e d y s m o r p h i c c a r t i l a g e d w a r f i s m a n d l e t h a l i t y T h e m u t a t i o n i s i n t h e e x o n c o d i n g f o r t h e C S a t t a c h m e n t r e g i o n i n a g g r e c a n r e s u l t i n g i n a t r u n c a t e d p r o t e i n t h a t c a n n o t a c c e p t C S c h a i n s W i t h o u t t h i s C S d o m a i n a g g r e c a n c a n n o t p r o m o t e c h o n d r o c y t e E C M i n t e g r i t y a n d t h e c a r t i l a g e p r e c u r s o r a n d t h u s t h e s u b s e q u e n t b o n e i s d i s r u p t e d G r o w t h F a c t o r s : T h e E C M i s a r e s e r v o i r o f g r o w t h f a c t o r s t h a t a r e e i t h e r m a d e i n t h e g r o w t h p l a t e o r t r a n s p o r t e d t h e r e b o u n d b y o t h e r E C M p r o t e i n s a n d r e l e a s e d t o a f f e c t c h o n d r o c y t e a c t i v i t y ( v a n d e r E e r d e n K a r p e r i e n e t a l 2 0 0 3 ) I n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o r

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9 ( I G F ) 1 e x e r t s s u b s t a n t i a l c o n t r o l o v e r l o n g b o n e g r o w t h I G F d e f i c i e n c y c a u s e s f e t a l g r o w t h r e t a r d a t i o n a n d p o s t n a t a l g r o w t h f a i l u r e i n h u m a n s ( C a m a c h o H u b n e r W o o d s e t a l 1 9 9 9 ) a n d m i c e ( M o h a n R i c h m a n e t a l 2 0 0 3 ) s i n c e I G F 1 s t i m u l a t e s b o t h e x p a n s i o n o f p r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e s a n d c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y T h e T G F f a m i l y o f b o n e m o r p h o g e n e t i c p r o t e i n s ( B M P s ) a r e a l s o c r u c i a l i n b o n e g r o w t h w i t h r o l e s i n s k e l e t a l a p o p t o s i s c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n f o r m a t i o n o f h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s a n d o t h e r a s p e c t s o f s k e l e t o g e n e s i s ( M a c i a s G a n a n e t a l 1 9 9 7 ) T h e B M P s a n d t h e i r r e c e p t o r s a r e e x p r e s s e d l o c a l l y i n t h e g r o w t h p l a t e a n d a r e n e c e s s a r y f o r p r o p e r c h o n d r o g e n e s i s ( Z o u W i e s e r e t a l 1 9 9 7 ; Y i D a l u i s k i e t a l 2 0 0 0 ) I h h a n d P T H r P a r e o t h e r E C M m o l e c u l e s m a d e l o c a l l y i n t h e g r o w t h p l a t e I h h i s f r o m t h e h e d g e h o g f a m i l y o f m o r p h o g e n s w i t h c i t i t i c a l r o l e s i n e m b r y o n i c f o r m a t i o n a n d d e v e l o p m e n t P r e h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s e x p r e s s I h h w h e r e i t r e g u l a t e s t h e r a t e o f c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n f r o m p r o l i f e r a t i v e t o h y p e r t r o p h i c z o n e s ( V o r t k a m p L e e e t a l 1 9 9 6 ) B l o c k e d h y p e r t r o p h y r e s u l t s i f t h i s I h h i s m u t a t e d S t J a c q u e s e t a l ( S t J a c q u e s H a m m e r s c h m i d t e t a l 1 9 9 9 ) s h o w e d t h a t I h h n u l l m i c e n o t o n l y s h o w e d t h i s r e d u c e d d i f f e r e n t i a t i o n o f p r o l i f e r a t i v e i n t o h y p e r t r o p h i c c e l l s b u t w e r e a l s o d w a r f s w i t h d r a s t i c r e d u c t i o n s i n c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d o s t e o b l a s t f o r m a t i o n I h h i s t h e r e f o r e a k e y g r o w t h f a c t o r f o r t h e c o u p l i n g o f c h o n d r o g e n e s i s a n d o s t e o g e n e s i s ( K a r p S c h i p a n i e t a l 2 0 0 0 ) I h h i s a n u p s t r e a m p o s i t i v e r e g u l a t o r o f P T H r P a n d a c t s t h r o u g h P T H r P t o c o n t r o l c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n b u t i n d e p e n d e n t l y o f i t t o c o n t r o l p r o l i f e r a t i o n P T H r P n e g a t i v e l y r e g u l a t e s c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n : m i c e w i t h n o P T H r P h a d a b n o r m a l l y r a p i d

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10 d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e p r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e s i n t o h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s w h i c h c a u s e d d w a r f i s m d u e t o t h e c h o n d r o c y t e s r e d u c e d p r o l i f e r a t i v e t i m e ( K a r a p l i s L u z e t a l 1 9 9 4 ) T h e f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r s ( F G F s ) a r e a n o t h e r s u b s e t o f p r o t e i n s i n t h e E C M o f c a r t i l a g e T h i s 2 3 m e m b e r f a m i l y u s e s a t l e a s t f o u r r e c e p t o r s ( F G F R 1 t o 4 ) a n d s p l i c e v a r i a n t s o f e a c h t o r e g u l a t e b o n e d e v e l o p m e n t ( O r n i t z a n d M a r i e 2 0 0 2 ) F G F 2 9 a n d 1 8 a n d F G F R 1 2 a n d 3 a r e a l l e x p r e s s e d i n t h e g r o w t h p l a t e o r i t s s u r r o u n d i n g p e r i c h o n d r i u m F G F 2 d e c r e a s e s c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n h y p e r t r o p h y a n d m a t r i x s y n t h e s i s ( M a n c i l l a D e L u c a e t a l 1 9 9 8 ) F G F 2 n u l l m i c e h o w e v e r h a v e n o s e v e r e l o n g b o n e g r o w t h p h e n o t y p e s h o w i n g o n l y m i l d a d u l t o n s e t o s t e o p e n i a a n d s o m e r e d u c e d b o n e d e n s i t y ( M o n t e r o O k a d a e t a l 2 0 0 0 ) I n t e r e s t i n g l y m i c e w i t h a t a r g e t e d o v e r e x p r e s s i o n o f F G F 2 o n g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s a r e d w a r f s ( C o f f i n F l o r k i e w i c z e t a l 1 9 9 5 ) F G F 2 i s m a d e b y g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s ( L u a n P r a u l e t a l 1 9 9 6 ) a n d s i g n a l s p r i m a r i l y t h r o u g h F G F R 1 i n c a r t i l a g e ( W e h a v e s t u d i e d p e r l e c a n m e d i a t e d F G F 2 s i g n a l i n g t h r o u g h F G F R 1 a n d 3 i n o u r r e s e a r c h O u r f i n d i n g s a r e r e p o r t e d i n P a p e r I I o f t h i s d i s s e r t a t i o n ) F G F 9 i s a l s o m a d e b y g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s w h e r e i t s t i m u l a t e s g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d i n h i b i t s t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n ( i e d i f f e r e n t i a t i o n o f p r o l i f e r a t i v e i n t o h y p e r t r o p h i c c e l l s ) M i c e o v e r e x p r e s s i n g F G F 9 a r e a l s o d w a r v e s e x h i b i t i n g i n c r e a s e d c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n b u t n o n e o f t h e d i f f e r e n t i a t i o n n e c e s s a r y t o f o r m t h e m a t r i x s c a f f o l d f o r n e w b o n e ( G a r o f a l o K l i g e r S p a t z e t a l 1 9 9 9 ) F G F 1 8 i s e x p r e s s e d i n p e r i c h o n d r i u m a n d i s k n o w n t o s i g n a l t h r o u g h F G F R 3 t o s t i m u l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n ( D a v i d s o n B l a n c e t a l 2 0 0 5 ) F G F 1 8 n u l l m i c e h a v e r e d u c e d p r o l i f e r a t i o n o f t h e i r g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s w h i c h r e s u l t s i n s h o r t b o n e s T h e y a l s o e x h i b i t

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11 r i b c a g e d e f o r m i t i e s d e l a y e d o s s i f i c a t i o n o f e n d o c h o n d r a l b o n e s a n d r e d u c e d t r a n s i t i o n o f p r o l i f e r a t i v e c h o n d r o c y t e s t o a h y p e r t r o p h i c p h e n o t y p e ( L i u X u e t a l 2 0 0 2 ; O h b a y a s h i S h i b a y a m a e t a l 2 0 0 2 ; L i u L a v i n e e t a l 2 0 0 6 ) V E G F i s a n o t h e r i m p o r t a n t g r o w t h f a c t o r i n t h e g r o w t h p l a t e E C M I n c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y t h e E C M a r o u n d h y p e r t r o p h i c c e l l s i s i n c r e a s i n g l y c a l c i f i e d a l l o w i n g b l o o d v e s s e l s t o i n v a d e t h e g r o w t h p l a t e f r o m t h e u n d e r l y i n g m e t a p h y s e a l b o n e V E G F i s e x p r e s s e d i n t h e s e h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s w h e r e i t p r o m o t e s n e w b o n e f o r m a t i o n b y p r o m o t i n g b l o o d v e s s e l i n v a s i o n a n d t h u s c o u p l e s v a s c u l o g e n e s i s t o o s t e o g e n e s i s t o r e g u l a t e l o n g b o n e g r o w t h ( G e r b e r V u e t a l 1 9 9 9 ) I n t e g r i n s : T h e i n t e g r i n f a m i l y o f c e l l s u r f a c e r e c e p t o r s i s r e s p o n s i b l e f o r m a i n t a i n i n g c o m m u n i c a t i o n b e t w e e n t h e E C M a n d t h e c h o n d r o c y t e ( R u o s l a h t i 1 9 9 1 ) T h e p r o p e r c o m m u n i c a t i o n b e t w e e n t h e E C M a n d t h e c h o n d r o c y t e l e a d s t o p r o p e r c e l l a t t a c h m e n t d i f f e r e n t i a t i o n g r o w t h a n d s u r v i v a l ( L o e s e r 2 0 0 0 ) C h o n d r o c y t e s e x p r e s s v a r i o u s m e m b r a n e i n t e g r i n s t h a t b i n d t o E C M m o l e c u l e s s u c h a s f i b r o n e c t i n ( w h i c h a f f e c t s c e l l a d h e s i o n ) c o l l a g e n s ( w h i c h a f f e c t c e l l a n d m a t r i x s t r u c t u r e ) l a m i n i n s ( w h i c h c o n t r o l c e l l s h a p e a n d m o t i l i t y ) a n d v i t r o n e c t i n ( w h i c h c o n t r o l s c e l l m i g r a t i o n a n d s i g n a l t r a n s d u c t i o n ) I t i s c l e a r t h e n h o w i n d i s p e n s a b l e i n t e g r i n s a r e a s l i n k s b e t w e e n t h e c h o n d r o c y t e a n d i t s E C M W i t h m i s e x p r e s s e d i n t e g r i n m a m m m a l s e x p e r i e n c e m u l t i p l e l e v e l s o f g r o w t h d y s p l a s i a F o r e x a m p l e l o s s o f 1 i n t e g r i n ( w h i c h i s n o r m a l l y e x p r e s s e d i n a l l g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s ) c a u s e s d w a r f i s m i n m i c e r e s u l t i n g f r o m a b s e n c e o f t h e n o r m a l l y o r d e r l y c o l u m n a r a r r a n g e m e n t o f c h o n d r o c y t e s d u e t o r e d u c e d m o t i l i t y o f

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12 c h o n d r o c y t e s p e r t u r b e d c h o n d r o c y t e m o r p h o l o g y a n d r e d u c e d c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n ( B e n g t s s o n A s z o d i e t a l 2 0 0 5 ) M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s ) : T h e M M P s a r e t h e e n z y m e s t h a t d e g r a d e a n d r e m o d e l t h e c a r t i l a g e E C M I n d o i n g s o t h e y p r o v i d e t u r n o v e r o f E C M m o l e c u l e s t h e r e b y m a i n t a i n i n g t h e i n t e g r i t y o f t h e c a r t i l a g e E C M a n d o f t h e c h o n d r o c y t e s M M P s e n a b l e n e o v a s c u l a r i z a t i o n o f t h e g r o w t h p l a t e ( V u S h i p l e y e t a l 1 9 9 8 ) T h i s a n g i o g e n e s i s i s c l o s e l y c o u p l e d t o b o n e f o r m a t i o n i n t h e h y p e r t r o p h i c z o n e a s d e s c r i b e d a b o v e A m u r i n e k n o c k o u t m o d e l f o r M M P 9 s h o w s a b n o r m a l b o n e f o r m a t i o n a s a r e s u l t o f r e d u c e d g r o w t h p l a t e v a s c u l a r i z a t i o n ( R a t h H u f f e t a l 1 9 9 7 ; V u S h i p l e y e t a l 1 9 9 8 ) M M P 1 3 i s a l s o k n o w n t o b e n e c e s s a r y f o r m a t r i x m i n e r a l i z a t i o n i n t h e h y p e r t r o p h i c z o n e b y d e g r a d i n g c o l l a g e n 2 i n t h e p r o l i f e r a t i v e z o n e a n d p r o m o t i n g t h e e x p r e s s i o n o f c o l l a g e n X ( D A n g e l o Y a n e t a l 2 0 0 0 ) T h e M M P s i n d e g r a d i n g t h e E C M a l s o r e l e a s e l o c a l g r o w t h f a c t o r s ( o r s y s t e m i c o n e s t h a t h a v e d i f f u s e d i n ) t h a t a r e b o u n d b y E C M m o l e c u l e s s o t h e s e f a c t o r s c a n a f f e c t c h o n d r o c y t e a c t i v i t y o n l y w h e n n e e d e d a n d o n l y i n t h e i r s p e c i f i c g r o w t h p l a t e z o n e s H o w L o n g i t u d i n a l B o n e G r o w t h O c c u r s T h e g r o w t h p l a t e E C M m o l e c u l e s d i s c u s s e d a b o v e a l l c o n t r i b u t e t o t h e g r o w t h o f l o n g b o n e s a n d o t h e r b o n e s t h a t r e s u l t f r o m a c a r t i l a g e p r e c u r s o r I t i s t h e c o m p l e x i n t e r p l a y o f t h e s e m o l e c u l e s t h a t l e a d s t o a ) c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n b ) c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y a n d e n h a n c e d E C M p r o d u c t i o n a n d c ) c h o n d r o c y t e a p o p t o s i s t h a t r e s u l t s i n b o n e g r o w t h

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13 2 a P r o l i f e r a t i o n T h e p r o l i f e r a t i o n o f c h o n d r o c y t e s p r o d u c e s b o n e g r o w t h O n l y t h e c h o n d r o c y t e s o f t h e p r o l i f e r a t i n g z o n e o f t h e g r o w t h p l a t e a c t i v e l y r e p l i c a t e w i t h e a c h c e l l i n t h i s z o n e p r o d u c i n g u p t o 8 n e w c l o n e s e a c h d a y d u r i n g r a p i d g r o w t h p h a s e s s u c h a s p u b e r t y ( F a r n u m a n d W i l s m a n 1 9 9 3 ) L o c a l l y s y n t h e s i z e d P T H r P I h h a n d T G F a c t i n a c a r e f u l l y c o o r d i n a t e d f e e d b a c k l o o p t o c o n t r o l w h e n p r o l i f e r a t i v e c e l l s b e g i n t o t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e i n t o h y p e r t r o p h i c c e l l s T h e s e p r o t e i n s t h u s c o n t r o l t h e l e n g t h o f t i m e f o r w h i c h e a c h c e l l e x h i b i t s p r o l i f e r a t i v e c a p a c i t y ( B a l l o c k a n d O K e e f e 2 0 0 3 ) F G F R 3 w h i c h b i n d s a t l e a s t 9 d i f f e r e n t F G F s i s a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n ( D e n g W y n s h a w B o r i s e t a l 1 9 9 6 ) W h e n d i s r u p t e d i n m i c e t h e r e s u l t i s a b n o r m a l l y p r o l o n g e d p r o l i f e r a t i o n a n d t h u s o v e r g r o w t h o f l o n g b o n e s ( C o l v i n B o h n e e t a l 1 9 9 6 ) C o n v e r s e l y a c t i v a t i n g m u t a t i o n s o f t h e F G F R 3 g e n e c a u s e a c h o n d r o p l a s i a I n t h i s m o s t c o m m o n o f h u m a n d w a r f i s m s ( 1 : 1 5 0 0 0 t o 1 : 4 0 0 0 0 b i r t h s ) F G F R 3 i n h i b i t s c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n w h i c h i n t u r n l e a d s t o s e v e r e b o n e s h o r t e n i n g ( S h i a n g T h o m p s o n e t a l 1 9 9 4 ) W i t h t h e I h h / P T H r P / T G F l o o p u n d e n i a b l y c r u c i a l i n c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n i t i s a n t i c i p a t e d t h e n t h a t F G F R s a n d t h u s F G F s c a n m o d u l a t e t h i s p a t h w a y T h e r e i s e v i d e n c e f o r t h i s i n t h e r e p r e s s i o n o f I h h w i t h F G F R 3 o v e r e x p r e s s i o n ( N a s k i C o l v i n e t a l 1 9 9 8 ) T h e F G F R 3 r e l a t e d h u m a n c h o n d r o d y s p l a s i a s a r e s e v e r e a c h o n d r o p l a s i a m i l d e r h y p o c h o n d r o p l a s i a s e v e r e ( o f t e n l e t h a l ) t h a n a t o p h o r i c d y s p l a s i a a n d S A D D A N ( s e v e r e a c h o n d r o p l a s i a w i t h d e v e l o p m e n t a l d e l a y a n d a c a n t h o s i s n i g r i c a n s ) ( S h i a n g T h o m p s o n e t a l 1 9 9 4 ; T a v o r m i n a R i m o i n e t a l 1 9 9 5 ; N a s k i C o l v i n e t a l 1 9 9 8 ) T h e s e f o r m s o f d w a r f i s m a l l r e s u l t f r o m t h e a c t i o n o f F G F R 3 a s a n e g a t i v e

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14 r e g u l a t o r o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n T h e p e r l e c a n d i s r u p t i o n i n m i c e a n d h u m a n s a l s o c a u s e s m a r k e d l y r e d u c e d p r o l i f e r a t i o n o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s m o s t l i k e l y b y a f f e c t i n g t h e a v a i l a b i l i t y o f F G F s t o F G F R 3 F G F R 1 a l s o h a s r o l e s i n b o n e g r o w t h a s s e e n i n t h e d y s p l a s i a t h a t r e s u l t s i f t h i s r e c e p t o r i s m i s e x p r e s s e d ( M u e n k e a n d S c h e l l 1 9 9 5 ; W h i t e C a b r a l e t a l 2 0 0 5 ) H u m a n g r o w t h h o r m o n e a n d I G F 1 a r e a l s o k n o w n t o i n c r e a s e g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n ( O h l s s o n I s g a a r d e t a l 1 9 9 3 ) I G F 1 m a y a l s o e n h a n c e t h e s t i m u l a t o r y a c t i v i t y o f T G F o n g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n ( O K e e f e C r a b b e t a l 1 9 9 4 ) M o d u l a t i o n o f t h e c e l l c y c l e i s t h e h y p o t h e s i z e d m e c h a n i s m f o r t h e c o m p l e x i n t e g r a t i o n o f t h e s e m o l e c u l e s t h a t a f f e c t s p r o l i f e r a t i o n i n t h e g r o w t h p l a t e P h o s p h o r y l a t i o n o f h i s t o n e s a n d o f p r o t e i n s s u c h a s R b ( r e t i n o b l a s t o m a p r o t e i n ) i s c o n t r o l l e d b y c y c l i n d e p e n d e n t k i n a s e s ( C D K s ) W i t h a c t i v a t i o n o f C D K s t h e c e l l c y c l e p r o t e i n s s u c h a s h i s t o n e s a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s a r e m o d i f i e d ( s u c h a s b y a c e t y l a t i o n ) a n d g r o w t h p l a t e c e l l s m a i n t a i n p r o l i f e r a t i o n D i f f e r e n t i a t i o n o f r e s t i n g c h o n d r o c y t e s t o p r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e s r e p l e n i s h e s t h e p r o l i f e r a t i v e z o n e 2 b H y p e r t r o p h y / I n c r e a s e d M a t r i x P r o d u c t i o n M a t u r e p r o l i f e r a t i n g c e l l s d i f f e r e n t i a t e t o a h y p e r t r o p h i c s t a t e T h e c h o n d r o c y t e s i n t h e g r o w t h p l a t e a r e p r o g r a m m e d ( a n d a l s o i n f l u e n c e d b y l o c a l g r o w t h f a c t o r s a n d E C M m o l e c u l e s ) t o d i f f e r e n t i a t e i n t o m a t u r e h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s T h i s d i f f e r e n t i a t i o n i s t h e r e f o r e s p o n t a n e o u s i f n o i n h i b i t o r s a r e e x p r e s s e d ( V o l k a n d L e b o y 1 9 9 9 ) B M P s f o r e x a m p l e i n d u c e m a t u r a t i o n o f t h e p r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e t o a h y p e r t r o p h i c s t a t e T h i s m a t u r a t i o n b r i n g s w i t h i t a s w i t c h n o t o n l y t o t h e l a r g e r r o u n d e r s h a p e o f t h e h y p e r t r o p h i c c e l l b u t a l s o t o t h e s y n t h e s i s o f

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15 m a r k e r s o f t h e h y p e r t r o p h i c c e l l t y p e s u c h a s c o l l a g e n X ( K r o n e n b e r g 2 0 0 3 ) T h e i n c r e a s e i n c e l l s i z e i s n o t s i m p l y b y a d i f f u s i o n o f w a t e r i n t o t h e c e l l b u t i t i s a l s o v i a a n a c t i v e i n c r e a s e i n t h e n u m b e r s a n d s i z e s o f o r g a n e l l e s a n d v a c u o l e s w i t h i n t h e d i f f e r e n t i a t i n g c e l l ( B a l l o c k a n d O K e e f e 2 0 0 3 ) T h e c h o n d r o c y t e s u n d e r g o u p t o a 1 0 f o l d i n c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r v o l u m e a n d u p t o a 2 7 f o l d i n c r e a s e i n E C M v o l u m e ( H u n z i k e r S c h e n k e t a l 1 9 8 7 ) a c c o m p a n i e d b y u p t o a 5 f o l d i n c r e a s e i n c e l l m e t a b o l i c a c t i v i t y a s m e a s u r e d b y i n c r e a s e d p r o t e i n p r o d u c t i o n ( H u n z i k e r K a p f i n g e r e t a l 1 9 9 9 ) W i t h t h e s e r e g u l a t e d i n c r e a s e s c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y a n d i t s c o n c o m i t a n t e n h a n c e d m a t r i x s y n t h e s i s a c c o u n t f o r u p t o 6 0 % o f l o n g b o n e g r o w t h i n e n d o c h o n d r a l b o n e s t h a t g r o w r a p i d l y s u c h a s t h e h u m e r u s a n d f e m u r ( F a r n u m a n d W i l s m a n 1 9 8 9 ) H y p e r t r o p h y n o t o n l y c o n t r i b u t e s t o g r o w t h p l a t e m e d i a t e d l o n g i t u d i n a l g r o w t h m o r p h o l o g i c a l l y b u t a l s o m e t a b o l i c a l l y B y s y n t h e s i z i n g i n c r e a s e d c o l l a g e n X a n d a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( A P ) t h e E C M o f h y p e r t r o p h i c c e l l s i s p r e p a r e d f o r c a l c i f i c a t i o n ( A n d e r s o n H s u e t a l 1 9 9 7 ) A P i s p r e s e n t i n c h o n d r o c y t e v e s i c l e s s e c r e t e d b y t h e h y p e r t r o p h i c c e l l s i n t o t h e m a t r i x T h e s e m a t r i x v e s i c l e s c o n t a i n c a l c i u m a n d A P a n d i n i t i a t e m i n e r a l i z a t i o n C o l X c a n b i n d t o t h e s e v e s i c l e s a n d s e c u r e t h e m i n t h e E C M t h u s s u p p o r t i n g d e p o s i t i o n o f t h e c a l c i u m l a d e n v e s i c l e s a n d t h e i r c a r g o i n t o t h e E C M ( A n d e r s o n H s u e t a l 1 9 9 7 ) T h e m a t r i x v e s i c l e s a l s o c o n t a i n M M P s w h i c h d e g r a d e t h e e x i s t i n g E C M a n d r e m o d e l i t i n t o a l a t t i c e t h a t h a s i n c r e a s e d h y d r o x y a p a t i t e c r y s t a l s a n d o t h e r m a t e r i a l s c r u c i a l f o r m a k i n g b o n e T h e c a l c i f i e d c a r t i l a g e c a n t h e n s e r v e a s a t e m p l a t e f o r b o n e f o r m a t i o n

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16 2 c A p o p t o s i s W i t h t h e o n g o i n g p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f g r o w t h p l a t e c e l l s a f i n a l p h a s e o f r e g u l a t i o n o c c u r s w i t h t h e r e m o v a l o f t h e m a t u r e d c e l l s t h a t h a v e s e c r e t e d t h e m a t r i x p r e c u r s o r t h a t o s t e o b l a s t s w i l l u s e f o r b o n e f o r m a t i o n T h i s r e m o v a l i s b y a p r e p r o g r a m m e d c e l l d e a t h o r a p o p t o s i s T h i s i s t h e f a t e o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s t h a t h a v e t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d i n t o h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s a n d h a v e s e c r e t e d t h e m a t r i x s c a f f o l d f o r b o n e f o r m a t i o n ( H a t o r i K l a t t e e t a l 1 9 9 5 ; S h a p i r o A d a m s e t a l 2 0 0 5 ) A f t e r c a l c i f i c a t i o n o f t h e m a t r i x a r o u n d t h e s e h y p e r t r o p h i c c e l l s a p o p t o s i s a n d c l e a r i n g o f t h e s e c e l l s o c c u r s M a t u r e h y p e r t r o p h i c c e l l s t h a t a r e r e a d y t o u n d e r g o a p o p t o s i s s h o w m o r h p h o l o g i c a l c h a n g e s t h a t a r e s i m i l a r t o o t h e r c e l l s u n d e r g o i n g a p o p t o s o s i s s u c h a s c e l l s h r i n k i n g D N A f r a g m e n t a t i o n a n d p l a s m a m e m b r a n e d i s r u p t i o n ( H a t o r i K l a t t e e t a l 1 9 9 5 ) T h e s a m e p r o d u c t i o n o f p h o s p h a t a s e s t h a t p r o m o t e s m i n e r a l i z a t i o n o f t h e E C M a l s o p r o d u c e s p h o s p h a t e i o n s t h a t i n d u c e t h e a p o p t o t i c c h a n g e s i n t h e m o s t m a t u r e o f t h e h y p e r t r o p h i c z o n e c e l l s F G F 2 a l s o b i n d s F G F R 3 t o c a u s e a p o p t o s i s o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s ( S a h n i R a z e t a l 2 0 0 1 ) T h i s m i g h t e x p l a i n w h y t h e r e i s i n c r e a s e d a n d p r e m a t u r e a p o p t o s i s a n d r e d u c e d b o n e g r o w t h i n m i c e o v e r e x p r e s s i n g F G F 2 ( C o f f i n F l o r k i e w i c z e t a l 1 9 9 5 ) P e r l e c a n m i g h t f u r t h e r c o n t r o l t h i s a p o p t o s i s b y r e g u l a t i n g t h e a v a i l a b i l i t y o f t h i s F G F C h o n d r o c y t e a p o p t o s i s i s n e c e s s a r y f o r g r o w t h p l a t e m e d i a t e d b o n e f o r m a t i o n W i t h t h e i r d e a t h t h e c h o n d r o c y t e s l e a v e t h e h y p e r t r o p h i c z o n e o p e n f o r i n v a s i o n o f v a s c u l a t u r e f r o m t h e a d j a c e n t m e t a p h y s e a l b o n e W i t h t h e s e n e w b l o o d v e s s e l s c o m e e n z y m e s a n d o s t e o c y t e s t h a t f u r t h e r d e g r a d e t h e m i n e r a l i z e d m a t r i x a n d r e m o d e l t h e c a r t i l a g e ( t h e o s t e o c l a s t s ) a n d t h a t a l s o l a y d o w n

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17 t h e n e w b o n e ( t h e o s t e o b l a s t s ) T h i s l i n k b e t w e e n o s t e o g e n e s i s a n d v a s c u l o g e n e s i s i s c o n t r o l l e d b y v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ( V E G F ) ( G e r b e r V u e t a l 1 9 9 9 ) V E G F i s p r e d i c t a b l y e x p r e s s e d i n h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s b u t n o t i n r e s t i n g o r p r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e s V E G F r e c e p t o r ( V E G F R ) i s a l s o o n l y e x p r e s s e d i n t h e h y p e r t r o p h i c c e l l s o f t h e g r o w t h p l a t e F G F 2 i s a l s o k n o w n t o p r o m o t e a n g i o g e n e s i s a n d s u b s e q u e n t o s s i f i c a t i o n o f c a r t i l a g e P e r l e c a n c a n n o t o n l y r e g u l a t e t h e a v a i l a b i l i t y o f F G F 2 b u t a l s o h a s w e l l r e p o r t e d a n g i o g e n i c p r o p e r t i e s c o n f e r r e d b y i t s C t e r m i n a l d o m a i n ( M o n g i a t S w e e n e y e t a l 2 0 0 3 ) F G F 1 8 i s a l s o k n o w n t o i n c r e a s e e x p r e s s i o n o f V E G F a n d t o m o d u l a t e i t s a n g i o g e n i c e f f e c t s ( L i u X u e t a l 2 0 0 2 ) E x p r e s s i o n o f F G F 2 F G F 1 8 a n d p e r l e c a n i n t h e h y p e r t r o p h i c z o n e m i g h t f u r t h e r c o o r d i n a t e t h e v a s c u l a r i z a t i o n t h a t i s a n e s s e n t i a l e n d p o i n t i n e n d o c h o n d r a l b o n e f o r m a t i o n P e r l e c a n 4 a S t r u c t u r e / F u n c t i o n P e r l e c a n w a s f i r s t i d e n t i f i e d a s a H S P G i n m u r i n e b a s e m e n t m e m b r a n e s i n 1 9 8 0 ( H a s s e l l R o b e y e t a l 1 9 8 0 ) a n d h a s s i n c e b e e n s h o w n t o b e i n c h i c k e n s f l i e s w o r m s a s w e l l a s o t h e r m a m m a l s ( R o g a l s k i W i l l i a m s e t a l 1 9 9 3 ; S u n d a r r a j F i t e e t a l 1 9 9 8 ; V o i g t P f l a n z e t a l 2 0 0 2 ) R o t a r y s h a d o w e d i m a g e s o f m u r i n e p e r l e c a n s h o w t h a t t h e c o r e p r o t e i n o f p e r l e c a n w i t h i t s g l o b u l a r d o m a i n s s p a c e d b y r o d l i k e s e q u e n c e s r e s e m b l e s a s t r i n g o f p e a r l s h e n c e i t s n a m e ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ) T h e o v e r 1 2 0 k b o f t h e p e r l e c a n g e n e e n c o d e a p r o t e i n c o r e t h a t c a n e x c e e d 4 6 0 k D a i n m a s s ( f o r e x a m p l e i n h u m a n a n d m i c e ) T h e p e r l e c a n c o r e i s m o d u l a r c o n s i s t i n g o f f i v e d o m a i n s t h a t s h o w h o m o l o g y t o v a r i o u s

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18 m o l e c u l e s C S a n d H S G A G s a r e a t t a c h e d a t t h e f i r s t a n d l a s t o f t h e s e d o m a i n s ( d o m a i n s I a n d V ; F i g u r e 2 ) F i g u r e 2 : S t r u c t u r e o f p e r l e c a n s h o w i n g i t s 5 d o m a i n s a n d t h e a t t a c h e d G A G s F r o m S m i t h S M L a n d H a s s e l l J R E x p e r i m e n t a l E y e R e s e a r c h 8 3 ( 2 0 0 6 ) 4 7 1 2 T h e s y n t h e s i s o f p e r l e c a n b e g i n s a s a l l p r o t e i n s d o w i t h t h e t r a n s c r i p t i o n o f t h e c o r e p r o t e i n m R N A f r o m t h e g e n e s e q u e n c e T h e m R N A i s t h e n t r a n s l a t e d i n t o a p r e c u r s o r p r o t e i n a n d c e r t a i n i n t i t i a t i o n s i t e s ( S e r i n F i g u r e 3 ) o n t h e p r e c u r s o r a r e u s e d t o i n i t i a t e C S a n d / o r H S s y n t h e s i s ( Y a n a g i s h i t a a n d H a s c a l l 1 9 9 2 ) T h i s i n i t i a t i o n i s v i a a d d i t i o n o f x y l o s e ( X y l ) i n s t e p 2 t o s p e c i f i c s e r i n e r e s i d u e s t h a t i s s e r i n e r e s i d u e s f o l l o w e d b y a g l y c i n e a n d i n s o m e c a s e s a n a c i d i c a m i n o a c i d ( a n a s p a r t i c a c i d o r g l u t a m i c a c i d ) S t e p 3 i s t h e t r a n s f e r o f t w o g a l a c t o s e ( G a l ) r e s i d u e s t o t h e X y l N e x t t h e r e i s a d d i t i o n o f a g l u c u r o n i c a c i d r e s i d u e ( G l c A ) t o c o m p l e t e t h i s t e t r a s a c c h a r i d e l i n k a g e r e g i o n ( s t e p 4 ) A t s t e p 5 t h e s y n t h e s i s o f C S a n d H S d i v e r g e ; N a c e t y l g a l a c t o s a m i n e ( G a l N A c ) i s a d d e d b y G a l N A c t r a n s f e r a s e s t o t h e l i n k a g e r e g i o n i n C S s y n t h e s i s w h i l e N a c e t y l g l u c o s a m i n e ( G l c N A c ) i s a d d e d b y E X T 1 a n d 2 i n H S s y n t h e s i s ; a c l u s t e r o f a c i d i c r e s i d u e s w i t h i n ~ 7 r e s i d u e s o f t h e

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19 s e r i n e f a v o r s H S s y n t h e s i s o n t h a t s e r i n e A d d i t i o n o f r e p e a t e d a l t e r n a t i n g G l c N A c a n d G l c A r e s i d u e s t h e n s e r v e t o p o l y m e r i z e t h e H S c h a i n ( s t e p 6 ) M o d i f i c a t i o n o f t h e g r o w i n g H S c h a i n ( s t e p 7 ) b y N d e a c e t y l a t i o n N s u l f a t i o n e p i m e r i z a t i o n a n d f u r t h e r s u l f a t i o n ( 2 O 6 O a n d r a r e l y 3 O ) y i e l d s t h e f u l l y m o d i f i e d G A G a n d t h u s t h e c o m p l e t e p r o t e o g l y c a n E p i m e r i z a t i o n o f G l c A t o i d u r o n i c a c i d a l s o o c c u r s f o r C S w i t h t h e t e r m C S i f G l c A g e t s i n c o r p o r a t e d a n d d e r m a t a n s u l f a t e o r D S i f I d o A i s p r e s e n t ( H a s c a l l C a l a b r o e t a l 1 9 9 4 ) F i g u r e 3 : B i o s y n t h e s i s o f p e r l e c a n T h e f i r s t s t e p o f p e r l e c a n s y n t h e s i s i s t h e t r a n s l a t i o n o f t h e c o r e p r o t e i n w i t h i t s s e r i n e G A G a t t a c h m e n t s i t e ( S e r ) a n d t h e g l y c i n e ( G l y ) t h a t f o l l o w s i t T h e s e c o n d t h r o u g h s i x t h s t e p s ( n u m b e r e d 2 6 ) a r e i n d i c a t e d b y a r r o w s S t e p 7 i n v o l v e s m u l t i p l e m o d i f i c a t i o n s s u c h a s a c e t y l a t i o n e p i m e r i z a t i o n a n d s u l f a t i o n ( S e e t e x t ) f i r s t s t e p w h e r e C S a n d H S d i f f e r ; A i s G a l N A c f o r C S a n d G l c N A c f o r H S a n d i s a d d e d b y t h e c o r r e s p o n d i n g t r a n s f e r a s e s ( f o r H S t h e t r a n s f e r a s e s a r e s p e c i f i c a l l y t e r m e d E X T 1 a n d 2 ( H e c h t H a l l e t a l 2 0 0 2 ) ) B i s u r o n i c a c i d ( f o r C S g l u c u r o n i c a c i d a d d i t i o n p r o d u c e s C S e p i m e r i z a t i o n t o i d u r o n i c a c i d p r o d u c e s D S ) I t i s i m p o r t a n t t o r e i t e r a t e t h a t a d d i t i o n o f C S v e r s u s H S i s d e t e r m i n e d b y t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e i n t h e p r o t e i n c o r e F o r i n s t a n c e i f a s e r i n e i n i t i a t i o n s i t e i n p e r l e c a n i s f o l l o w e d b y a g l y c i n e t h e n G A G a t t a c h m e n t w i l l b e g i n a t t h a t s e r i n e b u t H S w i l l o n l y b e a t t a c h e d i f t h e s e r i n e i s f l a n k e d b y a g r o u p o f a c i d i c a m i n o a c i d s s u c h a s a s p a r t i c a c i d ( D o l a n H o r c h a r e t a l 1 9 9 7 ) T h e r e a r e t h r e e s u c h a c i d f l a n k e d s e r i n e s i n t h e f i r s t d o m a i n o f p e r l e c a n a n d

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20 o n e i n D o m a i n V T h e y a r e a l l S e r i n e G l y c i n e A s p a r t i c a c i d ( S G D ) s e q u e n c e s f l a n k e d b y a c i d i c r e s i d u e s ( i e S G D X X X D / E D / E X ) t h a t f a v o r H S a t t a c h m e n t b u t c a n a l s o r e c e i v e C S T h e r e i s a l s o a s p e c i f i c C S a n d a n H S a t t a c h m e n t s i t e i n d o m a i n V ( T a p a n a d e c h o p o n e H a s s e l l e t a l 1 9 9 9 ) D o m a i n I : T h i s ~ 1 7 2 a m i n o a c i d d o m a i n w a s i n i t i a l l y c o n s i d e r e d t h e o n l y u n i q u e d o m a i n o f p e r l e c a n ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ) H o w e v e r a n S E A h o m o l o g y d o m a i n h a s s i n c e b e e n i d e n t i f i e d t h a t i s f o u n d i n o t h e r p r o t e i n s a n d m i g h t h e l p t o m o d u l a t e G A G a t t a c h m e n t ( B o r k a n d P a t t h y 1 9 9 5 ) E x c e p t f o r t h e t h r e e c o n s e c u t i v e S G D H S a t t a c h m e n t s i t e s t h e r e i s n o r e p e a t i n g s t r u c t u r e i n d o m a i n I w h i c h d i s t i n g u i s h e s i t f r o m t h e o t h e r f o u r p e r l e c a n p r o t e i n d o m a i n s T h e G A G c h a i n s a t t a c h e d t o d o m a i n I c a u s e t h i s d o m a i n t o p l a y a c r u c i a l r o l e i n b i n d i n g c e r t a i n g r o w t h f a c t o r s T h e G A G s o n d o m a i n I h a v e b e e n s h o w n t o b i n d t o a n g i o p o i e t i n 3 a n d P D G F ( t o a f f e c t t i s s u e a n g i o g e n e s i s ) c o l l a g e n I V ( t o c o n t r o l c e l l m a t r i x s t r u c t u r e ) a n d F G F 2 ( I o z z o C o h e n e t a l 1 9 9 4 ; G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 6 ; S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) I n b i n d i n g F G F 2 a g r o w t h f a c t o r w i t h p l e i o t r o p i c e f f e c t s i n d e v e l o p m e n t a n d c e l l s u r v i v a l p e r l e c a n h e l p s t o m o d u l a t e t h e a c t i o n s o f t h i s g r o w t h f a c t o r e s p e c i a l l y i t s e f f e c t s o n c a r t i l a g e a n d e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h F G F 2 w i l l b e d e s c r i b e d i n d e t a i l l a t e r T h e G A G s o n d o m a i n I o f p e r l e c a n a l s o b i n d f i b r o n e c t i n t o c o n t r o l c e l l a t t a c h m e n t a n d l a m i n i n 1 t o c o n t r o l c e l l s t r u c t u r e ( I o z z o 1 9 9 4 ) T h e p r o l i n e / a r g i n i n e r i c h e n d l e u c i n e r i c h r e p e a t p r o t e i n ( P R E L P ) c a n a l s o b i n d p e r l e c a n s d o m a i n I G A G s t o s t a b i l i z e t h e c e l l b y a n c h o r i n g c e l l s t o t h e i r u n d e r l y i n g c o n n e c t i v e t i s s u e ( B e n g t s s o n M o r g e l i n e t a l 2 0 0 2 ) T h e G A G s o n d o m a i n I o f p e r l e c a n a l s o b i n d

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21 t o V E G F ( a l l o w i n g p e r l e c a n a r o l e i n c o n t r o l l i n g a n g i o g e n e s i s i n v a r i o u s t i s s u e t y p e s i n c l u d i n g t h e c a r t i l a g e p r e c u r s o r i n e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h ) a n d t o t h r o m b o s p o n d i n ( s u g g e s t i n g a r o l e f o r p e r l e c a n i n b l o o d c l o t t i n g a n d t i s s u e r e m o d e l i n g ) ( I o z z o 2 0 0 5 ) T h e G A G s o f p e r l e c a n a l s o b i n d t h e a m y l o i d p r o t e i n s i n v o l v e d i n a m y l o i d o g e n e s i s a n d A l z h e i m e r s d i s e a s e t o b o t h a c c e l e r a t e a n d m a i n t a i n p a t h o g e n i c f i b r i l f o r m a t i o n ( C a s t i l l o N g o e t a l 1 9 9 7 ) D o m a i n I I : T h i s ~ 2 1 1 a m i n o a c i d d o m a i n i s r i c h i n c y s t e i n e s u n l i k e d o m a i n I w h i c h h a s n o n e w h i c h p r o m o t e e x t e n s i v e t e r t i a r y s t r u c t u r e T h e d o m a i n s h o w s s u b s t a n t i a l h o m o l o g y t o t h a t r e g i o n o f t h e L D L r e c e p t o r t h a t b i n d s l i p i d s w i t h f o u r ~ 4 0 a m i n o a c i d L D L R l i k e r e p e a t s W i t h i t s h o m o l o g y t o L D L R D o m a i n I I h a s s o f a r b e e n s h o w n t o i n t e r a c t w i t h V L D L A D G S D E a m i n o a c i d s e q u e n c e p r e s e n t i n m a m m a l i a n p e r l e c a n d o m a i n I I i s k n o w n t o m e d i a t e t h e b i n d i n g o f L D L R t o L D L ( I o z z o 2 0 0 5 ) a n d m i g h t t h u s h e l p t o r e g u l a t e l i p o m e t a b o l i s m D o m a i n I I m a y a l s o b e a b i n d i n g s i t e f o r p r o t e i n s w i t h l i p i d m o i e t i e s O n e s u c h p r o t e i n i s I h h w h i c h h a s a c h o l e s t e r o l m o i e t y a t t a c h e d t o i t a n d i s e s s e n t i a l f o r e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h ( S t J a c q u e s H a m m e r s c h m i d t e t a l 1 9 9 9 ) I n b i n d i n g I h h a n d e i t h e r s e q u e s t e r i n g i t f r o m o r d e l i v e r i n g i t t o i t s r e c e p t o r d o m a i n I I a n d p e r l e c a n w o u l d s e r v e a n o t h e r v i t a l r o l e i n c h o n d r o c y t e a c t i v i t y F o l l o w i n g t h e L D L R s u b d o m a i n t h e r e i s a r e g i o n o f ~ 1 0 0 a m i n o a c i d s c o n t a i n i n g a s h o r t r e p e a t h o m o l o g o u s t o N C A M o f t h e i m m u n o g l o b u l i n g e n e s u p e r f a m i l y ( C o s t e l l S a s a k i e t a l 1 9 9 6 ) D o m a i n I I I : T h i s l a r g e ~ 1 1 7 0 a m i n o a c i d d o m a i n i s m a d e u p o f t h r e e s u b d o m a i n s ( I I I a t o I I I c ) E a c h o f t h e t h r e e s u b d o m a i n s o f

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22 d o m a i n I I I c o n s i s t s o f a s i n g l e c y s t e i n e r i c h r e p e a t f o l l o w e d b y a c y s t e i n e f r e e g l o b u l a r r e g i o n t h e n t h r e e m o r e c y s t e i n e r i c h r e p e a t s T h e c y s t e i n e r i c h r e p e a t s a r e ~ 3 5 % h o m o l o g o u s t o r e p e a t s f o u n d i n d o m a i n s I I I a n d V o f t h e l a m i n i n A s h o r t c h a i n s T h e g l o b u l a r r e g i o n s o f t h e s u b d o m a i n a r e ~ 3 0 % h o m o l o g o u s t o d o m a i n I V o f t h e l a m i n i n A s h o r t c h a i n s ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ; C o u c h m a n L j u b i m o v e t a l 1 9 9 5 ) W i t h t h e e x t e n s i v e t e r t i a r y s t r u c t u r e t h a t t h e c y s t e i n e s p r o m o t e d o m a i n I I I s e e m s a g o o d c a n d i d a t e f o r m u l t i p l e i n t e r a c t i o n s I n d e e d d o m a i n I I I b i n d s t o F G F 7 a n d F G F B P t o m o d u l a t e g r o w t h f a c t o r m e d i a t e d c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d P D G F t o p o t e n t i a l l y c o n t r o l a n g i o g e n e s i s ( I o z z o C o h e n e t a l 1 9 9 4 ) M u r i n e d o m a i n I I I c o n t a i n s a n R G D s e q u e n c e ( a b s e n t i n h u m a n p e r l e c a n ) t h a t i s k n o w n t o m e d i a t e t h e b i n d i n g o f i n t e g r i n s t o p e r l e c a n a n d t h u s t o m e d i a t e c e l l a d h e s i o n a n d m o t i l i t y ( C h a k r a v a r t i H o r c h a r e t a l 1 9 9 5 ) D o m a i n I V : T h i s i s t h e l a r g e s t o f t h e p e r l e c a n d o m a i n s I n h u m a n s i t c o n t a i n s o v e r 2 0 0 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s t h a t a m o u n t t o o v e r 2 2 0 k D a i n m o l e c u l a r m a s s D o m a i n I V i s a s e r i e s o f r e p e a t s w i t h h o m o l o g y t o t h e i m m u n o g l o b u l i n ( I g ) g e n e f a m i l y e s p e c i a l l y N C A M ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ; M u r d o c h D o d g e e t a l 1 9 9 2 ) T h e r e i s a l s o a p u t a t i v e G A G a t t a c h m e n t s i t e i n t h e f o u r t e e n t h I g r e p e a t o f h u m a n d o m a i n I V w h i c h i s a b s e n t i n m i c e p r o b a b l y d u e t o a l t e r n a t i v e s p l i c i n g H u m a n s h a v e a t o t a l o f t w e n t y o n e o f t h e s e I g r e p e a t s v e r s u s t h e f o u r t e e n i n o r g a n i s m s s u c h a s m i c e a n d n e m a t o d e s T h e t w e n t y o n e I g r e p e a t s i n h u m a n d o m a i n I V a r e t h e l a r g e s t n u m b e r o f I g r e p e a t s i d e n t i f i e d s o f a r i n a g e n e p r o d u c t ( M u r d o c h D o d g e e t a l 1 9 9 2 ) W i t h s u c h a d e f i n e d y e t c o m p l e x s t r u c t u r e i t i s n o s u r p r i s e t h a t d o m a i n I V b i n d s m o l e c u l e s a s d i v e r s e a s c o l l a g e n I V

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23 f i b r o n e c t i n f i b u l i n 2 ( t o r e g u l a t e c e l l s h a p e a n d m o v e m e n t ) n i d o g e n ( t o c o n n e c t c o l l a g e n a n d t h e l a m i n i n : n i d o g e n c o m p l e x ) a n d P D G F ( I o z z o 1 9 9 4 ; I o z z o 2 0 0 5 ) P e r l e c a n c a n t h e r e f o r e v i a i t s d o m a i n I V r e g u l a t e p r o c e s s e s s u c h a s g r o w t h f a c t o r a c t i v i t y a n g i o g e n e s i s c e l l a d h e s i o n c e l l m o b i l i t y a n d c e l l s u r v i v a l D o m a i n V : T h i s ~ 7 0 5 a m i n o a c i d d o m a i n i s t h e C t e r m i n a l r e g i o n o f p e r l e c a n A g a i n t h e s t r u c t u r e i s o n e o f t h r e e g l o b u l a r ( c y s t e i n e f r e e ) s u b d o m a i n s l i n k e d b y c y s t e i n e r i c h s e g m e n t s T h e g l o b u l a r s u b d o m a i n s ( V a t o V c ) s h o w m o r e t h a n 3 0 % h o m o l o g y t o l a m i n i n A e v e n f o l d i n g i n t o g l o b u l a r l o o p s t h e w a y l a m i n i n d o e s T h e f i r s t t w o g l o b u l a r d o m a i n s a r e e a c h f o l l o w e d b y t w o c y s t e i n e r i c h r e p e a t s t h a t s h o w h o m o l o g y t o E G F T h e f o u r t h E G F r e p e a t i s t h e n f o l l o w e d b y t h e C t e r m i n u s o f p e r l e c a n I n t h e s e c o n d a n d f o u r t h E G F r e p e a t s a S e r i n e G l y c i n e ( S G x G ) s e q u e n c e o c c u r s w h i c h i s a p u t a t i v e G A G a t t a c h m e n t s i t e P e r l e c a n t h u s c a n a c c e p t t w o G A G c h a i n s o n i t s C t e r m i n a l e n d d o m a i n ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ; M u r d o c h D o d g e e t a l 1 9 9 2 ) D o m a i n V h a s b e e n s h o w n t o b i n d t o e n d o s t a t i n ( t h e C t e r m i n a l e n d o f c o l l a g e n X V I I I ) E C M 1 F G F 7 f i b u l i n 2 i n t e g r i n s a n d n i d o g e n ( I o z z o 2 0 0 5 ) I n t h i s w a y p e r l e c a n c a n a f f e c t p r o c e s s e s a s d i v e r s e a s g r o w t h f a c t o r a c t i v i t y c e l l c e l l a n d c e l l m a t r i x i n t e r a c t i o n c e l l m o t i l i t y a n d b a s e m e n t m e m b r a n e s t a b i l i t y D o m a i n V a l s o b i n d s d y s t r o g l y c a n a t t h e n e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n i n s k e l e t a l m u s c l e t o m e d i a t e i t s i n t e r a c t i o n w i t h a c e t y l c h o l i n e e s t e r a s e t h e r e b y r e g u l a t i n g t h e s y n a p s e a n d f a c i l i t a t i n g p r o p e r m u s c l e c o n t r a c t i o n ( P e n g A l i e t a l 1 9 9 8 ) D o m a i n V b y i t s e l f h a s b e e n s h o w n t o h a v e b i o l o g i c a l a c t i v i t y a s e n d o r e p e l l i n a m o l e c u l e ( n a m e d t o a l l u d e t o i t s a n t i a n g i o g e n i c p r o p e r t i e s ) t h a t b i n d s e n d o s t a t i n t o f u n c t i o n i n b a s e m e n t

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24 m e m b r a n e a s s e m b l y ( M o n g i a t S w e e n e y e t a l 2 0 0 3 ) T h e l o c a l i z a t i o n o f e n d o r e p e l l i n i n t h e B M m i g h t a l s o b e t t e r p o s i t i o n t h e G A G c h a i n s o f d o m a i n V t o b i n d g r o w t h f a c t o r s a n d m a i n t a i n B M f u n c t i o n s i n p e r m e a b i l i t y a n d t r a f f i c k i n g M o s t o f t h e a n g i o s t a t i c a c t i v i t y o f e n d o r e p e l l i n s e e m s t o r e s i d e i n t h e C t e r m i n a l m o s t g l o b u l a r d o m a i n w h i c h c a n b e l i b e r a t e d f r o m t h e r e s t o f t h e c o r e b y p r o t e a s e s 4 b G e n e a n d M u t a t i o n s T h e p r o t e i n c o r e o f p e r l e c a n i s e n c o d e d b y a s i n g l e ~ 1 2 0 k b g e n e w i t h 9 7 e x o n s ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ) T h e g e n e ( h u m a n c h r o m o s o m e 1 m o u s e c h r o m o s o m e 4 ) i s w e l l c o n s e r v e d a c r o s s s p e c i e s w i t h h o m o l o g u e s o f m a m m a l i a n p e r l e c a n ( h s p g 2 g e n e ) p r e s e n t i n C e l e g a n s ( u n c 5 2 g n e ) D m e l a n o g a s t e r ( t r o l g e n e ) a n d o t h e r s p e c i e s T h e p r o m o t e r o f t h e p e r l e c a n g e n e c o n t a i n s T G F r e s p o n s e e l e m e n t s t h a t m o d u l a t e t h e a c t i v a t i n g e f f e c t o f T G F o n p e r l e c a n g e n e t r a n s c r i p t i o n ( I o z z o P i l l a r i s e t t i e t a l 1 9 9 7 ) P e r l e c a n s h o w s v a r i e t y a t m a n y l e v e l s I n h u m a n s t h e g e n e e n c o d e s a n ~ 4 6 6 k D a c o r e p r o t e i n M i c e c a n a l s o e x p r e s s t h i s f o r m o f p e r l e c a n r e s u l t i n g f r o m a l t e r n a t i v e s p l i c i n g b u t t h e i r u s u a l p e r l e c a n g e n e p r o d u c t i s a n ~ 3 6 9 k D a c o r e p r o t e i n ( N o o n a n a n d H a s s e l l 1 9 9 3 ) P e r l e c a n i s t e r m e d a h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n ( H S P G ) b u t i n f a c t t h e c o r e p r o t e i n c a n a l s o h a v e C S G A G s a t t a c h e d T h e v a r y i n g s u l f a t i o n p a t t e r n s a n d G A G t y p e s o f p e r l e c a n i n d i f f e r e n t t i s s u e s p r o v i d e s a n o t h e r l e v e l o f t h e i n h e r e n t v a r i e t y o f p e r l e c a n F o r e x a m p l e g r o w t h p l a t e p e r l e c a n h a s b o t h C S a n d H S ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ; W e s t G o v i n d r a j e t a l 2 0 0 6 ) w h e r e a s E H S p e r l e c a n ( f r o m t h e E n g e l b r e t h H o l m S w a r m t u m o r ) r a r e l y h a s C S b u t h a s H S ( C o u c h m a n K a p o o r e t a l 1 9 9 6 )

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25 D i s r u p t i o n s i n t h e p e r l e c a n g e n e i n d i f f e r e n t o r g a n i s m s h a v e b e e n s t u d i e d a n d t h e r e s u l t i n g d i s o r d e r s c h a r a c t e r i z e d I n C e l e g a n s p e r l e c a n m u t a t i o n s p r o d u c e d e f e c t i v e m u s c l e d e v e l o p m e n t c a u s i n g p a r a l y s i s a n d s p a s t i c i t y t h a t m a k e s t h e m o v e m e n t o f t h e n e m a t o d e s u n c o o r d i n a t e d ( h e n c e t h e u n c n a m e f o r t h e g e n e ) ( R o g a l s k i W i l l i a m s e t a l 1 9 9 3 ) I n D r o s o p h i l a p e r l e c a n m u t a t i o n s c a u s e d e f e c t i v e e y e b a s e m e n t m e m b r a n e f o r m a t i o n l e a d i n g t o a b n o r m a l l y s m a l l o p t i c l o b e s ( h e n c e t h e n a m e t r o l f o r t h e g e n e f o r t e r r i b l y r e d u c e d o p t i c l o b e s o n e o f t h e p h e n o t y p e s t h a t r e s u l t s f r o m t h i s p e r l e c a n d e f e c t ) ( V o i g t P f l a n z e t a l 2 0 0 2 ) M u t a t i o n s h a v e a l s o b e e n c h a r a c t e r i z e d i n t h e m u r i n e a n d h u m a n p e r l e c a n g e n e s I n 1 9 9 9 A r i k a w a H i r a s a w a e t a l a n d C o s t e l l e t a l c o n c u r r e n t l y b u t s e p a r a t e l y g e n e r a t e d m i c e w i t h a m u t a t i o n i n e x o n 7 o f t h e p e r l e c a n g e n e ( A r i k a w a H i r a s a w a W a t a n a b e e t a l 1 9 9 9 ; C o s t e l l G u s t a f s s o n e t a l 1 9 9 9 ) T h e r e s u l t s w e r e e f f e c t i v e k n o c k o u t s o f t h e p e r l e c a n g e n e ( h s p g 2 ) a n d l o s s o f p e r l e c a n e x p r e s s i o n i n t h e s e a n i m a l s A p p r o x i m a t e l y 4 0 % o f t h e h s p g 2 n u l l m i c e d i e d a t m i d g e s t a t i o n ( E 1 0 5 ) T h e r e m a i n i n g n u l l m i c e d i e d p e r i n a t a l l y a n d s h o w e d s e v e r e s k e l e t a l d y s p l a s i a i n c l u d i n g m i c r o m e l i a b r o a d a n d b o w e d l o n g b o n e s n a r r o w r i b c a g e c r a n i o f a c i a l d e f e c t s a n d d w a r f i s m ( F i g u r e 4 ) T h e s e r e s u l t s e s t a b l i s h e d p e r l e c a n a s a p o s i t i v e r e g u l a t o r o f c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n i n t h e g r o w t h p l a t e A m o r e v i a b l e p e r l e c a n m u t a n t m o u s e h a s a l s o b e e n g e n e r a t e d w h e r e e x o n 3 o f t h e m u r i n e g e n e ( w h i c h c o d e s f o r t h e G A G a t t a c h m e n t s i t e s i n d o m a i n I ) w a s d e l e t e d ( R o s s i M o r i t a e t a l 2 0 0 3 ) T h e s e m i c e s u r v i v e a n d a r e f e r t i l e b u t t h e y h a v e d e f e c t i v e e y e s t h a t a r e n o t o n l y ~ 7 5 % o f t h e w e i g h t o f n o r m a l e y e s d u e t o i n c r e a s e d a p o p t o s i s o f l e n s e p i t h e l i a l c e l l s b u t a l s o h a v e l e n s e s w h i c h b e c o m e a m o r p h o u s a n d r u p t u r e w h e n t h e m i c e a r e a r o u n d 6

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26 m o n t h s o l d T h i s m o u s e m o d e l i s d i s c u s s e d i n s l i g h t l y m o r e d e t a i l i n t h e F o c u s P a p e r i n c l u d e d a s a n a p p e n d i x i n t h i s d i s s e r t a t i o n F i g u r e 4 : M o r p h o l o g y o f w i l d t y p e ( a c e ) v e r s u s h s p g 2 n u l l ( b d f ) m i c e G r o s s a p p e a r a n c e ( a b ) a n d s k e l e t a l p r e p a r a t i o n s ( c f ) s h o w i n g d w a r f i s m r e s u l t i n g f r o m d e f e c t i v e b o n e g r o w t h i n e n d o c h o n d r a l b o n e s s u c h a s t h e f o r e l i m b s ( c d ) a n d h i n d l i m b s ( e f ) F r o m A r i k a w a H i r a s a w a e t a l N a t G e n e t 1 9 9 9 ( 2 3 ) 3 5 4 8 H u m a n d y s s e g m e n t a l d s y p l a s i a s a r e a u t o s o m a l r e c e s s i v e s k e l e t a l d y s p l a s i a s t h a t c o v e r a w i d e r a n g e o f s y m p t o m s a l l i n v o l v i n g d w a r f i s m D y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e ( D D S H ) i s a s e v e r e l e t h a l f o r m o f t h e s e d y s p l a s i a s C l i n i c a l a n d r a d i o l o g i c a l s i m i l a r i t i e s a m o n g t h e s k e l e t a l d w a r f i s m o f D D S H p a t i e n t s a n d p e r l e c a n n u l l m i c e p r o m p t e d r e s e a r c h e r s t o e x a m i n e p a t i e n t s w i t h D D S H t o u n c o v e r a n y m u t a t i o n s i n t h e p e r l e c a n g e n e D u p l i c a t i o n s p o i n t m u t a t i o n s a n d e x o n s k i p p i n g h a v e a l l b e e n s u b s e q u e n t l y i d e n t i f i e d i n t h e p e r l e c a n g e n e o f p a t i e n t s w i t h D D S H a n d o t h e r d y s p l a s i a s ( N i c o l e D a v o i n e e t a l 2 0 0 0 ; A r i k a w a H i r a s a w a W i l c o x e t a l 2 0 0 1 ; A r i k a w a H i r a s a w a W i l c o x e t a l 2 0 0 1 ; H a s s e l l Y a m a d a e t a l 2 0 0 2 ) T h e s e m u t a t i o n s c a u s e v a r i o u s d e g r e e s o f t r u n c a t i o n a n d d e c r e a s e d f u n c t i o n a l i t y o f t h e p e r l e c a n

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27 g e n e p r o d u c t I n D D S H t h i s t r u n c a t i o n i s s e v e r e e n o u g h t h a t t h e t r u n c a t e d p e r l e c a n i s n o t s e c r e t e d b y c e l l s f r o m t h e s e p a t i e n t s b u t i s s i m p l y d e g r a d e d i n t r a c e l l u l a r l y T h e s e D D S H p a t i e n t s a r e e f f e c t i v e l y p e r l e c a n n u l l a n d l i k e t h e m o u s e m o d e l d i e s h o r t l y a f t e r b i r t h T h e d e f e c t s i n e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h i n t h e s e p a t i e n t s h a v e a l s o u n d e r s c o r e d t h e p o s i t i v e r o l e o f p e r l e c a n i n g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n I n t h e m i l d e r c h o n d r o d y s p l a s i a k n o w n a s S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e ( S J S ) m i s s e n s e a n d s p l i c i n g m u t a t i o n s r e s u l t i n t h e p r o d u c t i o n o f a t r u n c a t e d p e r l e c a n p r o d u c t t h a t i s s t i l l s e c r e t e d a n d r e m a i n s p a r t i a l l y f u n c t i o n a l P a t i e n t s s t i l l s u f f e r t h e d w a r f i s m a n d s k e l e t a l a b n o r m a l i t i e s o f t h e D D S H p a t i e n t s b u t o n a m u c h m i l d e r s c a l e F i b r o b l a s t G r o w t h F a c t o r ( F G F ) 2 5 a S t r u c t u r e / F u n c t i o n F G F 2 ( b a s i c F G F ) i s o n e o f t w e n t y t h r e e m e m b e r s o f t h e F G F f a m i l y F G F s r a n g e f r o m 1 7 3 4 k D a a n d h a v e a m i n o a c i d r e s i d u e s t h a t i n t e r a c t w i t h F G F r e c e p t o r s ( F G F R s ) F G F 2 i s ~ 1 8 k D a a n d a l s o c o n t a i n s s e v e r a l b a s i c r e s i d u e s t h a t f o r m a h e p a r i n / H S b i n d i n g s i t e d i s t i n c t f r o m t h e F G F R b i n d i n g s i t e F G F 2 d o e s n o t c o n t a i n a s i g n a l s e q u e n c e b u t i s s e c r e t e d b y s o m e u n k n o w n p a t h w a y ( O r n i t z a n d I t o h 2 0 0 1 ) I t i s n o r m a l l y e x p r e s s e d a t l o w l e v e l s b u t i s u p r e g u l a t e d i n p a t h o l o g y o r i n r e g i o n s o f h i g h c e l l a c t i v i t y s u c h a s i n t i s s u e r e g e n e r a t i o n a n d b o n e f o r m a t i o n F G F 2 w a s o r i g i n a l l y i d e n t i f i e d i n b o v i n e p i t u i t a r y ( G o s p o d a r o w i c z 1 9 7 5 ) b u t w a s f i r s t p u r i f i e d f r o m g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s ( S u l l i v a n a n d K l a g s b r u n 1 9 8 5 ) w h e r e i t a f f e c t s v a r i o u s c e l l a c t i v i t i e s b y b i n d i n g t o t h e F G F R s e x p r e s s e d o n t h e c h o n d r o c y t e s u r f a c e T h e F G F R t h e n d i m e r i z e s a n d a u t o p h o s p h o r y l a t e s s e v e r a l i n t r a c e l l u l a r t y r o s i n e

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28 r e s i d u e s T h e s e p h o s p h o t y r o s i n e r e s i d u e s t h e n r e c r u i t p r o t e i n s t h a t a c t i v a t e k n o w n p r o l i f e r a t i v e c a s c a d e s s u c h a s t h e M A P k i n a s e p a t h w a y i n c e l l s D e s p i t e b e i n g m a d e b y d i v e r s e c e l l t y p e s F G F 2 i s t a r g e t e d s u b s t a n t i a l l y t o t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x o f c e l l s f o r s t o r a g e o n l o w a f f i n i t y r e c e p t o r s u n t i l n e e d e d P e r l e c a n i s t h e l o w a f f i n i t y r e c e p t o r f o r F G F 2 a n d F G F 1 8 i n t h e g r o w t h p l a t e ( r e f e r e n c e s : ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 6 ; S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) a n d P a p e r I I o f t h i s d i s s e r t a t i o n ) P e r l e c a n c a n a l s o f a c i l i t a t e t h e b i n d i n g o f F G F 2 t o i t s c h o n d r o c y t e r e c e p t o r s F G F R 1 ( p r e s e n t i n p r e h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s ) a n d F G F R 3 ( p r e s e n t i n p r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e s ) B o t h t h e F G F a n d t h e F G F R h a v e h e p a r i n / H S b i n d i n g s i t e s t h u s s u p p o r t i n g t h e i d e a o f a t e r n a r y c o m p l e x o f F G F F G F R a n d H S P G t h a t f o r m s t o m o d u l a t e F G F s i g n a l i n g ( O r n i t z a n d L e d e r 1 9 9 2 ; O r n i t z X u e t a l 1 9 9 6 ; O r n i t z a n d M a r i e 2 0 0 2 ) 5 b M u t a t i o n s W i t h i t s p l e i o t r o p i c l o c a l i z a t i o n a n d f u n c t i o n F G F 2 a l t e r s d i v e r s e p a t h w a y s i f m i s e x p r e s s e d M i c e w i t h a t a r g e t e d d e l e t i o n o f F G F 2 h a v e b e e n g e n e r a t e d a n d s t u d i e d ( D o n o T e x i d o e t a l 1 9 9 8 ; O r t e g a I t t m a n n e t a l 1 9 9 8 ; M o n t e r o O k a d a e t a l 2 0 0 0 ; A m a n n F a u l h a b e r e t a l 2 0 0 6 ) T h e s e n u l l m i c e a r e v i a b l e b u t s u f f e r f r o m r e d u c e d c a r d i a c c a p i l l a r y f o r m a t i o n ( t h u s l o w e r i n g t h e i r a b i l i t y t o r e s p o n d t o c a r d i a c h y p o x i a ) d e f e c t i v e b l o o d p r e s s u r e r e g u l a t i o n ( w h i c h l e a d s t o h y p o t e n s i o n ) i n e f f e c t i v e c o n t r o l o f v a s c u l a r t o n e a n d d e l a y e d w o u n d h e a l i n g T h e y a l s o e x h i b i t i m p a i r e d d e v e l o p m e n t o f t h e i r c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m M o s t i m p o r t a n t l y f o r o u r r e s e a r c h i n t e r e s t i n F G F 2 i s t h e a b s e n c e o f m a j o r d e f e c t s i n e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n i n t h e s e F G F 2 d e f i c i e n t m i c e T h e r e i s o n l y a m i l d a d u l t o n s e t o s t e o p e n i a ( d e c r e a s e d b o n e m i n e r a l d e n s i t y a n d b o n e

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29 f o r m a t i o n ) T h i s s l i g h t d e f e c t i n o s t e o g e n e s i s o c c u r r e d w i t h n o d e f e c t s i n c h o n d r o g e n e s i s H o w e v e r e a r l i e r s t u d i e s s h o w e d t h a t w h e n F G F 2 i s o v e r e x p r e s s e d i n a t r a n s g e n i c m o u s e m o d e l t h e r e s u l t i s a d w a r f m o u s e d u e t o d e c r e a s e d d i f f e r e n t i a t i o n o f c h o n d r o c y t e s f r o m t h e p r o l i f e r a t i v e i n t o t h e h y p e r t r o p h i c p h e n o t y p e ( C o f f i n F l o r k i e w i c z e t a l 1 9 9 5 ) F G F 2 i s t h u s a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f l o n g b o n e g r o w t h W i t h t h e s i m i l a r i t i e s o f t h e p e r l e c a n n u l l m o u s e t o t h e s e F G F 2 t r a n s g e n i c s F G F 2 b e c a m e a n i n t e r e s t i n g f o c u s f o r o u r r e s e a r c h i n t h e l a b W e f o u n d p r e v i o u s l y t h a t F G F 2 b i n d s t o p e r l e c a n f r o m t h e f e t a l b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e ( o u r m o d e l s y s t e m i n t h e l a b ) b u t i s n o t d e l i v e r e d t o t h e F G F R ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 6 ) a n d h a v e a l s o d i s c o v e r e d o n e o f t h e r e a s o n s f o r t h i s n o n d e l i v e r y T h e s e l a t t e r r e s u l t s a r e p r e s e n t e d i n P a p e r I o f t h i s d i s s e r t a t i o n F G F 1 8 6 a S t r u c t u r e / F u n c t i o n F G F 1 8 i s a p p r o x i m a t e l y 2 2 k D a i n i t s a c t i v e p r o c e s s e d f o r m F G F 1 8 i s 9 9 % c o n s e r v e d b e t w e e n h u m a n s a n d m i c e a n d s h o w s m o s t h o m o l o g y ( > 5 0 % ) t o F G F 8 a n d F G F 1 7 F G F 1 8 i s e x p r e s s e d i n a d u l t l u n g s k i d n e y l i v e r a n d s m a l l i n t e s t i n e i n a s p a t i a l a n d t e m p o r a l m a n n e r d i s t i n c t f r o m o t h e r F G F s s u g g e s t i n g t h a t F G F 1 8 h a s u n i q u e r o l e s i n c e l l a c t i v i t y ( O r n i t z 2 0 0 5 ) I n c a r t i l a g e F G F 1 8 i s e x p r e s s e d o n l y i n t h e p e r i c h o n d r i a l l a y e r a r o u n d t h e g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e T h i s e x p r e s s i o n p a t t e r n s u g g e s t s t h a t F G F 1 8 i s a p o t e n t i a l r e g u l a t o r o f l o n g b o n e g r o w t h F G F 1 8 b i n d s p r e f e r e n t i a l l y t o F G F R 3 b u t c a n a l s o b i n d F G F R 2 F G F 1 8 a l s o c o n t a i n s a h e p a r i n b i n d i n g d o m a i n a n d i s i n f a c t k n o w n t o b i n d t o h e p a r i n ( O r n i t z 2 0 0 5 ) I n c a r t i l a g e c h o n d r o g e n e s i s F G F 1 8 s t i m u l a t e s

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30 o s t e o b l a s t s a n d c h o n d r o c y t e s a s s t r o n g l y a s F G F 2 d o e s b u t i n a n F G F R 3 m e d i a t e d h e p a r i n / H S i n d e p e n d e n t m a n n e r F G F 1 8 i s a l s o k n o w n t o b i n d t o F G F R 2 t o c o n t r o l o s t e o g e n e s i s a n d V E G F t o c o n t r o l v a s c u l o g e n e s i s b o t h o f w h i c h a r e a l s o e s s e n t i a l s t e p s i n e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h ( L i u X u e t a l 2 0 0 2 ; O h b a y a s h i S h i b a y a m a e t a l 2 0 0 2 ; L i u L a v i n e e t a l 2 0 0 6 ) I n m a t u r e b o n e F G F 1 8 h a s b e e n s h o w n i m p o r t a n t f o r c a r t i l a g e r e p a i r ( M o o r e B e n d e l e e t a l 2 0 0 5 ) 6 b M u t a t i o n s S e v e r a l l i n e s o f m i c e w i t h a t a r g e t e d d i s r u p t i o n i n t h e i r F G F 1 8 g e n e h a v e b e e n i n d e p e n d e n t l y g e n e r a t e d b y d i f f e r e n t g r o u p s L i u e t a l ( L i u X u e t a l 2 0 0 2 ; L i u L a v i n e e t a l 2 0 0 6 ) g e n e r a t e d a n F G F 1 8 n u l l a l l e l e t h r o u g h h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n e l i m i n a t i n g e x o n 1 o f t h e c o d i n g r e g i o n M i c e h e t e r o z y g o u s f o r t h e n u l l a l l e l e w e r e p h e n o t y p i c a l l y n o r m a l H o w e v e r h o m o z y g o u s p r o g e n y f r o m t h e s e n o r m a l m u t a n t s d i e d w i t h i n t h i r t y m i n u t e s a f t e r b i r t h T h e i r d e f e c t s i n c l u d e d b e i n g 1 0 1 5 % s m a l l e r t h a n w i l d t y p e o r h e t e r o z y g o t e l i t t e r m a t e s m o r e t h a n 9 0 % h a v i n g c l e f t p a l a t e a n d r e s p i r a t o r y f a i l u r e d u e t o t h o r a c i c / r i b c a g e d e f o r m i t i e s I n t h e n u l l m u t a n t m o u s e o s s i f i c a t i o n w a s d e l a y e d b y ~ 2 d a y s c o m p a r e d t o n o r m a l l i t t e r m a t e s ; t h i s l e d t o s h o r t e n e d o s s i f i e d r e g i o n s i n b o n e s a n d t h e r e f o r e s h o r t e n i n g a n d c u r v a t u r e o f b o n e s s u c h a s t h o s e o f t h e f o r e a n d h i n d l i m b s C o o c c u r r i n g w i t h t h e s e d e f e c t s i n t h e a p p e n d i c u l a r s k e l e t o n o t h e r e n d o c h o n d r a l b o n e s s u c h a s t h e c r a n i o f a c i a l b o n e s w e r e a l s o a b n o r m a l T h e s k u l l w a s s m a l l e r a n d m o r e r o u n d e d i n F G F 1 8 n u l l m i c e a n d t h e j a w b o n e w a s u n d e r d e v e l o p e d A t t h e h i s t o l o g i c a l l e v e l t h e z o n e s o f p r o l i f e r a t i n g c e l l s i n t h e F G F 1 8 n u l l g r o w t h p l a t e s w e r e ~ 1 4 % l o n g e r a t E 1 6 5 S i m i l a r

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31 i n c r e a s e s w e r e s e e n i n t h e F G F R 3 n u l l m o u s e H o w e v e r f o r F G F 1 8 n u l l m i c e t h i s i n c r e a s e d i s a p p e a r s l a t e r i n e m b r y o g e n e s i s I n t h e F G F R 3 n u l l m i c e ( C o l v i n B o h n e e t a l 1 9 9 6 ) t h e s e e x p a n d e d p r o l i f e r a t i v e z o n e s r e s u l t i n o v e r g r o w t h o f l o n g b o n e s b u t i n t h e F G F 1 8 n u l l i t r e s u l t s i n d w a r f i s m s i n c e t h e i n c r e a s e i s o n l y t r a n s i e n t F r o m t h i s F G F 1 8 n u l l m o u s e l a c k o f F G F 1 8 w a s d i s c o v e r e d t o i n h i b i t c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n f o r t h e m a j o r i t y o f e m b r y o g e n e s i s l e a d i n g t o d w a r f i s m L i u e t a l ( L i u L a v i n e e t a l 2 0 0 6 ) l a t e r d i s c o v e r e d t h a t a s e a r l y a s a t E 1 4 5 o f e m b r y o g e n e s i s ( w h e n c r a n i a l o s s i f i c a t i o n b e g i n s i n w i l d t y p e m i c e b u t n o t i n t h e n u l l m i c e a n d l i m b f o r m a t i o n i s a l r e a d y u n d e r w a y i n b o t h ) t h e n u l l m i c e a c t u a l l y h a v e 2 6 3 1 % s h o r t e r p r o l i f e r a t i v e a n d h y p e r t r o p h i c z o n e s T h i s i s i n c o n t r a s t t o t h e i n c r e a s e d p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f c h o n d r o c y t e s a t E 1 6 5 a n d i n s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t p r o l i f e r a t i o n a t E 1 8 5 ( O h b a y a s h i S h i b a y a m a e t a l 2 0 0 2 ) A m u l t i p h a s i c a c t i o n o f F G F 1 8 o c c u r s t h e n w h e r e t h e s a m e c h o n d r o c y t e s a t a n o r g a n i s m s d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s r e s p o n d d i f f e r e n t l y t o F G F 1 8 / F G F R 3 s i g n a l i n g E a r l i e r o n ( E 1 4 5 ) t h i s s i g n a l i n g i n n o r m a l e m b r y o s i s m i t o g e n i c a n d d i f f e r e n t i a t i v e l e a d i n g t o n o r m a l l y h i g h p r o d u c t i o n o f p r o l i f e r a t i v e a n d h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s L a t e r o n ( E 1 6 5 ) t h e F G F 1 8 / F G F R 3 s i g n a l i s n o r m a l l y a n t i p r o l i f e r a t i v e a n d a n t i d i f f e r e n t i a t i v e r e i g n i n g i n t h e c h o n d r o c y t e a c t i v i t y s o p r o p e r h y p e r t r o p h i c z o n e b o n e s y n t h e s i s c a n o c c u r A s e m b r y o g e n e s i s c o n t i n u e s ( E 1 8 5 ) t h e n o r m a l c h o n d r o c y t e s p a r t l y r e v e r t t o b e i n g s t i m u l a t e d b y F G F 1 8 / F G F R 3 c a u s i n g a n e w l y i n c r e a s e d p o o l o f p r o l i f e r a t i n g c e l l s a n d o f d i f f e r e n t i a t e d h y p e r t r o p h i c c e l l s e n c o u r a g i n g c o n t i n u e d e n d o c h o n d r a l g r o w t h U n l i k e t h e s i m i l a r c h o n d r o c y t e p h e n o t y p e s s e e n i n t h e t w o m o u s e m o d e l s t h e d e l a y e d o s s i f i c a t i o n i n F G F 1 8 n u l l m i c e w a s n o t

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32 s e e n i n t h e F G F R 3 n u l l m i c e I n c o n t r a s t t o c h o n d r o g e n e s i s t h e n F G F 1 8 d o e s n o t s i g n a l t h r o u g h F G F R 3 t o c o n t r o l o s t e o g e n e s i s I t i s t h o u g h t t h a t F G F 1 8 m o s t l i k e l y p r o m o t e s o s t e o b l a s t m a t u r a t i o n a n d p r o l i f e r a t i o n t h r o u g h F G F R 1 e x p r e s s e d i n h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s o r F G F R 2 e x p r e s s e d i n t h e p e r i c h o n d r i u m W h i l e r e g u l a t i n g c h o n d r o g e n e s i s v i a F G F R 3 F G F 1 8 i s t h e r e f o r e a l s o r e g u l a t i n g o s t e o g e n e s i s v i a F G F R 1 a n d / o r F G F R 2 a n d r e g u l a t i n g v a s c u l o g e n e s i s v i a V E G F a s d e s c r i b e d e a r l i e r H i s t o n e H 3 7 a S t r u c t u r e / F u n c t i o n H i s t o n e s l i k e F G F s a r e a n o t h e r s e t o f d e v e l o p m e n t a l l y i m p o r t a n t p r o t e i n s T h e y a r e h i g h l y c a t i o n i c p r o t e i n s e s s e n t i a l f o r b i n d i n g a n d c o m p a c t i n g c h r o m a t i n i n t h e n u c l e u s o f m a m m a l i a n c e l l s T h e c o m p a c t n a t u r e o f t h e c h r o m a t i n f i b e r s r e s t r i c t s t h e i n t e r a c t i o n o f p r o t e i n s w i t h D N A a n d r e g u l a t e s g e n e a c t i v i t y T h e c h r o m a t i n c o n s i s t s o f r e p e t i t i v e u n i t s c a l l e d n u c l e o s o m e s w h i c h c o n s i s t o f a n o c t a m e r o f h i s t o n e s ( t w o e a c h o f H 2 A H 2 B H 3 a n d H 4 ) a r o u n d w h i c h t w o s u p e r h e l i c a l t u r n s o f D N A a r e w r a p p e d T h i s c o r e p a r t i c l e i s t h e n f o l l o w e d b y a D N A r e g i o n t h a t l i n k s a d j a c e n t n u c l e o s o m e p a r t i c l e s ( S c h m i e d e k e S t o c k l e t a l 1 9 8 9 ) H i s t o n e H 3 i s ~ 1 9 k D a i n s i z e L i k e a t y p i c a l h i s t o n e i t h a s m a n y b a s i c r e s i d u e s H 3 h o w e v e r a l s o h a s a n A r g i n i n e r e p e a t ( R R x R ) s e q u e n c e n e a r i t s C t e r m i n u s w h i c h a l i g n s p e r f e c t l y w i t h t h e c o n s e n s u s h e p a r i n b i n d i n g s e q u e n c e Y Y x Y w h e r e Y = A r g i n i n e o r L y s i n e H i s t o n e s a r e i n d e e d k n o w n t o b i n d t o h e p a r i n a n d H S ( S c h m i e d e k e S t o c k l e t a l 1 9 8 9 ; W a t s o n G o o d e r h a m e t a l 1 9 9 9 ; H e n r i q u e z C a s a r e t a l 2 0 0 2 ) T h i s b i n d i n g o c c u r s b o t h i n t h e n u c l e u s a n d e x t r a n u c l e a r l y T h e e x t r a n u c l e a r l o c a l i z a t i o n o f h i s t o n e s h a s b e e n

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33 s h o w n w i d e l y ( S c h m i e d e k e S t o c k l e t a l 1 9 8 9 ; W a t s o n E d w a r d s e t a l 1 9 9 5 ; H e n r i q u e z C a s a r e t a l 2 0 0 2 ) 7 b M u t a t i o n s T o d a t e n o h i s t o n e k n o c k o u t m u t a n t s h a v e b e e n g e n e r a t e d W i t h t h e i n t e g r a l r o l e o f t h e h i s t o n e s i n c h r o m a t i n s t r u c t u r e a n d g e n e a c t i v i t y I w o u l d s p e c u l a t e t h a t c o m p l e t e l o s s o f e v e n a s i n g l e h i s t o n e s u c h a s H 3 w o u l d b e i n c o m p a t i b l e w i t h l i f e H i s t o n e H 3 h a s m u l t i p l e r e s i d u e s t h a t c a n b e p o s t t r a n s l a t i o n a l l y m o d i f i e d b y a c e t y l m e t h y l a n d p h o s p h a t e g r o u p s S u c h c o o r d i n a t e d m o d i f i c a t i o n o f h i s t o n e s c o n t r o l s c h r o m a t i n s t r u c t u r e a n d t h e a c c e s s i b i l i t y o f t r a n s c r i p t i o n a l p r o t e i n s t o t h e D N A t h u s r e g u l a t i n g g e n e a c t i v i t y ( W a t s o n G o o d e r h a m e t a l 1 9 9 9 ) F o r e x a m p l e h i s t o n e a c e t y l a t i o n i s c a t a l y z e d b y h i s t o n e a c e t y l t r a n s f e r a s e s ( H A T s ) t o r e l a x c h r o m a t i n s t r u c t u r e a n d p r o m o t e g e n e t r a n s c r i p t i o n w h e n t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s g a i n a c c e s s t o t h e D N A H i s t o n e d e a c e t y l a s e s ( H D A C s ) m o d i f y t h e h i s t o n e s t o c o u n t e r b a l a n c e t h e a c t i v a t i n g e f f e c t s o f H A T s S e v e r a l H D A C s h a v e b e e n k n o c k e d o u t i n m o u s e m o d e l s i n c l u d i n g H D A C 4 5 a n d 9 O n l y m i c e l a c k i n g H D A C 4 e x h i b i t s k e l e t a l d e f e c t s ( V e g a M a t s u d a e t a l 2 0 0 4 ) T h e g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s o f t h e s e H D A C 4 n u l l m i c e s h o w e d p r e m a t u r e h y p e r t r o p h y l e a d i n g t o p r e m a t u r e o s s i f i c a t i o n a n d e c t o p i c f o r m a t i o n o f b o n e i n n o r m a l l y c a r t i l a g i n o u s e l e m e n t s T h e s e d e f e c t s a f f e c t e d t h e m u t a n t s v i a b i l i t y b y m a k i n g i t d i f f i c u l t t o b r e a t h e m o v e a n d s u c k l e I n f a c t n o H D A C 4 n u l l m i c e s u r v i v e d t o w e a n i n g H D A C 4 i s n o r m a l l y e x p r e s s e d i n h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s T h e k n o c k o u t m o d e l h a s s h o w n t h a t H D A C 4 n o r m a l l y b i n d s t o R u n x 2 a n d i n h i b i t s i t s a c t i v i t y R u n x 2 i s t h e o n l y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r p r o v e n n e c e s s a r y f o r c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y a n d o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n ( I n a d a

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34 Y a s u i e t a l 1 9 9 9 ; K i m O t t o e t a l 1 9 9 9 ) R u n x 2 m u s t b e r e g u l a t e d d u r i n g c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y s o t h a t p r e m a t u r e a n d e v e n e c t o p i c b o n e f o r m a t i o n d o e s n o t o c c u r H D A C 4 n e g a t i v e l y r e g u l a t e s R u n x 2 W i t h H D A C 4 m i s s i n g i n t h i s m o u s e m o d e l R u n x 2 c a u s e s a b n o r m a l d i f f e r e n t i a t i o n o f c h o n d r o c y t e s r e s u l t i n g i n s k e l e t a l d w a r f i s m T h e m a j o r h i s t o n e r e l a t e d t o t h i s p a t h o f e v e n t s i s h i s t o n e H 3 H 3 n o r m a l l y s i t s o n t h e R u n x 2 p r o m o t e r i n h i b i t i n g t h e R u n x 2 g e n e a c t i v i t y a n d s u b s e q u e n t p r o d u c t i o n o f R u n x 2 p r o t e i n i n p r o l i f e r a t i n g c e l l s W i t h H D A C 4 m i s s i n g i n t h e k n o c k o u t ( V e g a M a t s u d a e t a l 2 0 0 4 ) H 3 i s h y p e r a c e t y l a t e d l e a v e s t h e R u n x 2 p r o m o t e r a n d t h e R u n x 2 g e n e i s a c t i v a t e d W i t h H D A C 4 i n t a c t h y p o a c e t y l a t e d H 3 i n t e r a c t s w i t h D N A a n d H S m o r e k e e p i n g i t o n t h e R u n x 2 p r o m o t e r i n h i b i t i n g R u n x 2 p r o d u c t i o n a n d p r o m o t i n g c o n t i n u e d c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d r e d u c e d d i f f e r e n t i a t i o n t o h y p e r t r o p h i c s t a t e s W i t h t h e i m p o r t a n c e o f p e r l e c a n a n d n o w H 3 i n r e t a i n i n g c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n p e r l e c a n m i g h t a g a i n b e i n a t e r n a r y c o m p l e x o f n e g a t i v e D N A p o s i t i v e h i s t o n e H 3 a n d t h e n e g a t i v e H S a c o m p l e x t h a t i n h i b i t s R u n x 2 g e n e a c t i v i t y a n d k e e p s c h o n d r o c y t e s p r o l i f e r a t i n g u n t i l c e l l s i g n a l s t r i g g e r h y p e r t r o p h y O u t l i n e T h e r e m a i n d e r o f t h i s d i s s e r t a t i o n w i l l p r e s e n t t h e f i n d i n g s o f m y r e s e a r c h p r o j e c t o f c h a r a c t e r i z i n g t h e b i n d i n g o f p e r l e c a n t o k n o w n a n d n o v e l b i n d i n g p a r t n e r s u s i n g t h e g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e f r o m f e t a l b o v i n e r i b s a s o u r m o d e l s y s t e m M y f i r s t s p e c i f i c a i m w a s t o s t u d y t h e b i n d i n g o f F G F 2 t o g r o w t h p l a t e p e r l e c a n a n d t o d e t e r m i n e w h a t p o r t i o n s o f p e r l e c a n a r e i n v o l v e d i n F G F 2 b i n d i n g a n d w h i c h p o r t i o n s a r e b l o c k i n g t h e d e l i v e r y o f t h i s g r o w t h f a c t o r t o i t s r e c e p t o r a s h a d b e e n p r e v i o u s l y d i s c o v e r e d T h e s e f i n d i n g s a r e

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35 s u m m a r i z e d i n P a p e r I T h e s p e c i f i c a i m f o r P a p e r I I w a s t o o b s e r v e w h e t h e r p e r l e c a n c o u l d b i n d t o F G F 1 8 I n t h a t p a p e r I s h o w t h a t p e r l e c a n c a n b i n d t o F G F 1 8 a n d I c h a r a c t e r i z e t h e k i n e t i c s a n d s p e c i f i c i t y o f t h e i r b i n d i n g F o r P a p e r I I I m y s p e c i f i c a i m w a s t o f i n d n o v e l b i n d i n g p a r t n e r s o f p e r l e c a n t h a t a r e e n d o g e n o u s t o t h e g r o w t h p l a t e H i s t o n e H 3 i s p r e s e n t e d i n P a p e r I I I a s a t h i r d k e y d e v e l o p m e n t a l p r o t e i n t o w h i c h g r o w t h p l a t e p e r l e c a n b i n d s A b r i e f d i s c u s s i o n o f t h e m a j o r f i n d i n g s o f m y d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h f o l l o w s P a p e r s I I I I I n c l u d e d a f t e r t h i s d i s c u s s i o n i s a n A p p e n d i x c o n t a i n i n g a r e v i e w p a p e r r e g a r d i n g t h e r o l e o f p e r l e c a n i n r e g u l a t i n g o c u l a r f u n c t i o n

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36 R e f e r e n c e s f o r I n t r o d u c t i o n A b a d V J L M e y e r s e t a l ( 2 0 0 2 ) T h e r o l e o f t h e r e s t i n g z o n e i n g r o w t h p l a t e c h o n d r o g e n e s i s E n d o c r i n o l o g y 1 4 3 ( 5 ) : 1 8 5 1 7 A m a n n K J F a u l h a b e r e t a l ( 2 0 0 6 ) I m p a i r e d m y o c a r d i a l c a p i l l a r o g e n e s i s a n d i n c r e a s e d a d a p t i v e c a p i l l a r y g r o w t h i n F G F 2 d e f i c i e n t m i c e L a b I n v e s t 8 6 ( 1 ) : 4 5 5 3 A n d e r s o n H C H H H s u e t a l ( 1 9 9 7 ) M a t r i x v e s i c l e s i n o s t e o m a l a c i c h y p o p h o s p h a t a s i a b o n e c o n t a i n a p a t i t e l i k e m i n e r a l c r y s t a l s A m J P a t h o l 1 5 1 ( 6 ) : 1 5 5 5 6 1 A r i k a w a H i r a s a w a E H W a t a n a b e e t a l ( 1 9 9 9 ) P e r l e c a n i s e s s e n t i a l f o r c a r t i l a g e a n d c e p h a l i c d e v e l o p m e n t N a t G e n e t 2 3 ( 3 ) : 3 5 4 8 A r i k a w a H i r a s a w a E W R W i l c o x e t a l ( 2 0 0 1 ) D y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e i s c a u s e d b y f u n c t i o n a l n u l l m u t a t i o n s o f t h e p e r l e c a n g e n e N a t G e n e t 2 7 ( 4 ) : 4 3 1 4 A r i k a w a H i r a s a w a E W R W i l c o x e t a l ( 2 0 0 1 ) D y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e : u n e x p e c t e d r o l e o f p e r l e c a n i n c a r t i l a g e d e v e l o p m e n t A m J M e d G e n e t 1 0 6 ( 4 ) : 2 5 4 7 B a l l o c k R T a n d R J O K e e f e ( 2 0 0 3 ) P h y s i o l o g y a n d p a t h o p h y s i o l o g y o f t h e g r o w t h p l a t e B i r t h D e f e c t s R e s C E m b r y o T o d a y 6 9 ( 2 ) : 1 2 3 4 3 B e n g t s s o n E M M o r g e l i n e t a l ( 2 0 0 2 ) T h e l e u c i n e r i c h r e p e a t p r o t e i n P R E L P b i n d s p e r l e c a n a n d c o l l a g e n s a n d m a y f u n c t i o n a s a b a s e m e n t m e m b r a n e a n c h o r J B i o l C h e m 2 7 7 ( 1 7 ) : 1 5 0 6 1 8 B e n g t s s o n T A A s z o d i e t a l ( 2 0 0 5 ) L o s s o f a l p h a 1 0 b e t a 1 i n t e g r i n e x p r e s s i o n l e a d s t o m o d e r a t e d y s f u n c t i o n o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s J C e l l S c i 1 1 8 ( P t 5 ) : 9 2 9 3 6 B i W J M D e n g e t a l ( 1 9 9 9 ) S o x 9 i s r e q u i r e d f o r c a r t i l a g e f o r m a t i o n N a t G e n e t 2 2 ( 1 ) : 8 5 9 B o r k P a n d L P a t t h y ( 1 9 9 5 ) T h e S E A m o d u l e : a n e w e x t r a c e l l u l a r d o m a i n a s s o c i a t e d w i t h O g l y c o s y l a t i o n P r o t e i n S c i 4 ( 7 ) : 1 4 2 1 5

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37 C a m a c h o H u b n e r C K A W o o d s e t a l ( 1 9 9 9 ) I n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o r I d e f i c i e n c y c a u s e d b y a p a r t i a l d e l e t i o n o f t h e I G F I g e n e : e f f e c t s o f r h I G F I t h e r a p y G r o w t h H o r m I G F R e s 9 S u p p l B : 4 7 5 1 ; d i s c u s s i o n 5 1 2 C a s t i l l o G M C N g o e t a l ( 1 9 9 7 ) P e r l e c a n b i n d s t o t h e b e t a a m y l o i d p r o t e i n s ( A b e t a ) o f A l z h e i m e r s d i s e a s e a c c e l e r a t e s A b e t a f i b r i l f o r m a t i o n a n d m a i n t a i n s A b e t a f i b r i l s t a b i l i t y J N e u r o c h e m 6 9 ( 6 ) : 2 4 5 2 6 5 C h a k r a v a r t i S T H o r c h a r e t a l ( 1 9 9 5 ) R e c o m b i n a n t d o m a i n I I I o f p e r l e c a n p r o m o t e s c e l l a t t a c h m e n t t h r o u g h i t s R G D S s e q u e n c e J B i o l C h e m 2 7 0 ( 1 ) : 4 0 4 9 C o f f i n J D R Z F l o r k i e w i c z e t a l ( 1 9 9 5 ) A b n o r m a l b o n e g r o w t h a n d s e l e c t i v e t r a n s l a t i o n a l r e g u l a t i o n i n b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F 2 ) t r a n s g e n i c m i c e M o l B i o l C e l l 6 ( 1 2 ) : 1 8 6 1 7 3 C o l v i n J S B A B o h n e e t a l ( 1 9 9 6 ) S k e l e t a l o v e r g r o w t h a n d d e a f n e s s i n m i c e l a c k i n g f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 N a t G e n e t 1 2 ( 4 ) : 3 9 0 7 C o s t e l l M E G u s t a f s s o n e t a l ( 1 9 9 9 ) P e r l e c a n m a i n t a i n s t h e i n t e g r i t y o f c a r t i l a g e a n d s o m e b a s e m e n t m e m b r a n e s J C e l l B i o l 1 4 7 ( 5 ) : 1 1 0 9 2 2 C o s t e l l M T S a s a k i e t a l ( 1 9 9 6 ) S t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f r e c o m b i n a n t d o m a i n I I o f t h e b a s e m e n t m e m b r a n e p r o t e o g l y c a n p e r l e c a n F E B S L e t t 3 9 6 ( 2 3 ) : 1 2 7 3 1 C o u c h m a n J R R K a p o o r e t a l ( 1 9 9 6 ) P e r l e c a n a n d b a s e m e n t m e m b r a n e c h o n d r o i t i n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n ( b a m a c a n ) a r e t w o b a s e m e n t m e m b r a n e c h o n d r o i t i n / d e r m a t a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s i n t h e E n g e l b r e t h H o l m S w a r m t u m o r m a t r i x J B i o l C h e m 2 7 1 ( 1 6 ) : 9 5 9 5 6 0 2 C o u c h m a n J R A V L j u b i m o v e t a l ( 1 9 9 5 ) A n t i b o d y m a p p i n g a n d t i s s u e l o c a l i z a t i o n o f g l o b u l a r a n d c y s t e i n e r i c h r e g i o n s o f p e r l e c a n d o m a i n I I I J H i s t o c h e m C y t o c h e m 4 3 ( 9 ) : 9 5 5 6 3 D A n g e l o M Z Y a n e t a l ( 2 0 0 0 ) M M P 1 3 i s i n d u c e d d u r i n g c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y J C e l l B i o c h e m 7 7 ( 4 ) : 6 7 8 9 3 D a v i d s o n D A B l a n c e t a l ( 2 0 0 5 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) 1 8 s i g n a l s t h r o u g h F G F r e c e p t o r 3 t o p r o m o t e c h o n d r o g e n e s i s J B i o l C h e m 2 8 0 ( 2 1 ) : 2 0 5 0 9 1 5

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38 d e C r o m b r u g g h e B V L e f e b v r e e t a l ( 2 0 0 0 ) T r a n s c r i p t i o n a l m e c h a n i s m s o f c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n M a t r i x B i o l 1 9 ( 5 ) : 3 8 9 9 4 D e n g C A W y n s h a w B o r i s e t a l ( 1 9 9 6 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 i s a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f b o n e g r o w t h C e l l 8 4 ( 6 ) : 9 1 1 2 1 D o l a n M T H o r c h a r e t a l ( 1 9 9 7 ) I d e n t i f i c a t i o n o f s i t e s i n d o m a i n I o f p e r l e c a n t h a t r e g u l a t e h e p a r a n s u l f a t e s y n t h e s i s J B i o l C h e m 2 7 2 ( 7 ) : 4 3 1 6 2 2 D o n o R G T e x i d o e t a l ( 1 9 9 8 ) I m p a i r e d c e r e b r a l c o r t e x d e v e l o p m e n t a n d b l o o d p r e s s u r e r e g u l a t i o n i n F G F 2 d e f i c i e n t m i c e E m b o J 1 7 ( 1 5 ) : 4 2 1 3 2 5 F a r n u m C E a n d N J W i l s m a n ( 1 9 8 9 ) C o n d e n s a t i o n o f h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s a t t h e c h o n d r o o s s e o u s j u n c t i o n o f g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e i n Y u c a t a n s w i n e : r e l a t i o n s h i p t o l o n g b o n e g r o w t h A m J A n a t 1 8 6 ( 4 ) : 3 4 6 5 8 F a r n u m C E a n d N J W i l s m a n ( 1 9 9 3 ) D e t e r m i n a t i o n o f p r o l i f e r a t i v e c h a r a c t e r i s t i c s o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s b y l a b e l i n g w i t h b r o m o d e o x y u r i d i n e C a l c i f T i s s u e I n t 5 2 ( 2 ) : 1 1 0 9 F o s t e r J W M A D o m i n g u e z S t e g l i c h e t a l ( 1 9 9 4 ) C a m p o m e l i c d y s p l a s i a a n d a u t o s o m a l s e x r e v e r s a l c a u s e d b y m u t a t i o n s i n a n S R Y r e l a t e d g e n e N a t u r e 3 7 2 ( 6 5 0 6 ) : 5 2 5 3 0 G a r o f a l o S M K l i g e r S p a t z e t a l ( 1 9 9 9 ) S k e l e t a l d y s p l a s i a a n d d e f e c t i v e c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n b y t a r g e t e d o v e r e x p r e s s i o n o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 9 i n t r a n s g e n i c m i c e J B o n e M i n e r R e s 1 4 ( 1 1 ) : 1 9 0 9 1 5 G a r o f a l o S E V u o r i o e t a l ( 1 9 9 1 ) R e d u c e d a m o u n t s o f c a r t i l a g e c o l l a g e n f i b r i l s a n d g r o w t h p l a t e a n o m a l i e s i n t r a n s g e n i c m i c e h a r b o r i n g a g l y c i n e t o c y s t e i n e m u t a t i o n i n t h e m o u s e t y p e I I p r o c o l l a g e n a l p h a 1 c h a i n g e n e P r o c N a t l A c a d S c i U S A 8 8 ( 2 1 ) : 9 6 4 8 5 2 G e r b e r H P T H V u e t a l ( 1 9 9 9 ) V E G F c o u p l e s h y p e r t r o p h i c c a r t i l a g e r e m o d e l i n g o s s i f i c a t i o n a n d a n g i o g e n e s i s d u r i n g e n d o c h o n d r a l b o n e f o r m a t i o n N a t M e d 5 ( 6 ) : 6 2 3 8 G o s p o d a r o w i c z D ( 1 9 7 5 ) P u r i f i c a t i o n o f a f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r f r o m b o v i n e p i t u i t a r y J B i o l C h e m 2 5 0 ( 7 ) : 2 5 1 5 2 0

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39 G o v i n d r a j P L W e s t e t a l ( 2 0 0 2 ) I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e m a j o r h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s i n t h e d e v e l o p i n g b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e J B i o l C h e m 2 7 7 ( 2 2 ) : 1 9 4 6 1 9 G o v i n d r a j P L W e s t e t a l ( 2 0 0 6 ) M o d u l a t i o n o f F G F 2 b i n d i n g t o c h o n d r o c y t e s f r o m t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e b y p e r l e c a n M a t r i x B i o l 2 5 ( 4 ) : 2 3 2 9 H a l l B K a n d T M i y a k e ( 2 0 0 0 ) A l l f o r o n e a n d o n e f o r a l l : c o n d e n s a t i o n s a n d t h e i n i t i a t i o n o f s k e l e t a l d e v e l o p m e n t B i o e s s a y s 2 2 ( 2 ) : 1 3 8 4 7 H a s c a l l V C A C a l a b r o e t a l ( 1 9 9 4 ) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o t e o g l y c a n s M e t h o d s E n z y m o l 2 3 0 : 3 9 0 4 1 7 H a s s e l l J Y Y a m a d a e t a l ( 2 0 0 2 ) R o l e o f p e r l e c a n i n s k e l e t a l d e v e l o p m e n t a n d d i s e a s e s G l y c o c o n j J 1 9 ( 4 5 ) : 2 6 3 7 H a s s e l l J R P G R o b e y e t a l ( 1 9 8 0 ) I s o l a t i o n o f a h e p a r a n s u l f a t e c o n t a i n i n g p r o t e o g l y c a n f r o m b a s e m e n t m e m b r a n e P r o c N a t l A c a d S c i U S A 7 7 ( 8 ) : 4 4 9 4 8 H a t o r i M K J K l a t t e e t a l ( 1 9 9 5 ) E n d l a b e l i n g s t u d i e s o f f r a g m e n t e d D N A i n t h e a v i a n g r o w t h p l a t e : e v i d e n c e o f a p o p t o s i s i n t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d c h o n d r o c y t e s J B o n e M i n e r R e s 1 0 ( 1 2 ) : 1 9 6 0 8 H e c h t J T C R H a l l e t a l ( 2 0 0 2 ) H e p a r a n s u l f a t e a b n o r m a l i t i e s i n e x o s t o s i s g r o w t h p l a t e s B o n e 3 1 ( 1 ) : 1 9 9 2 0 4 H e n r i q u e z J P J C C a s a r e t a l ( 2 0 0 2 ) E x t r a c e l l u l a r m a t r i x h i s t o n e H 1 b i n d s t o p e r l e c a n i s p r e s e n t i n r e g e n e r a t i n g s k e l e t a l m u s c l e a n d s t i m u l a t e s m y o b l a s t p r o l i f e r a t i o n J C e l l S c i 1 1 5 ( P t 1 0 ) : 2 0 4 1 5 1 H u n z i k e r E B ( 1 9 9 4 ) M e c h a n i s m o f l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h a n d i t s r e g u l a t i o n b y g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s M i c r o s c R e s T e c h 2 8 ( 6 ) : 5 0 5 1 9 H u n z i k e r E B E K a p f i n g e r e t a l ( 1 9 9 9 ) H y p e r t r o p h y o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s i n v i v o i s a c c o m p a n i e d b y m o d u l a t i o n s i n t h e a c t i v i t y s t a t e a n d s u r f a c e a r e a o f t h e i r c y t o p l a s m i c o r g a n e l l e s H i s t o c h e m C e l l B i o l 1 1 2 ( 2 ) : 1 1 5 2 3

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40 H u n z i k e r E B R K S c h e n k e t a l ( 1 9 8 7 ) Q u a n t i t a t i o n o f c h o n d r o c y t e p e r f o r m a n c e i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e d u r i n g l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h J B o n e J o i n t S u r g A m 6 9 ( 2 ) : 1 6 2 7 3 I n a d a M T Y a s u i e t a l ( 1 9 9 9 ) M a t u r a t i o n a l d i s t u r b a n c e o f c h o n d r o c y t e s i n C b f a 1 d e f i c i e n t m i c e D e v D y n 2 1 4 ( 4 ) : 2 7 9 9 0 I o z z o R V ( 1 9 9 4 ) P e r l e c a n : a g e m o f a p r o t e o g l y c a n M a t r i x B i o l 1 4 ( 3 ) : 2 0 3 8 I o z z o R V ( 2 0 0 5 ) B a s e m e n t m e m b r a n e p r o t e o g l y c a n s : f r o m c e l l a r t o c e i l i n g N a t R e v M o l C e l l B i o l 6 ( 8 ) : 6 4 6 5 6 I o z z o R V I R C o h e n e t a l ( 1 9 9 4 ) T h e b i o l o g y o f p e r l e c a n : t h e m u l t i f a c e t e d h e p a r a n s u l p h a t e p r o t e o g l y c a n o f b a s e m e n t m e m b r a n e s a n d p e r i c e l l u l a r m a t r i c e s B i o c h e m J 3 0 2 ( P t 3 ) : 6 2 5 3 9 I o z z o R V J P i l l a r i s e t t i e t a l ( 1 9 9 7 ) S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e h u m a n p e r l e c a n g e n e p r o m o t e r T r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n b y t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a v i a a n u c l e a r f a c t o r 1 b i n d i n g e l e m e n t J B i o l C h e m 2 7 2 ( 8 ) : 5 2 1 9 2 8 K a r a p l i s A C A L u z e t a l ( 1 9 9 4 ) L e t h a l s k e l e t a l d y s p l a s i a f r o m t a r g e t e d d i s r u p t i o n o f t h e p a r a t h y r o i d h o r m o n e r e l a t e d p e p t i d e g e n e G e n e s D e v 8 ( 3 ) : 2 7 7 8 9 K a r p S J E S c h i p a n i e t a l ( 2 0 0 0 ) I n d i a n h e d g e h o g c o o r d i n a t e s e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h a n d m o r p h o g e n e s i s v i a p a r a t h y r o i d h o r m o n e r e l a t e d p r o t e i n d e p e n d e n t a n d i n d e p e n d e n t p a t h w a y s D e v e l o p m e n t 1 2 7 ( 3 ) : 5 4 3 8 K i m I S F O t t o e t a l ( 1 9 9 9 ) R e g u l a t i o n o f c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n b y C b f a 1 M e c h D e v 8 0 ( 2 ) : 1 5 9 7 0 K n u d s o n C B a n d W K n u d s o n ( 2 0 0 1 ) C a r t i l a g e p r o t e o g l y c a n s S e m i n C e l l D e v B i o l 1 2 ( 2 ) : 6 9 7 8 K r o n e n b e r g H M ( 2 0 0 3 ) D e v e l o p m e n t a l r e g u l a t i o n o f t h e g r o w t h p l a t e N a t u r e 4 2 3 ( 6 9 3 7 ) : 3 3 2 6

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41 L e f e b v r e V P L i e t a l ( 1 9 9 8 ) A n e w l o n g f o r m o f S o x 5 ( L S o x 5 ) S o x 6 a n d S o x 9 a r e c o e x p r e s s e d i n c h o n d r o g e n e s i s a n d c o o p e r a t i v e l y a c t i v a t e t h e t y p e I I c o l l a g e n g e n e E m b o J 1 7 ( 1 9 ) : 5 7 1 8 3 3 L i H N B S c h w a r t z e t a l ( 1 9 9 3 ) c D N A c l o n i n g o f c h i c k c a r t i l a g e c h o n d r o i t i n s u l f a t e ( a g g r e c a n ) c o r e p r o t e i n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f a s t o p c o d o n i n t h e a g g r e c a n g e n e a s s o c i a t e d w i t h t h e c h o n d r o d y s t r o p h y n a n o m e l i a J B i o l C h e m 2 6 8 ( 3 1 ) : 2 3 5 0 4 1 1 L i u Z K J L a v i n e e t a l ( 2 0 0 6 ) F G F 1 8 i s r e q u i r e d f o r e a r l y c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n h y p e r t r o p h y a n d v a s c u l a r i n v a s i o n o f t h e g r o w t h p l a t e D e v B i o l L i u Z J X u e t a l ( 2 0 0 2 ) C o o r d i n a t i o n o f c h o n d r o g e n e s i s a n d o s t e o g e n e s i s b y f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 1 8 G e n e s D e v 1 6 ( 7 ) : 8 5 9 6 9 L o e s e r R F ( 2 0 0 0 ) C h o n d r o c y t e i n t e g r i n e x p r e s s i o n a n d f u n c t i o n B i o r h e o l o g y 3 7 ( 1 2 ) : 1 0 9 1 6 L u a n Y C A P r a u l e t a l ( 1 9 9 6 ) B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r : a n a u t o c r i n e g r o w t h f a c t o r f o r e p i p h y s e a l g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s J C e l l B i o c h e m 6 2 ( 3 ) : 3 7 2 8 2 M a c i a s D Y G a n a n e t a l ( 1 9 9 7 ) R o l e o f B M P 2 a n d O P 1 ( B M P 7 ) i n p r o g r a m m e d c e l l d e a t h a n d s k e l e t o g e n e s i s d u r i n g c h i c k l i m b d e v e l o p m e n t D e v e l o p m e n t 1 2 4 ( 6 ) : 1 1 0 9 1 7 M a g n e D M J u l i e n e t a l ( 2 0 0 5 ) C a r t i l a g e f o r m a t i o n i n g r o w t h p l a t e a n d a r t e r i e s : f r o m p h y s i o l o g y t o p a t h o l o g y B i o e s s a y s 2 7 ( 7 ) : 7 0 8 1 6 M a n c i l l a E E F D e L u c a e t a l ( 1 9 9 8 ) E f f e c t s o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 o n l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h E n d o c r i n o l o g y 1 3 9 ( 6 ) : 2 9 0 0 4 M e t s a r a n t a M S G a r o f a l o e t a l ( 1 9 9 2 ) C h o n d r o d y s p l a s i a i n t r a n s g e n i c m i c e h a r b o r i n g a 1 5 a m i n o a c i d d e l e t i o n i n t h e t r i p l e h e l i c a l d o m a i n o f p r o a l p h a 1 ( I I ) c o l l a g e n c h a i n J C e l l B i o l 1 1 8 ( 1 ) : 2 0 3 1 2 M i n i n a E C K r e s c h e l e t a l ( 2 0 0 2 ) I n t e r a c t i o n o f F G F I h h / P t h l h a n d B M P s i g n a l i n g i n t e g r a t e s c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d h y p e r t r o p h i c d i f f e r e n t i a t i o n D e v C e l l 3 ( 3 ) : 4 3 9 4 9

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42 M o h a n S C R i c h m a n e t a l ( 2 0 0 3 ) I n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o r r e g u l a t e s p e a k b o n e m i n e r a l d e n s i t y i n m i c e b y b o t h g r o w t h h o r m o n e d e p e n d e n t a n d i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s E n d o c r i n o l o g y 1 4 4 ( 3 ) : 9 2 9 3 6 M o n g i a t M S M S w e e n e y e t a l ( 2 0 0 3 ) E n d o r e p e l l i n a n o v e l i n h i b i t o r o f a n g i o g e n e s i s d e r i v e d f r o m t h e C t e r m i n u s o f p e r l e c a n J B i o l C h e m 2 7 8 ( 6 ) : 4 2 3 8 4 9 M o n t e r o A Y O k a d a e t a l ( 2 0 0 0 ) D i s r u p t i o n o f t h e f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 g e n e r e s u l t s i n d e c r e a s e d b o n e m a s s a n d b o n e f o r m a t i o n J C l i n I n v e s t 1 0 5 ( 8 ) : 1 0 8 5 9 3 M o o r e E E A M B e n d e l e e t a l ( 2 0 0 5 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 1 8 s t i m u l a t e s c h o n d r o g e n e s i s a n d c a r t i l a g e r e p a i r i n a r a t m o d e l o f i n j u r y i n d u c e d o s t e o a r t h r i t i s O s t e o a r t h r i t i s C a r t i l a g e 1 3 ( 7 ) : 6 2 3 3 1 M u e n k e M a n d U S c h e l l ( 1 9 9 5 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r m u t a t i o n s i n h u m a n s k e l e t a l d i s o r d e r s T r e n d s G e n e t 1 1 ( 8 ) : 3 0 8 1 3 M u r a g a k i Y E C M a r i m a n e t a l ( 1 9 9 6 ) A m u t a t i o n i n C O L 9 A 2 c a u s e s m u l t i p l e e p i p h y s e a l d y s p l a s i a ( E D M 2 ) A n n N Y A c a d S c i 7 8 5 : 3 0 3 6 M u r d o c h A D G R D o d g e e t a l ( 1 9 9 2 ) P r i m a r y s t r u c t u r e o f t h e h u m a n h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n f r o m b a s e m e n t m e m b r a n e ( H S P G 2 / p e r l e c a n ) A c h i m e r i c m o l e c u l e w i t h m u l t i p l e d o m a i n s h o m o l o g o u s t o t h e l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n r e c e p t o r l a m i n i n n e u r a l c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e s a n d e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r J B i o l C h e m 2 6 7 ( 1 2 ) : 8 5 4 4 5 7 N a s k i M C J S C o l v i n e t a l ( 1 9 9 8 ) R e p r e s s i o n o f h e d g e h o g s i g n a l i n g a n d B M P 4 e x p r e s s i o n i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e b y f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 D e v e l o p m e n t 1 2 5 ( 2 4 ) : 4 9 7 7 8 8 N i c o l e S C S D a v o i n e e t a l ( 2 0 0 0 ) P e r l e c a n t h e m a j o r p r o t e o g l y c a n o f b a s e m e n t m e m b r a n e s i s a l t e r e d i n p a t i e n t s w i t h S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e ( c h o n d r o d y s t r o p h i c m y o t o n i a ) N a t G e n e t 2 6 ( 4 ) : 4 8 0 3 N i l s s o n O R M a r i n o e t a l ( 2 0 0 5 ) E n d o c r i n e r e g u l a t i o n o f t h e g r o w t h p l a t e H o r m R e s 6 4 ( 4 ) : 1 5 7 6 5

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43 N o o n a n D M A F u l l e e t a l ( 1 9 9 1 ) T h e c o m p l e t e s e q u e n c e o f p e r l e c a n a b a s e m e n t m e m b r a n e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n r e v e a l s e x t e n s i v e s i m i l a r i t y w i t h l a m i n i n A c h a i n l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n r e c e p t o r a n d t h e n e u r a l c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e J B i o l C h e m 2 6 6 ( 3 4 ) : 2 2 9 3 9 4 7 N o o n a n D M a n d J R H a s s e l l ( 1 9 9 3 ) P e r l e c a n t h e l a r g e l o w d e n s i t y p r o t e o g l y c a n o f b a s e m e n t m e m b r a n e s : s t r u c t u r e a n d v a r i a n t f o r m s K i d n e y I n t 4 3 ( 1 ) : 5 3 6 0 N o o n a n K J E B H u n z i k e r e t a l ( 1 9 9 8 ) C h a n g e s i n c e l l m a t r i x c o m p a r t m e n t a n d f i b r i l l a r c o l l a g e n v o l u m e s b e t w e e n g r o w t h p l a t e z o n e s J O r t h o p R e s 1 6 ( 4 ) : 5 0 0 8 O K e e f e R J I D C r a b b e t a l ( 1 9 9 4 ) E f f e c t s o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a 1 a n d f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r o n D N A s y n t h e s i s i n g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s a r e e n h a n c e d b y i n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o r I J O r t h o p R e s 1 2 ( 3 ) : 2 9 9 3 1 0 O h b a y a s h i N M S h i b a y a m a e t a l ( 2 0 0 2 ) F G F 1 8 i s r e q u i r e d f o r n o r m a l c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n d u r i n g o s t e o g e n e s i s a n d c h o n d r o g e n e s i s G e n e s D e v 1 6 ( 7 ) : 8 7 0 9 O h l s s o n C J I s g a a r d e t a l ( 1 9 9 3 ) E n d o c r i n e r e g u l a t i o n o f l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h A c t a P a e d i a t r S u p p l 8 2 S u p p l 3 9 1 : 3 3 4 0 ; d i s c u s s i o n 4 1 O l s e n B R A M R e g i n a t o e t a l ( 2 0 0 0 ) B o n e d e v e l o p m e n t A n n u R e v C e l l D e v B i o l 1 6 : 1 9 1 2 2 0 O r n i t z D M ( 2 0 0 5 ) F G F s i g n a l i n g i n t h e d e v e l o p i n g e n d o c h o n d r a l s k e l e t o n C y t o k i n e G r o w t h F a c t o r R e v 1 6 ( 2 ) : 2 0 5 1 3 O r n i t z D M a n d N I t o h ( 2 0 0 1 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r s G e n o m e B i o l 2 ( 3 ) : R E V I E W S 3 0 0 5 O r n i t z D M a n d P L e d e r ( 1 9 9 2 ) L i g a n d s p e c i f i c i t y a n d h e p a r i n d e p e n d e n c e o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r s 1 a n d 3 J B i o l C h e m 2 6 7 ( 2 3 ) : 1 6 3 0 5 1 1 O r n i t z D M a n d P J M a r i e ( 2 0 0 2 ) F G F s i g n a l i n g p a t h w a y s i n e n d o c h o n d r a l a n d i n t r a m e m b r a n o u s b o n e d e v e l o p m e n t a n d h u m a n g e n e t i c d i s e a s e G e n e s D e v 1 6 ( 1 2 ) : 1 4 4 6 6 5

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44 O r n i t z D M J X u e t a l ( 1 9 9 6 ) R e c e p t o r s p e c i f i c i t y o f t h e f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r f a m i l y J B i o l C h e m 2 7 1 ( 2 5 ) : 1 5 2 9 2 7 O r t e g a S M I t t m a n n e t a l ( 1 9 9 8 ) N e u r o n a l d e f e c t s a n d d e l a y e d w o u n d h e a l i n g i n m i c e l a c k i n g f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 5 ( 1 0 ) : 5 6 7 2 7 P e n g H B A A A l i e t a l ( 1 9 9 8 ) T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p e r l e c a n a n d d y s t r o g l y c a n a n d i t s i m p l i c a t i o n i n t h e f o r m a t i o n o f t h e n e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n C e l l A d h e s C o m m u n 5 ( 6 ) : 4 7 5 8 9 R a t h N C W E H u f f e t a l ( 1 9 9 7 ) M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e a c t i v i t i e s i n a v i a n t i b i a l d y s c h o n d r o p l a s i a P o u l t S c i 7 6 ( 3 ) : 5 0 1 5 R i t t e n h o u s e E L C D u n n e t a l ( 1 9 7 8 ) C a r t i l a g e m a t r i x d e f i c i e n c y ( c m d ) : a n e w a u t o s o m a l r e c e s s i v e l e t h a l m u t a t i o n i n t h e m o u s e J E m b r y o l E x p M o r p h o l 4 3 : 7 1 8 4 R o g a l s k i T M B D W i l l i a m s e t a l ( 1 9 9 3 ) P r o d u c t s o f t h e u n c 5 2 g e n e i n C a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s a r e h o m o l o g o u s t o t h e c o r e p r o t e i n o f t h e m a m m a l i a n b a s e m e n t m e m b r a n e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n G e n e s D e v 7 ( 8 ) : 1 4 7 1 8 4 R o s s i A a n d A S u p e r t i F u r g a ( 2 0 0 1 ) M u t a t i o n s i n t h e d i a s t r o p h i c d y s p l a s i a s u l f a t e t r a n s p o r t e r ( D T D S T ) g e n e ( S L C 2 6 A 2 ) : 2 2 n o v e l m u t a t i o n s m u t a t i o n r e v i e w a s s o c i a t e d s k e l e t a l p h e n o t y p e s a n d d i a g n o s t i c r e l e v a n c e H u m M u t a t 1 7 ( 3 ) : 1 5 9 7 1 R o s s i M H M o r i t a e t a l ( 2 0 0 3 ) H e p a r a n s u l f a t e c h a i n s o f p e r l e c a n a r e i n d i s p e n s a b l e i n t h e l e n s c a p s u l e b u t n o t i n t h e k i d n e y E m b o J 2 2 ( 2 ) : 2 3 6 4 5 R u o s l a h t i E ( 1 9 9 1 ) I n t e g r i n s J C l i n I n v e s t 8 7 ( 1 ) : 1 5 S a h n i M R R a z e t a l ( 2 0 0 1 ) S T A T 1 m e d i a t e s t h e i n c r e a s e d a p o p t o s i s a n d r e d u c e d c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n i n m i c e o v e r e x p r e s s i n g F G F 2 D e v e l o p m e n t 1 2 8 ( 1 1 ) : 2 1 1 9 2 9 S c h m i e d e k e T M F W S t o c k l e t a l ( 1 9 8 9 ) H i s t o n e s h a v e h i g h a f f i n i t y f o r t h e g l o m e r u l a r b a s e m e n t m e m b r a n e R e l e v a n c e f o r i m m u n e c o m p l e x f o r m a t i o n i n l u p u s n e p h r i t i s J E x p M e d 1 6 9 ( 6 ) : 1 8 7 9 9 4

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45 S h a p i r o I M C S A d a m s e t a l ( 2 0 0 5 ) F a t e o f t h e h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e : m i c r o e n v i r o n m e n t a l p e r s p e c t i v e s o n a p o p t o s i s a n d s u r v i v a l i n t h e e p i p h y s e a l g r o w t h p l a t e B i r t h D e f e c t s R e s C E m b r y o T o d a y 7 5 ( 4 ) : 3 3 0 9 S h i a n g R L M T h o m p s o n e t a l ( 1 9 9 4 ) M u t a t i o n s i n t h e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f F G F R 3 c a u s e t h e m o s t c o m m o n g e n e t i c f o r m o f d w a r f i s m a c h o n d r o p l a s i a C e l l 7 8 ( 2 ) : 3 3 5 4 2 S i m m o n s A D M M M u s y e t a l ( 1 9 9 9 ) A d i r e c t i n t e r a c t i o n b e t w e e n E X T p r o t e i n s a n d g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s i s d e f e c t i v e i n h e r e d i t a r y m u l t i p l e e x o s t o s e s H u m M o l G e n e t 8 ( 1 2 ) : 2 1 5 5 6 4 S m i t h S M L A W e s t e t a l ( 2 0 0 6 ) H e p a r a n a n d c h o n d r o i t i n s u l f a t e o n g r o w t h p l a t e p e r l e c a n m e d i a t e b i n d i n g a n d d e l i v e r y o f F G F 2 t o F G F r e c e p t o r s M a t r i x B i o l S p r a n g e r J A W i n t e r p a c h t e t a l ( 1 9 9 4 ) T h e t y p e I I c o l l a g e n o p a t h i e s : a s p e c t r u m o f c h o n d r o d y s p l a s i a s E u r J P e d i a t r 1 5 3 ( 2 ) : 5 6 6 5 S t J a c q u e s B M H a m m e r s c h m i d t e t a l ( 1 9 9 9 ) I n d i a n h e d g e h o g s i g n a l i n g r e g u l a t e s p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f c h o n d r o c y t e s a n d i s e s s e n t i a l f o r b o n e f o r m a t i o n G e n e s D e v 1 3 ( 1 6 ) : 2 0 7 2 8 6 S t a c e y A J B a t e m a n e t a l ( 1 9 8 8 ) P e r i n a t a l l e t h a l o s t e o g e n e s i s i m p e r f e c t a i n t r a n s g e n i c m i c e b e a r i n g a n e n g i n e e r e d m u t a n t p r o a l p h a 1 ( I ) c o l l a g e n g e n e N a t u r e 3 3 2 ( 6 1 6 0 ) : 1 3 1 6 S u l l i v a n R a n d M K l a g s b r u n ( 1 9 8 5 ) P u r i f i c a t i o n o f c a r t i l a g e d e r i v e d g r o w t h f a c t o r b y h e p a r i n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y J B i o l C h e m 2 6 0 ( 4 ) : 2 3 9 9 4 0 3 S u n d a r r a j N D F i t e e t a l ( 1 9 9 8 ) P r o t e o g l y c a n d i s t r i b u t i o n d u r i n g h e a l i n g o f c o r n e a l s t r o m a l w o u n d s i n c h i c k E x p E y e R e s 6 7 ( 4 ) : 4 3 3 4 2 T a p a n a d e c h o p o n e P J R H a s s e l l e t a l ( 1 9 9 9 ) L o c a l i z a t i o n o f g l y c o s a m i n o g l y c a n s u b s t i t u t i o n s i t e s o n d o m a i n V o f m o u s e p e r l e c a n B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n 2 6 5 ( 3 ) : 6 8 0 9 0

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46 T a v o r m i n a P L D L R i m o i n e t a l ( 1 9 9 5 ) A n o t h e r m u t a t i o n t h a t r e s u l t s i n t h e s u b s t i t u t i o n o f a n u n p a i r e d c y s t e i n e r e s i d u e i n t h e e x t r a c e l l u l a r d o m a i n o f F G F R 3 i n t h a n a t o p h o r i c d y s p l a s i a t y p e I H u m M o l G e n e t 4 ( 1 1 ) : 2 1 7 5 7 v a n d e r E e r d e n B C M K a r p e r i e n e t a l ( 2 0 0 3 ) S y s t e m i c a n d l o c a l r e g u l a t i o n o f t h e g r o w t h p l a t e E n d o c r R e v 2 4 ( 6 ) : 7 8 2 8 0 1 V e g a R B K M a t s u d a e t a l ( 2 0 0 4 ) H i s t o n e d e a c e t y l a s e 4 c o n t r o l s c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y d u r i n g s k e l e t o g e n e s i s C e l l 1 1 9 ( 4 ) : 5 5 5 6 6 V o i g t A R P f l a n z e t a l ( 2 0 0 2 ) P e r l e c a n p a r t i c i p a t e s i n p r o l i f e r a t i o n a c t i v a t i o n o f q u i e s c e n t D r o s o p h i l a n e u r o b l a s t s D e v D y n 2 2 4 ( 4 ) : 4 0 3 1 2 V o l k S W a n d P S L e b o y ( 1 9 9 9 ) R e g u l a t i n g t h e r e g u l a t o r s o f c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y J B o n e M i n e r R e s 1 4 ( 4 ) : 4 8 3 6 V o r t k a m p A K L e e e t a l ( 1 9 9 6 ) R e g u l a t i o n o f r a t e o f c a r t i l a g e d i f f e r e n t i a t i o n b y I n d i a n h e d g e h o g a n d P T H r e l a t e d p r o t e i n S c i e n c e 2 7 3 ( 5 2 7 5 ) : 6 1 3 2 2 V u T H J M S h i p l e y e t a l ( 1 9 9 8 ) M M P 9 / g e l a t i n a s e B i s a k e y r e g u l a t o r o f g r o w t h p l a t e a n g i o g e n e s i s a n d a p o p t o s i s o f h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s C e l l 9 3 ( 3 ) : 4 1 1 2 2 W a g n e r T J W i r t h e t a l ( 1 9 9 4 ) A u t o s o m a l s e x r e v e r s a l a n d c a m p o m e l i c d y s p l a s i a a r e c a u s e d b y m u t a t i o n s i n a n d a r o u n d t h e S R Y r e l a t e d g e n e S O X 9 C e l l 7 9 ( 6 ) : 1 1 1 1 2 0 W a l l i s G A B R a s h e t a l ( 1 9 9 6 ) M u t a t i o n s w i t h i n t h e g e n e e n c o d i n g t h e a l p h a 1 ( X ) c h a i n o f t y p e X c o l l a g e n ( C O L 1 0 A 1 ) c a u s e m e t a p h y s e a l c h o n d r o d y s p l a s i a t y p e S c h m i d b u t n o t s e v e r a l o t h e r f o r m s o f m e t a p h y s e a l c h o n d r o d y s p l a s i a J M e d G e n e t 3 3 ( 6 ) : 4 5 0 7 W a t a n a b e H K K i m a t a e t a l ( 1 9 9 4 ) M o u s e c a r t i l a g e m a t r i x d e f i c i e n c y ( c m d ) c a u s e d b y a 7 b p d e l e t i o n i n t h e a g g r e c a n g e n e N a t G e n e t 7 ( 2 ) : 1 5 4 7 W a t a n a b e H Y Y a m a d a e t a l ( 1 9 9 8 ) R o l e s o f a g g r e c a n a l a r g e c h o n d r o i t i n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n i n c a r t i l a g e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n J B i o c h e m ( T o k y o ) 1 2 4 ( 4 ) : 6 8 7 9 3

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47 W a t s o n K R J E d w a r d s e t a l ( 1 9 9 5 ) E x t r a n u c l e a r l o c a t i o n o f h i s t o n e s i n a c t i v a t e d h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s a n d c u l t u r e d T c e l l s B i o c h e m P h a r m a c o l 5 0 ( 3 ) : 2 9 9 3 0 9 W a t s o n K N J G o o d e r h a m e t a l ( 1 9 9 9 ) N u c l e o s o m e s b i n d t o c e l l s u r f a c e p r o t e o g l y c a n s J B i o l C h e m 2 7 4 ( 3 1 ) : 2 1 7 0 7 1 3 W e s t L P G o v i n d r a j e t a l ( 2 0 0 6 ) C h a n g e s i n p e r l e c a n d u r i n g c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n i n t h e f e t a l b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e J O r t h o p R e s 2 4 ( 6 ) : 1 3 1 7 2 6 W h i t e K E J M C a b r a l e t a l ( 2 0 0 5 ) M u t a t i o n s t h a t c a u s e o s t e o g l o p h o n i c d y s p l a s i a d e f i n e n o v e l r o l e s f o r F G F R 1 i n b o n e e l o n g a t i o n A m J H u m G e n e t 7 6 ( 2 ) : 3 6 1 7 Y a n a g i s h i t a M a n d V C H a s c a l l ( 1 9 9 2 ) C e l l s u r f a c e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s J B i o l C h e m 2 6 7 ( 1 4 ) : 9 4 5 1 4 Y i S E A D a l u i s k i e t a l ( 2 0 0 0 ) T h e t y p e I B M P r e c e p t o r B M P R I B i s r e q u i r e d f o r c h o n d r o g e n e s i s i n t h e m o u s e l i m b D e v e l o p m e n t 1 2 7 ( 3 ) : 6 2 1 3 0 Z o u H R W i e s e r e t a l ( 1 9 9 7 ) D i s t i n c t r o l e s o f t y p e I b o n e m o r p h o g e n e t i c p r o t e i n r e c e p t o r s i n t h e f o r m a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f c a r t i l a g e G e n e s D e v 1 1 ( 1 7 ) : 2 1 9 1 2 0 3

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48 C H A P T E R T W O P A P E R S P a p e r I H e p a r a n a n d C h o n d r o i t i n S u l f a t e o n G r o w t h P l a t e P e r l e c a n M e d i a t e B i n d i n g a n d D e l i v e r y o f F G F 2 t o F G F R e c e p t o r s S i m o n e M L S m i t h L e i g h A W e s t P r a s a n t h i G o v i n d r a j X i u q i n Z h a n g D a v i d M O r n i t z a n d J o h n R H a s s e l l * D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r M e d i c i n e C o l l e g e o f M e d i c i n e U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a T a m p a F L C e n t e r f o r R e s e a r c h i n S k e l e t a l D e v e l o p m e n t a n d P e d i a t r i c O r t h o p a e d i c s S h r i n e r s H o s p i t a l s f o r C h i l d r e n T a m p a F L D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r B i o l o g y a n d P h a r m a c o l o g y W a s h i n g t o n U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e S t L o u i s M O A b b r e v i a t i o n s u s e d : C A F c a t i o n i c f i l t r a t i o n ; C S c h o n d r o i t i n s u l f a t e ; D D S H d y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e ; D M E M D u l b e c c o s m o d i f i e d E a g l e m e d i u m ; D M M B d i m e t h y l m e t h y l e n e b l u e ; F G F f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ; F G F R f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r ; G A G g l y c o s a m i n o g l y c a n ; H S h e p a r a n s u l f a t e ; H U A E C h u m a n u m b i l i c a l a r t e r i a l e n d o t h e l i a l c e l l ; 1 2 5 I I o d i n e 1 2 5 ; I P i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ; S J S S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e P u b l i s h e d i n M a t r i x B i o l o g y 2 0 0 7 A p r ; 2 6 ( 3 ) : 1 7 5 8 4 E p u b 2 0 0 6 N o v 6

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49 A b s t r a c t F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) 2 r e g u l a t e s c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n i n t h e g r o w t h p l a t e H e p a r a n s u l f a t e ( H S ) p r o t e o g l y c a n s b i n d F G F 2 P e r l e c a n a h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n ( H S P G ) i n t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e h o w e v e r c o n t a i n s b o t h H S a n d c h o n d r o i t i n s u l f a t e ( C S ) c h a i n s T h e b i n d i n g o f F G F 2 t o p e r l e c a n i s o l a t e d f r o m t h e g r o w t h p l a t e w a s e v a l u a t e d u s i n g c a t i o n i c f i l t r a t i o n ( C A F ) a n d i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a s s a y s F G F 2 b o u n d t o p e r l e c a n i n b o t h t h e C A F a n d I P a s s a y s p r i m a r i l y v i a t h e H S c h a i n s o n p e r l e c a n A m a x i m u m o f 1 2 3 m o l e c u l e s o f F G F 2 w a s c a l c u l a t e d t o b i n d p e r m o l e c u l e o f p e r l e c a n W h e n d i g e s t e d w i t h c h o n d r o i t i n a s e A B C t o r e m o v e i t s C S c h a i n s p e r l e c a n a u g m e n t e d b i n d i n g o f F G F 2 t o t h e F G F R 1 a n d F G F R 3 r e c e p t o r s a n d a l s o i n c r e a s e d F G F 2 s t i m u l a t i o n o f [ 3 H ] t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n i n B a F 3 c e l l s e x p r e s s i n g t h e s e F G F r e c e p t o r s T h e s e d a t a s h o w t h a t g r o w t h p l a t e p e r l e c a n b i n d s t o F G F 2 b y i t s H S c h a i n s b u t c a n o n l y d e l i v e r F G F 2 t o F G F r e c e p t o r s w h e n i t s C S c h a i n s a r e r e m o v e d K e y w o r d s : g r o w t h p l a t e p e r l e c a n F G F F G F R c h o n d r o c y t e c h o n d r o i t i n s u l f a t e h e p a r a n s u l f a t e

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50 I n t r o d u c t i o n P e r l e c a n w a s o r i g i n a l l y i d e n t i f i e d a s a h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n ( H S P G ) i n t u m o r l i n e s a n d w a s s h o w n t o b e p r e s e n t i n a l l b a s e m e n t m e m b r a n e s ( H a s s e l l R o b e y e t a l 1 9 8 0 ; I o z z o a n d W i g h t 1 9 8 2 ) I t i s n o w k n o w n n o t o n l y t o b e p r e s e n t i n t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x o f c a r t i l a g e a n d i n t h e g r o w t h p l a t e b u t a l s o t o b e o n e o f t h e p r i n c i p a l m e d i a t o r s o f l o n g b o n e g r o w t h ( S u n d a r R a j F i t e e t a l 1 9 9 5 ; H a n d l e r Y u r c h e n c o e t a l 1 9 9 7 ; F r e n c h S m i t h e t a l 1 9 9 9 ) P e r l e c a n n u l l m i c e h a v e r e d u c e d c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d m a t r i x d e p o s i t i o n i n t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e w h i c h r e s u l t s i n f e t a l d w a r f i s m ( A r i k a w a H i r a s a w a W a t a n a b e e t a l 1 9 9 9 ; C o s t e l l G u s t a f s s o n e t a l 1 9 9 9 ) M u t a t i o n s i n t h e h u m a n p e r l e c a n g e n e c a u s e t w o c h o n d r o d y s t r o p h i e s : d y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e ( D D S H ) a n d S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e ( S J S ) ( N i c o l e D a v o i n e e t a l 2 0 0 0 ; A r i k a w a H i r a s a w a W i l c o x e t a l 2 0 0 1 ; A r i k a w a H i r a s a w a L e e t a l 2 0 0 2 ) D D S H r e s e m b l e s m a n y f e a t u r e s o f t h e p e r l e c a n n u l l m o u s e a n d r e s u l t s f r o m a n a b s e n c e o f f u n c t i o n a l p e r l e c a n S J S i s l e s s s e v e r e t h a n D D S H b e c a u s e e i t h e r a t r u n c a t e d f o r m o f p e r l e c a n i s m a d e o r r e d u c e d l e v e l s o f f u l l l e n g t h p e r l e c a n a r e m a d e T h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t p e r l e c a n p l a y s a n e s s e n t i a l r o l e i n e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n T h e r o l e o f p e r l e c a n i n b a s e m e n t m e m b r a n e s i s s u m m a r i z e d i n a r e c e n t r e v i e w ( I o z z o 2 0 0 5 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r s ( F G F s ) a r e a f a m i l y o f p r o t e i n s t h a t r e g u l a t e c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n d u r i n g e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t b y b i n d i n g t o F G F r e c e p t o r s ( F G F R s ) ( O r n i t z a n d I t o h 2 0 0 1 ) F G F 2 ( N u g e n t N u g e n t e t a l 2 0 0 0 ) i s p r e s e n t i n t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e ( H i l l a n d L o g a n 1 9 9 2 ; L u a n P r a u l e t a l 1 9 9 6 ) w h e r e i t c a n r e g u l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d t h e r e b y

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51 a f f e c t l o n g b o n e g r o w t h ( T r i p p e l W r o b l e w s k i e t a l 1 9 9 3 ; N a g a i T s u k u d a e t a l 1 9 9 5 ) W h i l e t h e F G F 2 k n o c k o u t m o u s e h a s n o s e v e r e d e f e c t i n l o n g b o n e g r o w t h ( D o n o T e x i d o e t a l 1 9 9 8 ; O r t e g a I t t m a n n e t a l 1 9 9 8 ; Z h o u S u t l i f f e t a l 1 9 9 8 ) s h o w i n g o n l y a m i l d a d u l t o n s e t o s t e o p e n i a ( d e c r e a s e d b o n e m i n e r a l d e n s i t y a n d b o n e f o r m a t i o n ) ( M o n t e r o O k a d a e t a l 2 0 0 0 ) t h e F G F 2 t r a n s g e n i c m o u s e w h e r e F G F 2 i s o v e r e x p r e s s e d h a s s e v e r e l y s h o r t e n e d l i m b s r e s u l t i n g f r o m c h o n d r o c y t e h y p e r p l a s i a i n c r e a s e d e x t r a c e l l u l a r m a t r i x d e p o s i t i o n a n d d e c r e a s e d d i f f e r e n t i a t i o n o f h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s ( C o f f i n F l o r k i e w i c z e t a l 1 9 9 5 ) T h e a b s e n c e o f l o n g b o n e d e f e c t s i n t h e F G F 2 k n o c k o u t c o u l d b e d u e t o c o m p e n s a t i o n f o r F G F 2 b y o t h e r F G F s i n t h e g r o w t h p l a t e P e r l e c a n m a y p l a y a r o l e i n r e g u l a t i n g t h e d i s t r i b u t i o n o r a v a i l a b i l i t y o f F G F s i n t h e g r o w t h p l a t e ( A r i k a w a H i r a s a w a W a t a n a b e e t a l 1 9 9 9 ; O l s e n 1 9 9 9 ) F G F 2 b i n d s t o h e p a r i n a n d h e p a r a n s u l f a t e i n a m a n n e r o f t e n d e p e n d e n t u p o n t h e n u m b e r a n d s e q u e n c e o f t h e s u l f a t e e s t e r s i n t h e g l y c o s a m i n o g l y c a n c h a i n ( O r n i t z a n d L e d e r 1 9 9 2 ; P o w e l l Y a t e s e t a l 2 0 0 4 ) F G F 2 b i n d s t o p e r l e c a n m a d e b y a n e n d o t h e l i a l c e l l l i n e ( K n o x M e r r y e t a l 2 0 0 2 ) a n d t o p e r l e c a n m a d e b y g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s i n c u l t u r e ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 6 ) a n d t h e b i n d i n g i s t o t h e h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s E n d o t h e l i a l c e l l p e r l e c a n c o n t a i n s o n l y h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s ( K n o x M e r r y e t a l 2 0 0 2 ) b u t p e r l e c a n i s o l a t e d f r o m t h e g r o w t h p l a t e a l s o c o n t a i n s c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s i n a d d i t i o n t o t h e h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) T h e c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s o n g r o w t h p l a t e p e r l e c a n h a v e r e c e n t l y b e e n s h o w n t o b i n d t o c o l l a g e n a n d a c c e l e r a t e c o l l a g e n f i b r i l f o r m a t i o n ( K v i s t J o h n s o n e t a l 2 0 0 6 ) F G F s b i n d t o b o t h l o w a n d h i g h a f f i n i t y r e c e p t o r s ( M a s c a r e l l i a n d C o u r t o i s 1 9 9 3 ) W e s h o w e d t h a t p e r l e c a n i s t h e l o w a f f i n i t y

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52 r e c e p t o r f o r F G F 2 i n t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e a n d t h a t F G F 2 b o u n d t o p e r l e c a n w a s n o t d e l i v e r e d t o t h e h i g h a f f i n i t y r e c e p t o r s o n g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 6 ) T h e r e a r e f o u r h i g h a f f i n i t y r e c e p t o r s f o r F G F 2 ( F G F R 1 2 3 a n d 4 ) a n d v a r i o u s s p l i c e v a r i a n t s o f e a c h ( F G F R 1 b F G F R 2 c f o r e x a m p l e ) F G F R 1 a n d F G F R 3 a r e t h e F G F R s e x p r e s s e d i n t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e ( W a n g G r e e n e t a l 2 0 0 1 ) F G F R 1 i s u p r e g u l a t e d i n t h e g r o w t h p l a t e a s c h o n d r o c y t e s h y p e r t r o p h y a n d F G F R 3 i s e x p r e s s e d i n p r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e s A m i s s e n s e m u t a t i o n i n F G F R 3 i s k n o w n t o c a u s e a c h o n d r o p l a s i a t h e m o s t c o m m o n f o r m o f h u m a n s k e l e t a l d w a r f i s m ( S h i a n g T h o m p s o n e t a l 1 9 9 4 ) A r a r e m u t a t i o n i n F G F R 1 a l s o c a u s e s o s t e o g l o p h o n i c d y s p l a s i a a s e v e r e d i s e a s e c h a r a c t e r i z e d b y d w a r f i s m p r e m a t u r e f u s i o n o f c r a n i a l b o n e s a n d b o n e l e s i o n s ( W h i t e C a b r a l e t a l 2 0 0 5 ) O t h e r h u m a n s k e l e t a l d y s p l a s i a s h a v e b e e n l i n k e d t o F G F R 1 ( M u e n k e a n d S c h e l l 1 9 9 5 ) F G F R 1 a n d F G F R 3 t h u s h a v e d i s t i n c t e x p r e s s i o n d o m a i n s i n t h e g r o w t h p l a t e a n d p e r f o r m u n i q u e f u n c t i o n s I n t h i s s t u d y w e u s e d a c a t i o n i c f i l t r a t i o n a s s a y ( F o r s t e n W a n g e t a l 2 0 0 0 ) a n d a n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y ( W h i t e l o c k M u r d o c h e t a l 1 9 9 6 ) t o t e s t t h e b i n d i n g o f F G F 2 t o p u r i f i e d p e r l e c a n f r o m t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e W e a l s o u s e d a n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y w i t h r e c o m b i n a n t r e c e p t o r s F G F R 1 c a n d F G F R 3 c a n d a p r o l i f e r a t i o n a s s a y w i t h B a F 3 c e l l s e x p r e s s i n g t h e s e r e c e p t o r s t o m e a s u r e t h e a b i l i t y o f g r o w t h p l a t e p e r l e c a n t o d e l i v e r F G F 2 t o F G F R

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53 E x p e r i m e n t a l P r o c e d u r e s C h e m i c a l s R e c o m b i n a n t h u m a n F G F 2 w a s f r o m P e p r o T e c h ( R o c k y H i l l N J U S A ) P r o t e i n G S e p h a r o s e 4 F a s t F l o w a n d H e p a r i n S e p h a r o s e 6 F a s t F l o w w e r e f r o m A m e r s h a m B i o s c i e n c e s ( P i s c a t a w a y N J U S A ) C h o n d r o i t i n a s e A B C a n d p r o t e a s e f r e e c h o n d r o i t i n a s e A B C ( b o t h E C 4 2 2 4 ) c h o n d r o i t i n a s e A C I I ( E C 4 2 2 5 ) h e p a r i t i n a s e I ( E C 4 2 2 8 ) a n d h e p a r i t i n a s e I I ( n o E C n u m b e r ) w e r e f r o m A s s o c i a t e s o f C a p e C o d ( E a s t F a l m o u t h M A U S A ) L i p o f e c t a m i n e p l u s w a s f r o m I n v i t r o g e n D M E M w a s f r o m G i b c o S o d i u m [ 1 2 5 I ] i o d i d e ( c a r r i e r f r e e 1 7 4 C i / m g ) a n d [ m e t h y l 3 H ] t h y m i d i n e ( 6 7 C i / m m o l ) w e r e f r o m P e r k i n E l m e r ( B o s t o n M A U S A ) C h e m i c a l s w e r e f r o m S i g m a ( S t L o u i s M O U S A ) u n l e s s o t h e r w i s e i n d i c a t e d P e r l e c a n G r o w t h p l a t e s f r o m t h i r d t r i m e s t e r f e t a l b o v i n e r i b s w e r e d i s s e c t e d a n d t h e p r o t e i n s e x t r a c t e d w i t h 4 M g u a n i d i n e h y d r o c h l o r i d e T h e p e r l e c a n i n t h e e x t r a c t w a s p u r i f i e d u s i n g C s C l d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n f o l l o w e d b y i o n e x c h a n g e a n d s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) T h e p u r i f i e d p e r l e c a n w a s d i a l y z e d o v e r n i g h t a t 4 C a g a i n s t d i s t i l l e d w a t e r t o r e m o v e t h e g u a n i d i n e a n d a l l o w t h e n a t i v e s t r u c t u r e o f t h e c o r e p r o t e i n t o r e f o r m ( L e d b e t t e r F i s h e r e t a l 1 9 8 7 ) a s s e e n i n W e s t e r n b l o t s o f t h e f i n a l p r o d u c t T h e g l y c o s a m i n o g l y c a n c o n t e n t o f t h e p u r i f i e d p e r l e c a n w a s d e t e r m i n e d b y t h e d i m e t h y l m e t h y l e n e b l u e ( D M M B ) d y e b i n d i n g a s s a y u s i n g c h o n d r o i t i n s u l f a t e C a s a s t a n d a r d ( F a r n d a l e B u t t l e e t a l 1 9 8 6 )

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54 S o l u b l e F G F R e c e p t o r C o n s t r u c t s e n c o d i n g t h e s o l u b l e F G F R 1 a n d F G F R 3 r e c e p t o r s w e r e o b t a i n e d f r o m D r D O r n i t z ( O r n i t z Y a y o n e t a l 1 9 9 2 ) E a c h c o n s t r u c t w a s c o m p r i s e d o f t h e e x t r a c e l l u l a r r e g i o n o f t h e r e s p e c t i v e m u r i n e r e c e p t o r f u s e d t o p l a c e n t a l a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( A P ) a n d c l o n e d i n t o a n e x p r e s s i o n v e c t o r C o s 7 c e l l s w e r e g r o w n i n D M E M s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % F B S T h e F G F R e c e p t o r A l k a l i n e P h o s p h a t a s e ( F R A P ) p l a s m i d w a s t r a n s f e c t e d i n t o c e l l s u s i n g l i p o f e c t a m i n e p l u s T h e a m o u n t s o f r e c o m b i n a n t r e c e p t o r p r o d u c t s e c r e t e d i n t o t h e m e d i a w e r e d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e a l k a l i n e p h o s p h a t a s e a c t i v i t y i n t h e m e d i a P r e p a r a t i o n o f R a d i o l a b e l l e d F G F s F G F s w e r e r a d i o l a b e l l e d u s i n g s o d i u m [ 1 2 5 I ] I o d i d e a c t i v a t e d i n I O D O G E N c o a t e d t u b e s ( P i e r c e B i o t e c h n o l o g y R o c k f o r d I L U S A ) u s i n g t h e m a n u f a c t u r e r s s u p p l i e d p r o t o c o l ( C h i z z o n i t e i n d i r e c t m e t h o d ) B r i e f l y 0 5 m C i o f s o d i u m [ 1 2 5 I ] I o d i d e w a s a d d e d t o t h e I O D O G E N t u b e c o n t a i n i n g 1 0 0 l o f i o d i n a t i o n b u f f e r ( 0 0 2 5 M T r i s H C l 0 4 M N a C l p H 7 4 ) A f t e r 6 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e t h e a c t i v a t e d i o d i n e s o l u t i o n w a s t r a n s f e r r e d t o a 1 5 m l p o l y p r o p y l e n e t u b e c o n t a i n i n g 5 g o f F G F 2 i n 1 0 0 l i o d i n a t i o n b u f f e r A f t e r r e a c t i n g f o r 9 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e t h e r e a c t i o n w a s t e r m i n a t e d b y t h e a d d i t i o n o f 5 0 l o f 1 0 m g / m l L t y r o s i n e T h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e r a d i o l a b e l l e d F G F 2 w a s d e t e r m i n e d b y a s s u m i n g a l l w a s i o d i n a t e d a n d s u b j e c t i n g 1 % o f t h e i o d i n a t e d p r o d u c t t o S D S P A G E d e t e r m i n i n g t h e l o c a t i o n o f t h e F G F 2 b y a u t o r a d i o g r a p h y e x c i s i n g t h e b a n d a n d c o u n t i n g t h e r a d i o a c t i v i t y i n a M o d e l 1 1 9 1 g a m m a c o u n t e r ( T M A n a l y t i c E l k G r o v e V i l l a g e I L U S A ) T h e r e m a i n i n g s a m p l e v o l u m e w a s a d j u s t e d t o 0 4 m l w i t h c o l u m n b u f f e r ( i o d i n a t i o n b u f f e r c o n t a i n i n g

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55 0 1 % [ w / v ] B S A ) a n d u n i n c o r p o r a t e d 1 2 5 I o d i n e r e m o v e d o n P D 1 0 c o l u m n s ( A m e r s h a m B i o s c i e n c e s ) e q u i l i b r a t e d i n c o l u m n b u f f e r A l i q u o t s o f f r a c t i o n s w e r e c o u n t e d t o d e t e r m i n e t h e e l u t i o n p o s i t i o n o f 1 2 5 I o d i n e i n c o r p o r a t e d i n t o F G F 2 F r a c t i o n s c o n t a i n i n g r a d i o l a b e l l e d F G F 2 w e r e p o o l e d a n d i n c u b a t e d w i t h H e p a r i n S e p h a r o s e 6 F a s t F l o w b e a d s ( A m e r s h a m B i o s c i e n c e s p r e w a s h e d w i t h 4 M G u a n i d i n e H C l t h e n P B S ) f o r 1 h o u r w i t h g e n t l e r o c k i n g T h e b e a d s w e r e t h e n w a s h e d w i t h P B S a n d t h e b o u n d F G F 2 r e l e a s e d w i t h e l u t i o n b u f f e r ( 2 M N a C l c o n t a i n i n g 0 0 2 5 M T r i s H C l p H 7 4 ) T h e e l u a t e w a s d i a l y z e d a g a i n s t P B S a n d t h e i n c o r p o r a t i o n o f 1 2 5 I o d i n e i n t o F G F 2 w a s v e r i f i e d b y c o u n t i n g i n a g a m m a c o u n t e r a n d b y S D S P A G E a n d a u t o r a d i o g r a p h y t o c o n f i r m t h e m o l e c u l a r m a s s o f t h e i o d i n a t e d g r o w t h f a c t o r T h e d i a l y s e d e l u a t e w a s t h e n s t o r e d i n a l i q u o t s a t 8 0 o C u n t i l u s e [ 1 2 5 I ] F G F 2 p r e p a r e d u s i n g t h i s p r o c e d u r e h a d c o m p a r a b l e b i n d i n g c h a r a c t e r i s t i c s t o c o m m e r c i a l l y p r e p a r e d [ 1 2 5 I ] F G F 2 ( r e c o m b i n a n t h u m a n B o l t o n H u n t e r l a b e l l e d ; P e r k i n E l m e r ) w h e n t e s t e d f o r p e r l e c a n b i n d i n g i n t h e c a t i o n i c f i l t r a t i o n a s s a y d e s c r i b e d b e l o w ( d a t a n o t s h o w n ) C a t i o n i c f i l t r a t i o n a s s a y P e r l e c a n F G F 2 b i n d i n g w a s d e t e r m i n e d u s i n g a c a t i o n i c f i l t r a t i o n ( C A F ) a s s a y ( F o r s t e n W a n g e t a l 2 0 0 0 ) B i n d i n g a s s a y s w e r e p e r f o r m e d i n a b u f f e r c o n s i s t i n g o f 0 0 5 M T r i s H C l 0 1 5 M N a C l 2 m g / m l p r o t e a s e f r e e B S A p H 8 0 [ 1 2 5 I ] F G F 2 w a s i n c u b a t e d i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f p e r l e c a n a n d c o m p e t i t o r l i g a n d s i n s o l u t i o n a t 2 5 o C f o r 1 h i n a f i n a l i n c u b a t i o n v o l u m e o f 0 2 m l C o n t r o l p e r l e c a n a n d p e r l e c a n b o u n d t o [ 1 2 5 I ] F G F 2 w e r e c a p t u r e d b y v a c u u m f i l t r a t i o n a c r o s s a c a t i o n i c m e m b r a n e ( Z e t a P r o b e ; B i o R a d L a b o r a t o r i e s H e r c u l e s C A U S A ) p l a c e d i n t o a 9 6 w e l l d o t

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56 b l o t a p p a r a t u s ( M i n i f o l d I ; S c h l e i c h e r a n d S c h u e l l K e e n e N H U S A ) U n b o u n d [ 1 2 5 I ] F G F 2 w a s r e m o v e d b y r i n s i n g t h e w e l l s t h r e e t i m e s w i t h 0 2 m l i n c u b a t i o n b u f f e r T h e f i l t e r s w e r e d r i e d a n d d o t s c o r r e s p o n d i n g t o e a c h w e l l w e r e c u t o u t p l a c e d i n t o t u b e s a n d t h e r a d i o a c t i v i t y m e a s u r e d i n a g a m m a c o u n t e r A s s a y s w e r e p e r f o r m e d i n a m i n i m u m o f d u p l i c a t e s B i n d i n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 t o t h e m e m b r a n e i n t h e a b s e n c e o f p e r l e c a n w a s s u b t r a c t e d t o d e t e r m i n e s p e c i f i c a l l y b o u n d g r o w t h f a c t o r A n t i s e r a P o l y c l o n a l a n t i s e r u m t o p e r l e c a n ( G P P 7 6 ) a n d p o l y c l o n a l a n t i s e r u m t o a g g r e c a n ( R B 0 1 2 ) w e r e o b t a i n e d b y p u r i f y i n g p e r l e c a n a n d a g g r e c a n f r o m f e t a l b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e s ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) a n d e m p l o y i n g a c o m m e r c i a l s e r v i c e ( I n v i t r o g e n ; C a r l s b a d C A U S A ) t o r a i s e a n t i b o d i e s t o t h e s e p r o t e o g l y c a n s i n r a b b i t s A n t i c a l f i n t e s t i n a l a l k a l i n e p h o s p h a t a s e a n t i b o d y w a s f r o m S i g m a ( S t L o u i s M O U S A ) D o t B l o t T h e c a p a c i t y o f Z e t a P r o b e m e m b r a n e s t o b i n d p e r l e c a n i n t h e C A F a s s a y w a s d e t e r m i n e d b y f i l t e r i n g s a m p l e s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t a m o u n t s o f p e r l e c a n t h r o u g h t h e m e m b r a n e a n d w a s h i n g t h e f i l t e r s a s d e s c r i b e d a b o v e A f t e r d r y i n g t h e f i l t e r s w e r e b l o c k e d f o r 1 h i n D u l b e c c o s P B S ( M e d i a t e c h H e r n d o n V A U S A ) c o n t a i n i n g 0 2 % ( w / v ) I B l o c k ( A p p l i e d B i o s y s t e m s F o s t e r C i t y C A U S A ) T h e p r i m a r y a n t i s e r u m ( G P P 7 6 ) w a s a d d e d a t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 : 4 0 0 a n d t h e b l o t i n c u b a t e d f o r 1 8 h a t 4 C T h e p e r l e c a n s i g n a l w a s d e t e c t e d u s i n g a 1 : 5 0 0 0 d i l u t i o n o f a h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e c o u p l e d s e c o n d a r y a n t i b o d y a n d a n E C L k i t ( A m e r s h a m B i o s c i e n c e s ) I m a g e s w e r e r e c o r d e d o n x r a y f i l m ( B i o M a x X A R ;

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57 K o d a k R o c h e s t e r N Y U S A ) a n d p i x e l d e n s i t i e s o f d o t s i n t h e l i n e a r r a n g e o f f i l m e x p o s u r e w e r e m e a s u r e d u s i n g Q u a n t i t y O n e s o f t w a r e ( B i o R a d L a b o r a t o r i e s ) I m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y F G F b i n d i n g t o p e r l e c a n w a s a l s o e v a l u a t e d u s i n g a n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a s s a y f o r p e r l e c a n s i m i l a r t o t h a t p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( W h i t e l o c k M u r d o c h e t a l 1 9 9 6 ; K n o x M e r r y e t a l 2 0 0 2 ) e x c e p t t h a t a t t h e c o m p l e t i o n o f t h e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n t h e b o u n d [ 1 2 5 I ] F G F 2 w a s f r a c t i o n a t e d i n t o t h a t e l u t e d b y 2 M N a C l a n d t h a t r e m a i n i n g b o u n d t o t h e b e a d s T h i s c o n c e n t r a t i o n o f s o d i u m c h l o r i d e w a s s e l e c t e d b e c a u s e i t h a s b e e n s h o w n t o r e l e a s e F G F 2 b o u n d t o h e p a r i n a n d t o t h e l o w a f f i n i t y F G F r e c e p t o r p r e s e n t o n c e l l s a n d i n t i s s u e s ( C h i n t a l a M i l l e r e t a l 1 9 9 4 ; C h i n t a l a M i l l e r e t a l 1 9 9 5 ) U n l e s s o t h e r w i s e n o t e d 1 2 8 n g o f p e r l e c a n w a s i n c u b a t e d w i t h 1 0 5 c p m o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 i n a f i n a l v o l u m e o f 1 m l o f I P b u f f e r ( 0 0 2 M T r i s 0 1 5 M s o d i u m c h l o r i d e 1 % ( v / v ) T r i t o n X 1 0 0 p H 7 4 ) f o r 1 h a t 2 5 o C F i v e m i c r o l i t e r s o f e i t h e r n o r m a l r a b b i t ( n o n i m m u n e ) o r i m m u n e s e r u m w a s t h e n a d d e d a n d t h e s a m p l e s w e r e i n c u b a t e d f o r 3 h a t 4 o C T w e n t y f i v e m i c r o l i t e r s o f P r o t e i n G c o n j u g a t e d S e p h a r o s e 4 F a s t F l o w b e a d s w a s h e d t w i c e i n 1 m l I P b u f f e r b y c e n t r i f u g a t i o n f o r 5 m i n a t 2 5 0 0 g a t 4 o C w e r e a d d e d t o e a c h t u b e a n d t h e t u b e s t u m b l e d o v e r n i g h t a t 4 o C T h e b e a d s w e r e t h e n w a s h e d t h r e e t i m e s a s a b o v e w i t h 1 m l I P b u f f e r a n d t h e b o u n d m a t e r i a l e l u t e d b y i n c u b a t i o n w i t h 0 5 m l o f 2 M s o d i u m c h l o r i d e ( i n I P b u f f e r w i t h o u t T r i t o n X 1 0 0 ) f o r 3 0 m i n a t 2 5 o C f o l l o w e d b y c e n t r i f u g a t i o n a s a b o v e a t 2 5 o C T h e r a d i o a c t i v i t i e s i n t h e s u p e r n a t a n t s ( e l u t e d

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58 c o u n t s ) a n d p e l l e t s ( r e m a i n i n g c o u n t s ) w e r e m e a s u r e d i n a g a m m a c o u n t e r G l y c o s i d a s e t r e a t m e n t o f p e r l e c a n F o r C A F a n d I P a s s a y s p e r l e c a n ( 1 2 8 n g o f D M M B r e a c t i v i t y ) w a s e i t h e r s h a m d i g e s t e d o r d i g e s t e d s e p a r a t e l y w i t h e i t h e r p r o t e a s e f r e e c h o n d r o i t i n a s e A B C ( 1 0 m U ) t o r e m o v e c h o n d r o i t i n s u l f a t e g l y c o s a m i n o g l y c a n ( G A G ) a m i x t u r e o f h e p a r i t i n a s e s I a n d I I ( 5 m U e a c h ) t o r e m o v e H S G A G o r w i t h p r o t e a s e f r e e c h o n d r o i t i n a s e A B C a n d h e p a r i t i n a s e s t o r e m o v e b o t h C S a n d H S G A G s i n 0 1 m l d i g e s t i o n b u f f e r ( 2 0 m M T r i s H C 1 5 0 m M s o d i u m a c e t a t e 5 m M c a l c i u m c h l o r i d e a n d 0 2 m g / m 1 B S A p H 7 4 ) f o r 3 h a t 3 7 C C o m p l e t i o n o f g l y c o s i d a s e d i g e s t i o n s w a s c o n f i r m e d b y t h e l o s s o f D M M B r e a c t i v i t y o f s h a r k c a r t i l a g e c h o n d r o i t i n s u l f a t e C o r b o v i n e k i d n e y H S ( 5 g e a c h ) i n d i g e s t i o n s s e t u p i n p a r a l l e l w i t h a p p r o p r i a t e e n z y m e s B i n d i n g o f s h a m a n d g l y c o s i d a s e t r e a t e d p e r l e c a n t o t h e Z e t a P r o b e m e m b r a n e w a s c o n f i r m e d b y d o t b l o t a s d e s c r i b e d a b o v e F o r c e l l p r o l i f e r a t i o n a s s a y s p e r l e c a n ( 1 0 0 g b y D M M B r e a c t i v i t y ) o r 1 0 0 g o f c h o n d r o i t i n s u l f a t e C w e r e d i g e s t e d w i t h 5 0 m U o f p r o t e a s e f r e e c h o n d r o i t i n a s e A B C i n 1 5 m l o f 2 5 m M s o d i u m a c e t a t e p H 7 0 f o r 1 h a t 3 7 C F G F R e c e p t o r B i n d i n g A s s a y T h e b i n d i n g a s s a y m i x t u r e c o n s i s t e d o f c o n d i t i o n e d m e d i a f r o m C o s 7 c e l l s t h a t w e r e t r a n s f e c t e d w i t h c o n s t r u c t s e n c o d i n g F G F R e c e p t o r A l k a l i n e p h o s p h a t a s e o r F R A P ( 0 4 O D u n i t s o f p h o s p h a t a s e a c t i v i t y f o r F R A P 1 c a n d F R A P 3 c ) [ 1 2 5 I ] F G F 2 a n d p e r l e c a n A l l r e a c t i o n s w e r e i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e U n d i g e s t e d p e r l e c a n c h o n d r o i t i n a s e d i g e s t e d p e r l e c a n o r h e p a r i n w a s a d d e d i n c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 0 t o 2 5 g G A G s / t u b e

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59 ( 0 1 0 g G A G s / m l ) A n t i c a l f i n t e s t i n a l a l k a l i n e p h o s p h a t a s e a n t i b o d y w a s a d d e d t o i m m u n o p r e c i p i t a t e t h e F R A P a n d 2 0 l o f P r o t e i n G s e p h a r o s e w a s u s e d t o c a p t u r e t h e a n t i b o d y T h e b e a d s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h i c e c o l d P B S a n d t h e t u b e s w e r e c o u n t e d d i r e c t l y i n a g a m m a c o u n t e r t o m e a s u r e t h e a m o u n t o f i o d i n a t e d F G F 2 c a p t u r e d o n t h e b e a d s F o r e a c h r e a c t i o n c o n d i t i o n a c o n t r o l w a s d o n e w i t h i d e n t i c a l r e a g e n t s a n d p r e i m m u n e s e r u m i n s t e a d o f t h e a n t i b o d y T h e r e s u l t i n g v a l u e s f o r t h e p r e i m m u n e c o n t r o l s w e r e s u b t r a c t e d f r o m t h e e x p e r i m e n t a l v a l u e s t o g i v e t h e s p e c i f i c v a l u e s s h o w n i n o u r r e s u l t s C e l l p r o l i f e r a t i o n a s s a y T h e a b i l i t y o f p e r l e c a n t o m e d i a t e t h e d e l i v e r y o f F G F 2 t o F G F r e c e p t o r s w a s d e t e r m i n e d u s i n g B a F 3 c e l l s a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( O r n i t z Y a y o n e t a l 1 9 9 2 ) I n b r i e f B a F 3 c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h p l a s m i d s c o n t a i n i n g t h e F G F R 1 c a n d F G F R 3 c c o n s t r u c t s w e r e w a s h e d w i t h R P M I 1 6 4 0 m e d i u m l a c k i n g I L 3 a n d p l a t e d i n 9 6 w e l l m i c r o t i t e r p l a t e s a t 2 x 1 0 4 c e l l s / w e l l F G F 2 a t 2 0 0 p M a n d e i t h e r h e p a r i n p e r l e c a n p e r l e c a n d i g e s t e d w i t h p r o t e a s e f r e e c h o n d r o i t i n a s e A B C o r c h o n d r o i t i n s u l f a t e d i g e s t e d w i t h p r o t e a s e f r e e c h o n d r o i t i n a s e A B C w e r e a d d e d a t 0 5 g / m l a l l i n 2 0 0 l R P M I 1 6 4 0 m e d i u m p e r w e l l O n e m i c r o c u r i e o f [ 3 H ] t h y m i d i n e i n 5 0 l o f R P M I 1 6 4 0 w a s a d d e d 3 6 h l a t e r a n d a f t e r 6 h o f c u l t u r e c e l l s w e r e c o l l e c t e d w i t h a P H D c e l l h a r v e s t e r ( C a m b r i d g e T e c h n o l o g i e s I n c W a t e r t o w n M A U S A ) I n c o r p o r a t e d [ 3 H ] t h y m i d i n e w a s d e t e r m i n e d b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g

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60 R e s u l t s B i n d i n g o f F G F 2 t o P e r l e c a n i n t h e C A F A s s a y P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d t o o p t i m i z e t h e a m o u n t o f p e r l e c a n u s e d i n t h e C A F a s s a y W e f i r s t t e s t e d t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f t h e c a t i o n i c m e m b r a n e f o r p e r l e c a n b y f i l t e r i n g d i f f e r e n t a m o u n t s o f p e r l e c a n a n d m e a s u r i n g t h e a m o u n t b o u n d t o t h e f i l t e r w i t h t h e a n t i s e r u m t o p e r l e c a n T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e m a x i m u m a m o u n t o f p e r l e c a n t h a t c o u l d b e r e t a i n e d o n t h e f i l t e r w a s ~ 8 n g ( D a t a n o t s h o w n ) Q u a n t i t i e s o f 1 6 n g t o 8 n g o f p e r l e c a n w e r e u s e d i n i n c u b a t i o n s c o n t a i n i n g p e r l e c a n a n d i n c u b a t i o n s w e r e a l l o w e d t o p r o c e e d f o r o n e h o u r i n a l l s u b s e q u e n t b i n d i n g a n d c o m p e t i t i o n a s s a y s T h e b i n d i n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 t o 2 n g p e r l e c a n w a s d e t e r m i n e d a t c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 0 0 8 6 t o 4 4 n M [ 1 2 5 I ] F G F 2 ( F i g u r e 5 ) A f t e r s u b t r a c t i n g b a c k g r o u n d b i n d i n g o f F G F 2 t o t h e Z e t a P r o b e m e m b r a n e ( F i g u r e 5 n o p e r l e c a n ) w e f o u n d a p p r o x i m a t e l y 1 6 n a n o g r a m o f F G F 2 b o u n d p e r n a n o m o l a r F G F 2 a d d e d i n t h e r a n g e o f 0 1 7 2 t o 2 2 n M F G F 2 a d d e d u n t i l s a t u r a t i o n w a s r e a c h e d a t 2 2 n M H S p a r t i c i p a t e s i n p e r l e c a n F G F 2 b i n d i n g P e r l e c a n w a s e i t h e r l e f t u n d i g e s t e d o r d i g e s t e d s e p a r a t e l y w i t h e i t h e r p r o t e a s e f r e e c h o n d r o i t i n a s e A B C o r a m i x t u r e o f h e p a r i t i n a s e s I a n d I I U n d i g e s t e d o r g l y c o s i d a s e t r e a t e d p e r l e c a n w a s t h e n i n c u b a t e d w i t h 4 n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 a n d s p e c i f i c b i n d i n g d e t e r m i n e d B i n d i n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 t o p e r l e c a n w a s m a r k e d l y r e d u c e d b y h e p a r i t i n a s e d i g e s t i o n i n d i c a t i n g a r e q u i r e m e n t f o r h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s i n p e r l e c a n F G F 2 b i n d i n g ( F i g u r e 6 ) C h o n d r o i t i n a s e d i g e s t i o n i n c r e a s e d [ 1 2 5 I ] F G F 2 b i n d i n g t o p e r l e c a n

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61 s l i g h t l y b u t n o t s i g n i f i c a n t l y E q u i v a l e n t b i n d i n g o f u n d i g e s t e d a n d g l y c o s i d a s e t r e a t e d p e r l e c a n t o t h e Z e t a P r o b e m e m b r a n e w a s c o n f i r m e d b y i m m u n o b l o t t i n g ( d a t a n o t s h o w n ) T h e a b i l i t y o f f r e e c h o n d r o i t i n s u l f a t e o r h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s t o c o m p e t e f o r t h e b i n d i n g o f p e r l e c a n t o F G F 2 w a s a l s o e v a l u a t e d P e r l e c a n w a s a d d e d t o t u b e s c o n t a i n i n g 0 2 0 0 n g o f c h o n d r o i t i n s u l f a t e C o r b o v i n e k i d n e y H S f o l l o w e d b y t h e a d d i t i o n o f 1 n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 A f t e r o n e h o u r o f i n c u b a t i o n t h e s a m p l e s w e r e f i l t e r e d a n d s p e c i f i c b i n d i n g d e t e r m i n e d H e p a r a n s u l f a t e r e d u c e d [ 1 2 5 I ] F G F 2 b i n d i n g t o p e r l e c a n b y 9 0 % b u t d i d n o t a b o l i s h b i n d i n g e v e n a t 1 g / m l ( F i g u r e 7 ) I n c o n t r a s t c h o n d r o i t i n s u l f a t e d i d n o t r e d u c e b i n d i n g T h i s c o n f i r m s t h e r e s u l t s o b t a i n e d b y d i g e s t i n g t h e p e r l e c a n w i t h c h o n d r o i t i n a s e A B C o r h e p a r i t i n a s e s a n d m e a s u r i n g F G F 2 b i n d i n g ( F i g u r e 6 ) B i n d i n g o f F G F 2 t o p e r l e c a n i n t h e I P a s s a y T h e l i n e a r i t y o f t h e I P a s s a y w a s f i r s t d e t e r m i n e d b y c o m b i n i n g p e r l e c a n w i t h [ 1 2 5 I ] F G F 2 ( 1 g / 1 0 6 c p m ) a n d i m m u n o p r e c i p i t a t i n g a l i q u o t s o f t h i s m i x t u r e c o n t a i n i n g 2 5 5 0 0 n g o f p e r l e c a n u s i n g a n t i p e r l e c a n s e r u m a n d p r o t e i n G b e a d s T h e a m o u n t o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 e l u t e d f r o m t h e b e a d s w i t h 2 M s o d i u m c h l o r i d e a n d t h e a m o u n t r e m a i n i n g o n t h e b e a d s w a s t h e n m e a s u r e d A p p r o x i m a t e l y 7 0 % o f t h e [ 1 2 5 I ] F G F 2 b o u n d t o b e a d s i n t h e p r e s e n c e o f t h e a n t i s e r u m t o p e r l e c a n w a s e l u t e d b y 2 M s o d i u m c h l o r i d e ( F i g u r e s 8 A a n d B ) A p p r o x i m a t e l y t w o f o l d m o r e [ 1 2 5 I ] F G F 2 w a s r e l e a s e d b y 2 M s o d i u m c h l o r i d e f r o m b e a d s i n c u b a t e d w i t h t h i s a n t i s e r u m t o p e r l e c a n t h a n f r o m b e a d s i n c u b a t e d w i t h a n a n t i s e r u m t o a g g r e c a n o r b e a d s i n c u b a t e d w i t h o u t s e r u m t h r o u g h o u t t h e r a n g e o f p e r l e c a n t e s t e d ( F i g u r e 8 A ) T h i s i n d i c a t e s t h a t t h i s I P a s s a y i s l i n e a r f o r u p t o 5 0 0 n g o f p e r l e c a n

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62 W e t h e n u s e d t h e I P a s s a y t o d e t e r m i n e t h e r o l e o f t h e h e p a r a n s u l f a t e o r c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s o n p e r l e c a n i n b i n d i n g [ 1 2 5 I ] F G F 2 w h i c h w a s s u b s e q u e n t l y r e l e a s e d b y 2 M s o d i u m c h l o r i d e a n d m e a s u r e d ( F i g u r e 9 ) C h o n d r o i t i n a s e d i g e s t i o n e n h a n c e d F G F 2 b i n d i n g b y 2 0 % b u t b e c a u s e t h i s i n c r e a s e w a s s e e n w i t h b o t h t h e n o n i m m u n e s e r u m a n d t h e p e r l e c a n a n t i s e r u m t h e b i n d i n g i s n o t s i g n i f i c a n t H e p a r i t i n a s e d i g e s t i o n h o w e v e r r e d u c e d t h e b i n d i n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 t o p e r l e c a n b y 8 5 % B i n d i n g o f F G F 2 t o F G F R e c e p t o r s : C e l l f r e e A s s a y P r e v i o u s s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t t h e f o r m a t i o n o f a t r i m o l e c u l a r c o m p l e x c o n s i s t i n g o f h e p a r i n / h e p a r a n s u l f a t e F G F R a n d F G F c o u l d b e r e q u i r e d f o r c e l l r e c e p t o r m e d i a t e d s i g n a l i n g t o o c c u r ( O r n i t z Y a y o n e t a l 1 9 9 2 ; C h e l l a i a h Y u a n e t a l 1 9 9 9 ) S i n c e F G F 2 w a s s h o w n t o b i n d p e r l e c a n i n b o t h t h e c a t i o n i c f i l t r a t i o n a s s a y a n d t h e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y i n t h i s s t u d y w e f i r s t t e s t e d t h e a b i l i t y o f p e r l e c a n t o e n h a n c e F G F 2 b i n d i n g t o F G F R 1 c a n d F G F R 3 c u s i n g t h e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y T h e s p e c i f i c a l l y b o u n d F G F 2 i s s h o w n a s a f u n c t i o n o f t h e G A G c o n c e n t r a t i o n a d d e d ( F i g u r e 1 0 ) F o r b o t h r e c e p t o r s a d d i t i o n o f p e r l e c a n c a u s e d a s t e a d y d e c r e a s e i n t h e a m o u n t o f F G F 2 t h a t b o u n d t h e F G F r e c e p t o r I n c o n t r a s t a d d i t i o n o f c h o n d r o i t i n a s e d i g e s t e d p e r l e c a n i n c r e a s e d t h e a m o u n t o f F G F 2 t h a t b o u n d t o e a c h o f t h e r e c e p t o r s T h e a d d i t i o n o f h e p a r i n i n c r e a s e d t h e b i n d i n g o f F G F 2 t o F G F R 1 c b u t d e c r e a s e d t h e b i n d i n g o f F G F 2 t o F G F R 3 c B i n d i n g o f F G F 2 t o F G F R e c e p t o r s : E f f e c t o n c e l l p r o l i f e r a t i o n W e a l s o t e s t e d t h e a b i l i t y o f p e r l e c a n c o n t a i n i n g b o u n d F G F 2 t o f o r m a c o m p l e x w i t h F G F R a n d e n h a n c e t h e m i t o g e n i c a c t i v i t y o f F G F 2 o n B a F 3 c e l l s e x p r e s s i n g F G F R 1 c o r F G F R 3 c P e r l e c a n d i d

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63 n o t s t i m u l a t e i n c o r p o r a t i o n o f [ 3 H ] t h y m i d i n e i n B a F 3 c e l l s e x p r e s s i n g F G F R 3 c ( F i g u r e 1 1 l e f t p a n e l ) b u t d i d p r o d u c e a s l i g h t s t i m u l a t i o n o f [ 3 H ] t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n a t t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f p e r l e c a n i n B a F 3 c e l l s e x p r e s s i n g F G F R 1 c ( F i g u r e 1 1 r i g h t p a n e l ) I n c o n t r a s t p e r l e c a n d i g e s t e d w i t h c h o n d r o i t i n a s e A B C t o r e m o v e t h e c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s s t i m u l a t e d [ 3 H ] t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n i n b o t h B a F 3 c e l l l i n e s T h e c h o n d r o i t i n a s e A B C d i g e s t e d c h o n d r o i t i n s u l f a t e c o n t r o l d i d n o t s t i m u l a t e i n c o r p o r a t i o n i n e i t h e r c e l l l i n e D i s c u s s i o n T h e r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s u s i n g b o t h a c a t i o n i c f i l t r a t i o n ( C A F ) a s s a y a n d a n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a s s a y s h o w t h a t p e r l e c a n p u r i f i e d f r o m t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e b i n d s t o F G F 2 a n d t h i s i n d i c a t e s t h a t n o o t h e r e x t r a c e l l u l a r m a t r i x c o m p o n e n t s a r e n e e d e d f o r t h i s b i n d i n g t o o c c u r T h i s b i n d i n g i s p r i m a r i l y t o t h e h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s o n p e r l e c a n R e m o v a l o f t h e h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s b y h e p a r i t i n a s e d i g e s t i o n m a r k e d l y d e c r e a s e d F G F 2 b i n d i n g a n d c o m p e t i t i o n s t u d i e s w i t h h e p a r a n s u l f a t e r e d u c e d b i n d i n g b y 9 0 % T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t t h e h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s o n p e r l e c a n a r e e s s e n t i a l f o r m a x i m u m F G F 2 b i n d i n g T h e a m o u n t o f F G F 2 t h a t c o u l d b i n d t o p e r l e c a n i n t h e C A F a s s a y w a s d e p e n d e n t o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f F G F 2 u s e d ( F i g u r e 5 ) W e f o u n d t h a t a t a c o n c e n t r a t i o n o f 2 2 n M F G F 2 ( a t w h i c h b i n d i n g t o p e r l e c a n w a s s a t u r a t e d ) 3 5 n g o f F G F 2 c o u l d b i n d t o 2 n g o f p e r l e c a n T h e a m o u n t o f p e r l e c a n u s e d i n t h e s e a s s a y s i s b a s e d o n i t s g l y c o s a m i n o g l y c a n c o n t e n t B a s e d o n t h e m a s s o f p e r l e c a n s

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64 c o r e p r o t e i n ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ; M u r d o c h D o d g e e t a l 1 9 9 2 ) a n d t h e m a s s a n d n u m b e r o f t h e g l y c o s a m i n o g l y c a n c h a i n s ( D o l a n H o r c h a r e t a l 1 9 9 7 ; T a p a n a d e c h o p o n e H a s s e l l e t a l 1 9 9 9 ; G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) p e r l e c a n c a n b e d e t e r m i n e d t o c o n t a i n ~ 2 0 % g l y c o s a m i n o g l y c a n T h e 2 n g o f g l y c o s a m i n o g l y c a n o n p e r l e c a n ( F i g u r e 5 ) w o u l d t h e n c o r r e s p o n d t o ~ 1 0 n g o f p e r l e c a n E s t i m a t i n g t h e m o l e c u l a r m a s s o f p e r l e c a n a s ~ 6 0 0 k D a a n d F G F 2 a s ~ 1 7 k D a 1 0 n g o f p e r l e c a n b i n d i n g t o 3 5 n g o f F G F 2 w o u l d c o r r e s p o n d t o a m a x i m u m o f 1 2 3 m o l e c u l e s o f F G F 2 p e r m o l e c u l e o f p e r l e c a n T h i s w o u l d s u p p o r t t h e o f t e n p r o p o s e d t h e o r y o f p e r l e c a n a c t i n g a s a s i n k o r r e s e r v o i r f o r g r o w t h f a c t o r s i n c a r t i l a g e a n d o t h e r t i s s u e ( A v i e z e r H e c h t e t a l 1 9 9 4 ; I o z z o 1 9 9 4 ; M o n g i a t T a y l o r e t a l 2 0 0 0 ; D e g u c h i O k u t s u e t a l 2 0 0 2 ) P r e v i o u s w o r k h a s s h o w n t h a t h e p a r i n c a n e n h a n c e t h e d i r e c t b i n d i n g o f F G F 2 t o t h e c e l l s u r f a c e F G F r e c e p t o r ( O r n i t z Y a y o n e t a l 1 9 9 2 ) W e c o n f i r m e d t h i s h e p a r i n m e d i a t e d e n h a n c e m e n t o f F G F 2 b i n d i n g t o F G F R 1 c i n t h e c e l l f r e e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y a n d t o b o t h F G F R 1 c a n d F G F R 3 c i n t h e B a F 3 p r o l i f e r a t i o n a s s a y W h i l e p u r i f i e d p e r l e c a n c o u l d b i n d F G F 2 i n b o t h t h e C A F a n d I P a s s a y s i t d i d n o t m e d i a t e t h e F G F 2 s t i m u l a t i o n o f [ 3 H ] t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n i n B a F 3 c e l l s e x p r e s s i n g F G F R 1 c o r F G F R 3 c ( F i g u r e 1 1 ) H o w e v e r p e r l e c a n t h a t h a d b e e n d i g e s t e d w i t h c h o n d r o i t i n a s e A B C t o r e m o v e c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s s t i m u l a t e d i n c o r p o r a t i o n i n t h i s c e l l l i n e I n t h e F R A P I P a s s a y p u r i f i e d p e r l e c a n r e d u c e d t h e b i n d i n g o f F G F 2 t o i t s r e c e p t o r s s e q u e s t e r i n g t h e F G F 2 f r o m t h e F G F R w h i l e p e r l e c a n t h a t h a d b e e n d i g e s t e d w i t h c h o n d r o i t i n a s e A B C d e l i v e r e d m o r e F G F 2 t o b o t h F G F R 1 c a n d F G F R 3 c ( F i g u r e 1 0 ) T h e d a t a f r o m b o t h t h e F R A P a n d t h e B a F 3 r e c e p t o r a s s a y s i n d i c a t e t h a t t h e c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s o n p e r l e c a n i n h i b i t d e l i v e r y o f t h e b o u n d F G F 2 t o i t s

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65 r e c e p t o r s T h e s e f i n d i n g s f u r t h e r i n d i c a t e t h a t p e r l e c a n m a d e w i t h o u t c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s c o u l d d e l i v e r b o u n d F G F 2 t o t h e r e c e p t o r w h i l e p e r l e c a n m a d e w i t h c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s w o u l d a c t o n l y a s a s i n k f o r F G F 2 P e r l e c a n m a d e b y t h e E H S t u m o r a n d b y e n d o t h e l i a l c e l l s o n l y h a v e h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s t h a t a r e ~ 7 0 k D a a n d ~ 4 0 k D a i n s i z e r e s p e c t i v e l y ( H a s s e l l R o b e y e t a l 1 9 8 0 ; K n o x M e r r y e t a l 2 0 0 2 ) P e r l e c a n i s o l a t e d f r o m t h e g r o w t h p l a t e h a s h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s o f 2 0 2 2 k D a a n d c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s o f 3 7 4 2 k D a ( W e s t G o v i n d r a j e t a l 2 0 0 6 ) a n d o f t h e t o t a l g l y c o s a m i n o g l y c a n p r e s e n t 7 5 % i s c h o n d r o i t i n s u l f a t e a n d 2 5 % i s h e p a r a n s u l f a t e ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) T h i s s u g g e s t s t h a t a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e G A G c h a i n s o n g r o w t h p l a t e p e r l e c a n w o u l d b e c h o n d r o i t i n s u l f a t e a n d h a l f w o u l d b e h e p a r a n s u l f a t e T h e s e r i n e r e s i d u e s o n t h e c o r e p r o t e i n o f p e r l e c a n t h a t s e r v e t o i n i t i a t e G A G s y n t h e s i s w e r e d e t e r m i n e d b y e x p r e s s i n g m u r i n e c D N A c o d i n g f o r t h e d o m a i n s o f p e r l e c a n a s r e c o m b i n a n t p r o d u c t s i n e u k a r y o t i c c e l l s a n d t h e n c h a r a c t e r i z i n g t h e p r o d u c t s T h e s e s t u d i e s s h o w e d t h a t t h e r e a r e t h r e e s e r i n e s i n d o m a i n I ( C o s t e l l M a n n e t a l 1 9 9 7 ; D o l a n H o r c h a r e t a l 1 9 9 7 ; S a s a k i C o s t e l l e t a l 1 9 9 8 ) a n d t w o s e r i n e s i n d o m a i n V ( F r i e d r i c h G o h r i n g e t a l 1 9 9 9 ; T a p a n a d e c h o p o n e H a s s e l l e t a l 1 9 9 9 ) t h a t c a n b e s u b s t i t u t e d w i t h a G A G c h a i n T h e t h r e e s i t e s i n d o m a i n I a r e w i t h i n a s p a n o f 1 2 a m i n o a c i d s w i t h e a c h s i t e c a p a b l e o f r e c e i v i n g e i t h e r a h e p a r a n s u l f a t e c h a i n o r a c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n ( D o l a n H o r c h a r e t a l 1 9 9 7 ) T h e t w o g l y c o s a m i n o g l y c a n s i t e s i n d o m a i n V a r e s e p a r a t e d b y 3 5 4 r e s i d u e s b u t a n e x t e n s i v e c y s t e i n e r i c h r e g i o n b e t w e e n t h e t w o s i t e s w o u l d a c t t o b r i n g t h e m c l o s e r t o g e t h e r T h e N t e r m i n a l s i t e i n d o m a i n V o n l y r e c e i v e s c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s b u t t h e C t e r m i n a l s i t e c a n r e c e i v e h e p a r a n s u l f a t e T h e s e s e q u e n c e s f o r G A G a t t a c h m e n t a r e c o n s e r v e d

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66 i n h u m a n s ( a c c e s s i o n n u m b e r N P 0 0 5 5 2 0 ) a n d b o v i n e ( X P 5 8 2 0 2 4 ) p e r l e c a n T a k i n g a l l t h i s t o g e t h e r w e h a v e c o m p o s e d a s t r u c t u r a l m o d e l o f a t y p i c a l b o v i n e g r o w t h p l a t e p e r l e c a n m o l e c u l e i n d i c a t i n g t h e l o c a t i o n a n d r e l a t i v e s i z e s o f t h e t w o t y p e s o f G A G c h a i n s ( F i g u r e 1 2 ) O u r d a t a s h o w t h a t t h e p r e s e n c e o f t h e c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s o n p e r l e c a n i s o l a t e d f r o m t h e g r o w t h p l a t e p r e v e n t s d e l i v e r y o f t h e b o u n d F G F 2 t o t h e r e c e p t o r W e p r o p o s e t h a t t h e l a r g e r s i z e o f t h e s e C S c h a i n s c o u p l e d w i t h t h e i r p r o x i m i t y t o t h e h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s c o u l d s t e r i c a l l y h i n d e r t h e t r a n s f e r o f t h e H S b o u n d F G F 2 t o t h e r e c e p t o r ( F i g u r e 1 2 ) T h i s s u g g e s t s t h a t p e r l e c a n c o n t a i n i n g c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s c o u l d a c t o n l y a s a r e s e r v o i r f o r F G F 2 w h i l e p e r l e c a n w i t h h e p a r a n s u l f a t e o n l y c o u l d a c t t o d e l i v e r F G F 2 t o F G F r e c e p t o r s ; t h e r e f o r e t h e a d d i t i o n o f c h o n d r o i t i n s u l f a t e t o p e r l e c a n w o u l d d e t e r m i n e i t s r o l e a s a s i n k f o r F G F 2 i n t h e g r o w t h p l a t e m a t r i x T h e d e g r a d a t i o n o f p e r l e c a n i n t h e h y p e r t r o p h i c z o n e o f t h e g r o w t h p l a t e ( W e s t G o v i n d r a j e t a l 2 0 0 6 ) c o u l d a l s o r e l e a s e t h i s b o u n d F G F 2 t o p r o m o t e e n t r y o f v a s c u l a t u r e n e c e s s a r y t o m i n e r a l i z e t h e m a t r i x i n t h i s z o n e F G F R 1 a n d F G F R 3 a r e d i r e c t r e g u l a t o r s o f c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n ( O r n i t z a n d L e d e r 1 9 9 2 ) T h e k i n a s e d o m a i n s o f t h e s e t w o r e c e p t o r s h a v e v e r y s i m i l a r a c t i v i t i e s i n l o n g b o n e g r o w t h w h e n e x p r e s s e d i n g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s T h e d i f f e r e n c e s s e e n i n o u r r e c e p t o r s t u d i e s c o u l d b e d u e t o t h e d i f f e r e n t c o n s t r u c t s u s e d ; i n t h e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y t h e r e c e p t o r s a r e t r u n c a t e d b y u s i n g o n l y t h e e x t r a c e l l u l a r d o m a i n f u s e d t o a l k a l i n e p h o s p h a t a s e w h e r e a s i n t h e B a F 3 a s s a y t h e f u l l l e n g t h r e c e p t o r i s u s e d A l s o c o n s i d e r i n g t h e d i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f h e p a r i n o n t h e t w o r e c e p t o r s h e p a r i n i s k n o w n t o b e c a p a b l e o f b o t h s t i m u l a t i n g a n d i n h i b i t i n g t h e b i n d i n g o f F G F 2 t o F G F r e c e p t o r s t o a f f e c t c e l l

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67 a c t i v i t y ( G o s p o d a r o w i c z F e r r a r a e t a l 1 9 8 7 ; G o s p o d a r o w i c z N e u f e l d e t a l 1 9 8 7 ) S i m i l a r l y v a r i e d i n t e r a c t i o n s o f p e r l e c a n a n d F G F 2 w i t h F G F R s h a v e b e e n s e e n i n w o r k d o n e b y o t h e r r e s e a r c h e r s K n o x e t a l 2 0 0 2 f o u n d t h a t t h e B a F 3 c e l l s y s t e m r e s p o n s e w a s d i f f e r e n t d e p e n d i n g n o t o n l y o n t h e s o u r c e o f t h e p e r l e c a n b u t a l s o o n w h i c h F G F R t h e c e l l s e x p r e s s e d P e r l e c a n m a d e b y h u m a n u m b i l i c a l a r t e r i a l e n d o t h e l i a l c e l l s ( H U A E C ) a n d b y a c o n t i n u o u s e n d o t h e l i a l c e l l l i n e ( C 1 1 S T H ) s t i m u l a t e d F G F 2 m e d i a t e d p r o l i f e r a t i o n o f B a F 3 c e l l s e x p r e s s i n g F G F R 1 c I n c o n t r a s t c e l l s e x p r e s s i n g F G F R 3 w e r e s t i m u l a t e d t o p r o l i f e r a t e o n l y b y H U A E C p e r l e c a n A n a l y s i s o f t h e g l y c o s a m i n o g l y c a n ( G A G ) c h a i n s o n t h e p e r l e c a n f r o m t h e s e t w o c e l l t y p e s s h o w e d t h a t t h e G A G s f r o m t h e H U A E C p e r l e c a n c o u l d b e e n t i r e l y d i g e s t e d w i t h h e p a r i n a s e w h i l e a p o r t i o n o f t h e G A G s o n t h e C 1 1 S T H p e r l e c a n w a s r e s i s t a n t t o h e p a r i n a s e T h e s e n o n h e p a r a n s u l f a t e G A G s m a y b e b l o c k i n g t h e d e l i v e r y o f t h e b o u n d F G F 2 t o F G F R 3 T h e f i n d i n g s o f o u r s t u d y a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e p h e n o t y p e o f t h e p e r l e c a n n u l l m o u s e w h i c h s h o w s r e d u c e d I n d i a n h e d g e h o g e x p r e s s i o n a n d r e d u c e d p r o l i f e r a t i o n o f c h o n d r o c y t e s i n t h e g r o w t h p l a t e ( A r i k a w a H i r a s a w a W a t a n a b e e t a l 1 9 9 9 ) I n c o n t r a s t t o t h e F G F R 3 i n B a F 3 c e l l s a n d i n m o s t o t h e r c e l l t y p e s F G F R 3 i s a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n i n t h e g r o w t h p l a t e ( C o l v i n B o h n e e t a l 1 9 9 6 ; O r n i t z a n d M a r i e 2 0 0 2 ) T h a t i s w h e n t h e r e c e p t o r i n g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s i s a c t i v a t e d b y b o u n d F G F i t i n h i b i t s I n d i a n h e d g e h o g e x p r e s s i o n a n d p r o l i f e r a t i o n i s p r e v e n t e d I n t h i s s t u d y w e h a v e s h o w n t h a t t h e h e p a r a n s u l f a t e o n g r o w t h p l a t e p e r l e c a n b i n d s F G F 2 O u r d a t a a r e a l s o c o n s i s t e n t w i t h t h e c h o n d r o i t i n s u l f a t e o n p e r l e c a n i n h i b i t i n g F G F 2 d e l i v e r y t o i t s r e c e p t o r P e r l e c a n i n t h e g r o w t h p l a t e w o u l d b e a c t i n g a s

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68 p r e v i o u s l y p r o p o s e d ( A r i k a w a H i r a s a w a W a t a n a b e e t a l 1 9 9 9 ) t o s e q u e s t e r F G F 2 a w a y f r o m F G F R 3 a n d a l l o w c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n t o o c c u r I t s h o u l d b e n o t e d t h a t a r e c e n t s t u d y ( K v i s t J o h n s o n e t a l 2 0 0 6 ) s h o w e d t h a t t h e c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s o f p e r l e c a n c a n b i n d t o c o l l a g e n T h i s i n t e r a c t i o n w i t h c o l l a g e n w o u l d l i k e l y e n h a n c e t h e s e q u e s t r a t i o n o f t h e g r o w t h f a c t o r ( b o u n d t o p e r l e c a n ) a w a y f r o m i t s r e c e p t o r i n t h e g r o w t h p l a t e A c k n o w l e d g m e n t s T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y f u n d i n g f r o m S h r i n e r s H o s p i t a l s f o r C h i l d r e n N o r t h A m e r i c a ( t o J R H ) a n d b y N I H g r a n t H D 3 9 9 5 2 ( t o D M O ) W e t h a n k J a c k i e G a h a g a n f o r t h e p r e p a r a t i o n o f t h e m a n u s c r i p t

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69 F i g u r e s F i gu r e 5. B i n d i n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 t o p e r l e c a n i n t h e c a t i o n i c f i l t r a t i o n ( C A F ) a s s a y [ 1 2 5 I ] F G F 2 ( 0 0 8 6 4 4 n M ; 0 2 9 3 1 5 0 n g / t u b e ) w a s a d d e d t o t u b e s w i t h o u t ( ) o r w i t h p e r l e c a n ( 1 0 n g G A G / m l ; 2 n g G A G / t u b e ) A f t e r i n c u b a t i o n f o r 1 h t h e s a m p l e s w e r e f i l t e r e d a c r o s s t h e c a t i o n i c m e m b r a n e a n d t h e c o u n t s r e t a i n e d o n t h e f i l t e r w e r e d e t e r m i n e d F r o m t h e s p e c i f i c a c t i v i t y t h a t w a s d e t e r m i n e d f o r t h e l a b e l e d F G F 2 t h e n a n o g r a m a m o u n t s o f F G F 2 c o r r e s p o n d i n g t o t h e b o u n d c o u n t s w e r e c a l c u l a t e d a n d a r e s h o w n A f t e r s u b t r a c t i n g b a c k g r o u n d b i n d i n g o f F G F 2 t o t h e Z e t a P r o b e m e m b r a n e t h e s p e c i f i c b i n d i n g i s a l s o i n d i c a t e d ( ) T h e a d d i t i o n o f p e r l e c a n s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d [ 1 2 5 I ] F G F 2 r e t e n t i o n a t a l l c o n c e n t r a t i o n s t e s t e d ( p < 0 0 4 p a i r e d t t e s t ) A l l d a t a p o i n t s h a v e e r r o r b a r s r e p r e s e n t i n g S E M

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70 F i g u r e 6 E f f e c t o f c h o n d r o i t i n a s e o r h e p a r i t i n a s e p r e t r e a t m e n t o f p e r l e c a n o n s p e c i f i c b i n d i n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 i n t h e C A F a s s a y P e r l e c a n w a s e i t h e r l e f t u n d i g e s t e d ( U ) o r d i g e s t e d s e p a r a t e l y w i t h e i t h e r c h o n d r o i t i n a s e A B C ( C ) o r a m i x t u r e o f h e p a r i t i n a s e s I a n d I I ( H ) A f t e r i n c u b a t i o n o f p e r l e c a n ( 1 0 n g / m l ; 2 n g / t u b e ) f o r 1 h w i t h [ 1 2 5 I ] F G F 2 ( 2 0 n g / m l ; 4 n g / t u b e ) t h e s a m p l e s w e r e f i l t e r e d a c r o s s t h e c a t i o n i c m e m b r a n e a n d t h e c o u n t s r e t a i n e d o n t h e f i l t e r w e r e d e t e r m i n e d E q u i v a l e n t b i n d i n g o f u n d i g e s t e d a n d g l y c o s i d a s e t r e a t e d p e r l e c a n t o t h e c a t i o n i c m e m b r a n e w a s c o n f i r m e d b y i m m u n o b l o t t i n g t h e m e m b r a n e H e p a r i t i n a s e d i g e s t i o n o f p e r l e c a n s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d [ 1 2 5 I ] F G F 2 p e r l e c a n b i n d i n g ( p = 0 0 0 3 p a i r e d t t e s t ) E r r o r b a r s r e p r e s e n t S E M

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71 F i g u r e 7 E f f e c t o f c h o n d r o i t i n s u l f a t e o r h e p a r a n s u l f a t e o n s p e c i f i c F G F 2 b i n d i n g i n t h e C A F a s s a y P e r l e c a n ( 4 0 n g / m l 8 n g / t u b e ) w a s i n c u b a t e d i n t u b e s c o n t a i n i n g 0 1 0 0 0 n g / m l ( 0 2 0 0 n g / t u b e ) c h o n d r o i t i n s u l f a t e C ( C S C ) o r b o v i n e k i d n e y H S ( ) F o l l o w i n g t h e a d d i t i o n o f 5 n g / m l ( 1 n g / t u b e ) o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 s a m p l e s w e r e i n c u b a t e d f o r 1 h f i l t e r e d a n d s p e c i f i c b i n d i n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 d e t e r m i n e d R e s u l t s a r e t h e m e a n s o f d u p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s

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72 F i g u r e 8 B i n d i n g o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 t o p e r l e c a n i n t h e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a s s a y P e r l e c a n a n d [ 1 2 5 I ] F G F 2 ( 1 g / 1 0 6 c p m ) w e r e m i x e d a n d a l i q u o t s c o n t a i n i n g 2 5 5 0 0 n g o f p e r l e c a n w e r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h p r o t e i n G b e a d s a f t e r i n c u b a t i o n i n t h e a b s e n c e o f s e r u m o r w i t h a n t i s e r a t o p e r l e c a n o r a g g r e c a n A f t e r w a s h i n g t o r e m o v e u n b o u n d [ 1 2 5 I ] F G F 2 t h e a m o u n t o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 r e l e a s e d f r o m t h e b e a d s b y 2 M s o d i u m c h l o r i d e ( A ) a n d t h e [ 1 2 5 I ] F G F 2 r e m a i n i n g o n t h e b e a d s ( B ) w a s m e a s u r e d [ 1 2 5 I ] F G F 2 e l u t e d b y 2 M s o d i u m c h l o r i d e w a s s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r f o r p e r l e c a n v e r s u s a g g r e c a n a n t i s e r a t r e a t e d s a m p l e s a t e a c h c o n c e n t r a t i o n o f p e r l e c a n u s e d ( p < 0 0 5 p a i r e d t t e s t ) A l l d a t a p o i n t s h a v e e r r o r b a r s r e p r e s e n t i n g S D

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73 F i g u r e 9 E f f e c t s o f c h o n d r o i t i n a s e a n d h e p a r i t i n a s e p r e t r e a t m e n t o f p e r l e c a n o n [ 1 2 5 I ] F G F 2 b i n d i n g u s i n g t h e I P a s s a y P e r l e c a n ( 1 2 5 n g ) w a s e i t h e r l e f t u n d i g e s t e d ( U ) d i g e s t e d w i t h c h o n d r o i t i n a s e A B C ( C ) d i g e s t e d w i t h a m i x t u r e o f h e p a r i t i n a s e s I a n d I I ( H ) o r d i g e s t e d w i t h b o t h c h o n d r o i t i n a s e a n d h e p a r i t i n a s e s ( C + H ) i n c u b a t e d w i t h 1 0 5 c p m o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 a n d i m m u n o p r e c i p i t a t e d u s i n g n o n i m m u n e s e r u m o r p e r l e c a n a n t i s e r u m a n d p r o t e i n G b e a d s A f t e r w a s h i n g t o r e m o v e u n b o u n d [ 1 2 5 I ] F G F t h e a m o u n t o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 r e l e a s e d f r o m t h e b e a d s b y 2 M s o d i u m c h l o r i d e w a s m e a s u r e d H e p a r i t i n a s e a n d c h o n d r o i t i n a s e + h e p a r i t i n a s e t r e a t m e n t s o f p e r l e c a n s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d t h e a m o u n t o f [ 1 2 5 I ] F G F 2 r e l e a s e d f r o m t h e b e a d s b y 2 M s o d i u m c h l o r i d e ( p < 0 0 2 p a i r e d t t e s t ) E r r o r b a r s r e p r e s e n t S D

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74 F i g u r e 1 0 B i n d i n g o f F G F 2 t o s o l u b l e F G F R 1 c a n d F G F R 3 c I o d i n a t e d F G F 2 w a s a d d e d t o F R A P c o n d i t i o n e d m e d i u m H e p a r i n p e r l e c a n o r c h o n d r o i t i n a s e d i g e s t e d p e r l e c a n w a s a l s o a d d e d i n c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 0 t o 2 5 g G A G / m l T h e r e c e p t o r s w e r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h a n t i a l k a l i n e p h o s p h a t a s e a n t i b o d y a n d P r o t e i n G S e p h a r o s e a n d t h e a m o u n t o f l a b e l e d F G F 2 b o u n d t o t h e b e a d s d e t e r m i n e d i n a g a m m a c o u n t e r A l l d a t a p o i n t s h a v e e r r o r b a r s r e p r e s e n t i n g S E M

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75 F i g u r e 1 1 H e p a r i n a n d p e r l e c a n a u g m e n t a t i o n o f [ 3 H ] t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n i n t o F G F 2 t r e a t e d B a F 3 c e l l s B a F 3 c e l l s e x p r e s s i n g e i t h e r F G F R 1 c ( p a r t A ) o r F G F R 3 c ( p a r t B ) w e r e t r e a t e d w i t h 2 0 0 p M F G F 2 a n d 0 5 g / m l o f e i t h e r h e p a r i n p e r l e c a n c h o n d r o i t i n a s e A B C d i g e s t e d p e r l e c a n ( p e r l e c a n > p f A B C ) o r c h o n d r o i t i n a s e A B C d i g e s t e d c h o n d r o i t i n s u l f a t e ( C S C > p f A B C ) a n d t h e n r a d i o l a b e l e d w i t h [ 3 H ] t h y m i d i n e t o d e t e r m i n e p r o l i f e r a t i o n r a t e s A l l d a t a p o i n t s h a v e e r r o r b a r s r e p r e s e n t i n g S D

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76 F i g u r e 1 2 H y p o t h e t i c a l m o d e l o f F G F 2 b i n d i n g t o p e r l e c a n a n d d e l i v e r y t o F G F r e c e p t o r ( A ) P e r l e c a n w i t h h e p a r a n a n d c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s c a n b i n d F G F 2 b u t t h e c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s p r e v e n t d e l i v e r y o f b o u n d F G F 2 t o t h e F G F r e c e p t o r ( B ) P e r l e c a n w i t h o n l y h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s c a n b i n d F G F 2 a n d d e l i v e r i t t o t h e r e c e p t o r

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77 R e f e r e n c e s F o r P a p e r I A r i k a w a H i r a s a w a E L e A H N i s h i n o I N o n a k a I H o N C F r a n c o m a n o C A G o v i n d r a j P H a s s e l l J R D e v a n e y J M S p r a n g e r J e t a l ( 2 0 0 2 ) S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l m u t a t i o n s o f t h e p e r l e c a n g e n e c a u s e S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e w i t h m y o t o n i c m y o p a t h y a n d c h o n d r o d y s p l a s i a A m J H u m G e n e t 7 0 1 3 6 8 1 3 7 5 A r i k a w a H i r a s a w a E W a t a n a b e H T a k a m i H H a s s e l l J R a n d Y a m a d a Y ( 1 9 9 9 ) P e r l e c a n i s e s s e n t i a l f o r c a r t i l a g e a n d c e p h a l i c d e v e l o p m e n t N a t G e n e t 2 3 3 5 4 3 5 8 A r i k a w a H i r a s a w a E W i l c o x W R L e A H S i l v e r m a n N G o v i n d r a j P H a s s e l l J R a n d Y a m a d a Y ( 2 0 0 1 ) D y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e i s c a u s e d b y f u n c t i o n a l n u l l m u t a t i o n s o f t h e p e r l e c a n g e n e N a t G e n e t 2 7 4 3 1 4 3 4 A v i e z e r D H e c h t D S a f r a n M E i s i n g e r M D a v i d G a n d Y a y o n A ( 1 9 9 4 ) P e r l e c a n b a s a l l a m i n a p r o t e o g l y c a n p r o m o t e s b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r b i n d i n g m i t o g e n e s i s a n d a n g i o g e n e s i s C e l l 7 9 1 0 0 5 1 0 1 3 C h e l l a i a h A Y u a n W C h e l l a i a h M a n d O r n i t z D M ( 1 9 9 9 ) M a p p i n g l i g a n d b i n d i n g d o m a i n s i n c h i m e r i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r m o l e c u l e s M u l t i p l e r e g i o n s d e t e r m i n e l i g a n d b i n d i n g s p e c i f i c i t y J B i o l C h e m 2 7 4 3 4 7 8 5 3 4 7 9 4 C h i n t a l a S K M i l l e r R R a n d M c D e v i t t C A ( 1 9 9 4 ) B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r b i n d s t o h e p a r a n s u l f a t e i n t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x o f r a t g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s A r c h B i o c h e m B i o p h y s 3 1 0 1 8 0 1 8 6 C h i n t a l a S K M i l l e r R R a n d M c D e v i t t C A ( 1 9 9 5 ) R o l e o f h e p a r a n s u l f a t e i n t h e t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s A r c h B i o c h e m B i o p h y s 3 1 6 2 2 7 2 3 4 C o f f i n J D F l o r k i e w i c z R Z N e u m a n n J M o r t H o p k i n s T D o r n G W 2 n d L i g h t f o o t P G e r m a n R H o w l e s P N K i e r A O T o o l e B A a n d e t a l ( 1 9 9 5 ) A b n o r m a l b o n e g r o w t h a n d s e l e c t i v e t r a n s l a t i o n a l r e g u l a t i o n i n b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F 2 ) t r a n s g e n i c m i c e M o l B i o l C e l l 6 1 8 6 1 1 8 7 3 C o l v i n J S B o h n e B A H a r d i n g G W M c E w e n D G a n d O r n i t z D M ( 1 9 9 6 ) S k e l e t a l o v e r g r o w t h a n d d e a f n e s s i n m i c e l a c k i n g f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 N a t G e n e t 1 2 3 9 0 3 9 7

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78 C o s t e l l M G u s t a f s s o n E A s z o d i A M o r g e l i n M B l o c h W H u n z i k e r E A d d i c k s K T i m p l R a n d F a s s l e r R ( 1 9 9 9 ) P e r l e c a n m a i n t a i n s t h e i n t e g r i t y o f c a r t i l a g e a n d s o m e b a s e m e n t m e m b r a n e s J C e l l B i o l 1 4 7 1 1 0 9 1 1 2 2 C o s t e l l M M a n n K Y a m a d a Y a n d T i m p l R ( 1 9 9 7 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f r e c o m b i n a n t p e r l e c a n d o m a i n I a n d i t s s u b s t i t u t i o n b y g l y c o s a m i n o g l y c a n s a n d o l i g o s a c c h a r i d e s E u r J B i o c h e m 2 4 3 1 1 5 1 2 1 D e g u c h i Y O k u t s u H O k u r a T Y a m a d a S K i m u r a R Y u g e T F u r u k a w a A M o r i m o t o K T a c h i k a w a M O h t s u k i S e t a l ( 2 0 0 2 ) I n t e r n a l i z a t i o n o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r a t t h e m o u s e b l o o d b r a i n b a r r i e r i n v o l v e s p e r l e c a n a h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n J N e u r o c h e m 8 3 3 8 1 3 8 9 D o l a n M H o r c h a r T R i g a t t i B a n d H a s s e l l J R ( 1 9 9 7 ) I d e n t i f i c a t i o n o f s i t e s i n d o m a i n I o f p e r l e c a n t h a t r e g u l a t e h e p a r a n s u l f a t e s y n t h e s i s J B i o l C h e m 2 7 2 4 3 1 6 4 3 2 2 D o n o R T e x i d o G D u s s e l R E h m k e H a n d Z e l l e r R ( 1 9 9 8 ) I m p a i r e d c e r e b r a l c o r t e x d e v e l o p m e n t a n d b l o o d p r e s s u r e r e g u l a t i o n i n F G F 2 d e f i c i e n t m i c e E m b o J 1 7 4 2 1 3 4 2 2 5 F a r n d a l e R W B u t t l e D J a n d B a r r e t t A J ( 1 9 8 6 ) I m p r o v e d q u a n t i t a t i o n a n d d i s c r i m i n a t i o n o f s u l p h a t e d g l y c o s a m i n o g l y c a n s b y u s e o f d i m e t h y l m e t h y l e n e b l u e B i o c h i m B i o p h y s A c t a 8 8 3 1 7 3 1 7 7 F o r s t e n K E W a n g N R o b i n s o n R M a n d N u g e n t M A ( 2 0 0 0 ) A s i m p l e a s s a y f o r e v a l u a t i n g i n h i b i t o r s o f p r o t e o g l y c a n l i g a n d b i n d i n g A n n B i o m e d E n g 2 8 1 1 9 1 2 7 F r e n c h M M S m i t h S E A k a n b i K S a n f o r d T H e c h t J F a r a c h C a r s o n M C a n d C a r s o n D D ( 1 9 9 9 ) E x p r e s s i o n o f t h e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n p e r l e c a n d u r i n g m o u s e e m b r y o g e n e s i s a n d p e r l e c a n c h o n d r o g e n i c a c t i v i t y i n v i t r o J C e l l B i o l 1 4 5 1 1 0 3 1 1 1 5 F r i e d r i c h M V G o h r i n g W M o r g e l i n M B r a n c a c c i o A D a v i d G a n d T i m p l R ( 1 9 9 9 ) S t r u c t u r a l b a s i s o f g l y c o s a m i n o g l y c a n m o d i f i c a t i o n a n d o f h e t e r o t y p i c i n t e r a c t i o n s o f p e r l e c a n d o m a i n V J M o l B i o l 2 9 4 2 5 9 2 7 0 G o s p o d a r o w i c z D F e r r a r a N S c h w e i g e r e r L a n d N e u f e l d G ( 1 9 8 7 a ) S t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n a n d b i o l o g i c a l f u n c t i o n s o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r E n d o c r R e v 8 9 5 1 1 4

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79 G o s p o d a r o w i c z D N e u f e l d G a n d S c h w e i g e r e r L ( 1 9 8 7 b ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r : s t r u c t u r a l a n d b i o l o g i c a l p r o p e r t i e s J C e l l P h y s i o l S u p p l S u p p l 5 1 5 2 6 G o v i n d r a j P W e s t L K o o b T J N e a m e P D o e g e K a n d H a s s e l l J R ( 2 0 0 2 ) I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e m a j o r h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s i n t h e d e v e l o p i n g b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e J B i o l C h e m 2 7 7 1 9 4 6 1 1 9 4 6 9 G o v i n d r a j P W e s t L S m i t h S a n d H a s s e l l J R ( 2 0 0 6 ) M o d u l a t i o n o f F G F 2 b i n d i n g t o c h o n d r o c y t e s f r o m t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e b y p e r l e c a n M a t r i x B i o l 2 5 2 3 2 2 3 9 H a n d l e r M Y u r c h e n c o P D a n d I o z z o R V ( 1 9 9 7 ) D e v e l o p m e n t a l e x p r e s s i o n o f p e r l e c a n d u r i n g m u r i n e e m b r y o g e n e s i s D e v D y n 2 1 0 1 3 0 1 4 5 H a s s e l l J R R o b e y P G B a r r a c h H J W i l c z e k J R e n n a r d S I a n d M a r t i n G R ( 1 9 8 0 ) I s o l a t i o n o f a h e p a r a n s u l f a t e c o n t a i n i n g p r o t e o g l y c a n f r o m b a s e m e n t m e m b r a n e P r o c N a t l A c a d S c i U S A 7 7 4 4 9 4 4 4 9 8 H i l l D J a n d L o g a n A ( 1 9 9 2 ) C e l l c y c l e d e p e n d e n t l o c a l i z a t i o n o f i m m u n o r e a c t i v e b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r t o c y t o p l a s m a n d n u c l e u s o f i s o l a t e d o v i n e f e t a l g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s G r o w t h F a c t o r s 7 2 1 5 2 3 1 I o z z o R V ( 1 9 9 4 ) P e r l e c a n : a g e m o f a p r o t e o g l y c a n M a t r i x B i o l 1 4 2 0 3 2 0 8 I o z z o R V ( 2 0 0 5 ) B a s e m e n t m e m b r a n e p r o t e o g l y c a n s : f r o m c e l l a r t o c e i l i n g N a t R e v M o l C e l l B i o l 6 6 4 6 6 5 6 I o z z o R V a n d W i g h t T N ( 1 9 8 2 ) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o t e o g l y c a n s s y n t h e s i z e d b y h u m a n c o l o n a n d c o l o n c a r c i n o m a J B i o l C h e m 2 5 7 1 1 1 3 5 1 1 1 4 4 K n o x S M e r r y C S t r i n g e r S M e l r o s e J a n d W h i t e l o c k J ( 2 0 0 2 ) N o t a l l p e r l e c a n s a r e c r e a t e d e q u a l : i n t e r a c t i o n s w i t h f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) 2 a n d F G F r e c e p t o r s J B i o l C h e m 2 7 7 1 4 6 5 7 1 4 6 6 5 K v i s t A J J o h n s o n A E M o r g e l i n M G u s t a f s s o n E B e n g t s s o n E L i n d b l o m K A s z o d i A F a s s l e r R S a s a k i T T i m p l R a n d A s p b e r g A ( 2 0 0 6 ) C h o n d r o i t i n s u l f a t e p e r l e c a n e n h a n c e s c o l l a g e n f i b r i l f o r m a t i o n i m p l i c a t i o n s f o r p e r l e c a n c h o n d r o d y s p l a s i a s J B i o l C h e m

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80 L e d b e t t e r S R F i s h e r L W a n d H a s s e l l J R ( 1 9 8 7 ) D o m a i n s t r u c t u r e o f t h e b a s e m e n t m e m b r a n e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n B i o c h e m i s t r y 2 6 9 8 8 9 9 5 L u a n Y P r a u l C A G a y C V a n d L e a c h R M J r ( 1 9 9 6 ) B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r : a n a u t o c r i n e g r o w t h f a c t o r f o r e p i p h y s e a l g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s J C e l l B i o c h e m 6 2 3 7 2 3 8 2 M a s c a r e l l i F a n d C o u r t o i s Y ( 1 9 9 3 ) [ H e t e r o c o m p l e x f o r m a t i o n b e t w e e n h i g h a n d l o w a f f i n i t y F G F r e c e p t o r s i s m e d i a t e d b y t h e f o r m a t i o n o f a F G F d i m e r ] B u l l C a n c e r 8 0 7 8 6 7 9 8 M o n g i a t M T a y l o r K O t t o J A h o S U i t t o J W h i t e l o c k J M a n d I o z z o R V ( 2 0 0 0 ) T h e p r o t e i n c o r e o f t h e p r o t e o g l y c a n p e r l e c a n b i n d s s p e c i f i c a l l y t o f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 7 J B i o l C h e m 2 7 5 7 0 9 5 7 1 0 0 M o n t e r o A O k a d a Y T o m i t a M I t o M T s u r u k a m i H N a k a m u r a T D o e t s c h m a n T C o f f i n J D a n d H u r l e y M M ( 2 0 0 0 ) D i s r u p t i o n o f t h e f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 g e n e r e s u l t s i n d e c r e a s e d b o n e m a s s a n d b o n e f o r m a t i o n J C l i n I n v e s t 1 0 5 1 0 8 5 1 0 9 3 M u e n k e M a n d S c h e l l U ( 1 9 9 5 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r m u t a t i o n s i n h u m a n s k e l e t a l d i s o r d e r s T r e n d s G e n e t 1 1 3 0 8 3 1 3 M u r d o c h A D D o d g e G R C o h e n I T u a n R S a n d I o z z o R V ( 1 9 9 2 ) P r i m a r y s t r u c t u r e o f t h e h u m a n h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n f r o m b a s e m e n t m e m b r a n e ( H S P G 2 / p e r l e c a n ) A c h i m e r i c m o l e c u l e w i t h m u l t i p l e d o m a i n s h o m o l o g o u s t o t h e l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n r e c e p t o r l a m i n i n n e u r a l c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e s a n d e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r J B i o l C h e m 2 6 7 8 5 4 4 8 5 5 7 N a g a i H T s u k u d a R a n d M a y a h a r a H ( 1 9 9 5 ) E f f e c t s o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( b F G F ) o n b o n e f o r m a t i o n i n g r o w i n g r a t s B o n e 1 6 3 6 7 3 7 3 N i c o l e S D a v o i n e C S T o p a l o g l u H C a t t o l i c o L B a r r a l D B e i g h t o n P H a m i d a C B H a m m o u d a H C r u a u d C W h i t e P S e t a l ( 2 0 0 0 ) P e r l e c a n t h e m a j o r p r o t e o g l y c a n o f b a s e m e n t m e m b r a n e s i s a l t e r e d i n p a t i e n t s w i t h S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e ( c h o n d r o d y s t r o p h i c m y o t o n i a ) N a t G e n e t 2 6 4 8 0 4 8 3

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81 N o o n a n D M F u l l e A V a l e n t e P C a i S H o r i g a n E S a s a k i M Y a m a d a Y a n d H a s s e l l J R ( 1 9 9 1 ) T h e c o m p l e t e s e q u e n c e o f p e r l e c a n a b a s e m e n t m e m b r a n e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n r e v e a l s e x t e n s i v e s i m i l a r i t y w i t h l a m i n i n A c h a i n l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n r e c e p t o r a n d t h e n e u r a l c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e J B i o l C h e m 2 6 6 2 2 9 3 9 2 2 9 4 7 N u g e n t M A N u g e n t H M I o z z o R V S a n c h a c k K a n d E d e l m a n E R ( 2 0 0 0 ) P e r l e c a n i s r e q u i r e d t o i n h i b i t t h r o m b o s i s a f t e r d e e p v a s c u l a r i n j u r y a n d c o n t r i b u t e s t o e n d o t h e l i a l c e l l m e d i a t e d i n h i b i t i o n o f i n t i m a l h y p e r p l a s i a P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 7 6 7 2 2 6 7 2 7 O l s e n B R ( 1 9 9 9 ) L i f e w i t h o u t p e r l e c a n h a s i t s p r o b l e m s J C e l l B i o l 1 4 7 9 0 9 9 1 2 O r n i t z D M a n d I t o h N ( 2 0 0 1 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r s G e n o m e B i o l 2 R E V I E W S 3 0 0 5 O r n i t z D M a n d L e d e r P ( 1 9 9 2 ) L i g a n d s p e c i f i c i t y a n d h e p a r i n d e p e n d e n c e o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r s 1 a n d 3 J B i o l C h e m 2 6 7 1 6 3 0 5 1 6 3 1 1 O r n i t z D M a n d M a r i e P J ( 2 0 0 2 ) F G F s i g n a l i n g p a t h w a y s i n e n d o c h o n d r a l a n d i n t r a m e m b r a n o u s b o n e d e v e l o p m e n t a n d h u m a n g e n e t i c d i s e a s e G e n e s D e v 1 6 1 4 4 6 1 4 6 5 O r n i t z D M Y a y o n A F l a n a g a n J G S v a h n C M L e v i E a n d L e d e r P ( 1 9 9 2 ) H e p a r i n i s r e q u i r e d f o r c e l l f r e e b i n d i n g o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r t o a s o l u b l e r e c e p t o r a n d f o r m i t o g e n e s i s i n w h o l e c e l l s M o l C e l l B i o l 1 2 2 4 0 2 4 7 O r t e g a S I t t m a n n M T s a n g S H E h r l i c h M a n d B a s i l i c o C ( 1 9 9 8 ) N e u r o n a l d e f e c t s a n d d e l a y e d w o u n d h e a l i n g i n m i c e l a c k i n g f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 5 5 6 7 2 5 6 7 7 P o w e l l A K Y a t e s E A F e r n i g D G a n d T u r n b u l l J E ( 2 0 0 4 ) I n t e r a c t i o n s o f h e p a r i n / h e p a r a n s u l f a t e w i t h p r o t e i n s : a p p r a i s a l o f s t r u c t u r a l f a c t o r s a n d e x p e r i m e n t a l a p p r o a c h e s G l y c o b i o l o g y 1 4 1 7 R 3 0 R S a s a k i T C o s t e l l M M a n n K a n d T i m p l R ( 1 9 9 8 ) I n h i b i t i o n o f g l y c o s a m i n o g l y c a n m o d i f i c a t i o n o f p e r l e c a n d o m a i n I b y s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s c h a n g e s p r o t e a s e s e n s i t i v i t y a n d l a m i n i n 1 b i n d i n g a c t i v i t y F E B S L e t t 4 3 5 1 6 9 1 7 2

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82 S h i a n g R T h o m p s o n L M Z h u Y Z C h u r c h D M F i e l d e r T J B o c i a n M W i n o k u r S T a n d W a s m u t h J J ( 1 9 9 4 ) M u t a t i o n s i n t h e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f F G F R 3 c a u s e t h e m o s t c o m m o n g e n e t i c f o r m o f d w a r f i s m a c h o n d r o p l a s i a C e l l 7 8 3 3 5 3 4 2 S u n d a r R a j N F i t e D L e d b e t t e r S C h a k r a v a r t i S a n d H a s s e l l J R ( 1 9 9 5 ) P e r l e c a n i s a c o m p o n e n t o f c a r t i l a g e m a t r i x a n d p r o m o t e s c h o n d r o c y t e a t t a c h m e n t J C e l l S c i 1 0 8 ( P t 7 ) 2 6 6 3 2 6 7 2 T a p a n a d e c h o p o n e P H a s s e l l J R R i g a t t i B a n d C o u c h m a n J R ( 1 9 9 9 ) L o c a l i z a t i o n o f g l y c o s a m i n o g l y c a n s u b s t i t u t i o n s i t e s o n d o m a i n V o f m o u s e p e r l e c a n B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n 2 6 5 6 8 0 6 9 0 T r i p p e l S B W r o b l e w s k i J M a k o w e r A M W h e l a n M C S c h o e n f e l d D a n d D o c t r o w S R ( 1 9 9 3 ) R e g u l a t i o n o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s b y i n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o r I a n d b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r J B o n e J o i n t S u r g A m 7 5 1 7 7 1 8 9 W a n g Q G r e e n R P Z h a o G a n d O r n i t z D M ( 2 0 0 1 ) D i f f e r e n t i a l r e g u l a t i o n o f e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h a n d j o i n t d e v e l o p m e n t b y F G F R 1 a n d F G F R 3 t y r o s i n e k i n a s e d o m a i n s D e v e l o p m e n t 1 2 8 3 8 6 7 3 8 7 6 W e s t L G o v i n d r a j P K o o b T J a n d H a s s e l l J R ( 2 0 0 6 ) C h a n g e s i n p e r l e c a n d u r i n g c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n i n t h e f e t a l b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e J O r t h o p R e s 2 4 1 3 1 7 1 3 2 6 W h i t e K E C a b r a l J M D a v i s S I F i s h b u r n T E v a n s W E I c h i k a w a S F i e l d s J Y u X S h a w N J M c L e l l a n N J e t a l ( 2 0 0 5 ) M u t a t i o n s t h a t c a u s e o s t e o g l o p h o n i c d y s p l a s i a d e f i n e n o v e l r o l e s f o r F G F R 1 i n b o n e e l o n g a t i o n A m J H u m G e n e t 7 6 3 6 1 3 6 7 W h i t e l o c k J M M u r d o c h A D I o z z o R V a n d U n d e r w o o d P A ( 1 9 9 6 ) T h e d e g r a d a t i o n o f h u m a n e n d o t h e l i a l c e l l d e r i v e d p e r l e c a n a n d r e l e a s e o f b o u n d b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r b y s t r o m e l y s i n c o l l a g e n a s e p l a s m i n a n d h e p a r a n a s e s J B i o l C h e m 2 7 1 1 0 0 7 9 1 0 0 8 6 Z h o u M S u t l i f f R L P a u l R J L o r e n z J N H o y i n g J B H a u d e n s c h i l d C C Y i n M C o f f i n J D K o n g L K r a n i a s E G e t a l ( 1 9 9 8 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 c o n t r o l o f v a s c u l a r t o n e N a t M e d 4 2 0 1 2 0 7

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83 P a p e r I I F i b r o b l a s t G r o w t h F a c t o r 1 8 B i n d s t o D o m a i n I I I o f G r o w t h P l a t e P e r l e c a n S i m o n e M L S m i t h L e i g h A W e s t 1 a n d J o h n R H a s s e l l D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r M e d i c i n e U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a C o l l e g e o f M e d i c i n e T a m p a F L 1 C u r r e n t l y a t D e p a r t m e n t o f C h e m i c a l E n g i n e e r i n g C o l l e g e o f E n g i n e e r i n g U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a T a m p a F L R u n n i n g t i t l e : F G F 1 8 b i n d s t o p e r l e c a n A d d r e s s c o r r e s p o n d e n c e t o : J o h n R H a s s e l l P h D D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r M e d i c i n e U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a C o l l e g e o f M e d i c i n e T a m p a F L P h o n e : 8 1 3 9 7 4 7 8 8 1 E m a i l : j h a s s e l l @ h e a l t h u s f e d u T h e a b b r e v i a t i o n s u s e d a r e : C A F c a t i o n i c f i l t r a t i o n ; C S c h o n d r o i t i n s u l f a t e ; D D S H S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e d y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a ; D M E M D u l b e c c o s m o d i f i e d E a g l e s m e d i u m ; D M M B d i m e t h y l m e t h y l e n e b l u e ; F G F f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ; F G F R f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r ; G A G g l y c o s a m i n o g l y c a n ; H S h e p a r a n s u l f a t e ; S J S S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e

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84 A b s t r a c t F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 1 8 ( F G F 1 8 ) r e g u l a t e s t h e g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n h y p e r t r o p h y a n d c a r t i l a g e v a s c u l a r i z a t i o n n e c e s s a r y f o r e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n T h e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n p e r l e c a n i s a l s o c r i t i c a l f o r g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n F G F 1 8 n u l l m i c e e x h i b i t s k e l e t a l d w a r f i s m s i m i l a r t o t h a t o f p e r l e c a n n u l l m i c e G r o w t h p l a t e p e r l e c a n c o n t a i n s c h o n d r o i t i n s u l f a t e ( C S ) a n d h e p a r a n s u l f a t e ( H S ) c h a i n s a n d F G F 1 8 i s k n o w n t o b i n d t o h e p a r i n a n d t o h e p a r a n s u l f a t e f r o m s o m e s o u r c e s W e u s e d c a t i o n i c f i l t r a t i o n a n d i m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y s t o i n v e s t i g a t e t h e b i n d i n g o f F G F 1 8 t o g r o w t h p l a t e p e r l e c a n O u r d a t a s h o w e d a s a t u r a b l e b i n d i n g w i t h a k d o f 1 4 4 n M N e a r s a t u r a t i o n ~ 1 0 3 m o l e c u l e s o f F G F 1 8 b o u n d p e r m o l e c u l e o f p e r l e c a n T h i s b i n d i n g w a s n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r e d b y c h o n d r o i t i n a s e n o r h e p a r i t i n a s e d i g e s t i o n o f p e r l e c a n i n d i c a t i n g t h a t p e r l e c a n G A G s a r e n o t i n v o l v e d i n F G F 1 8 b i n d i n g F G F 1 8 b o u n d e q u a l l y t o r e c o m b i n a n t d o m a i n s I I I I o f p e r l e c a n ( A l t 1 ) e x p r e s s e d i n C O S 7 c e l l s a n d t o f u l l l e n g t h p e r l e c a n p u r i f i e d f r o m t h e g r o w t h p l a t e A d d i t i o n a l l y F G F 1 8 b o u n d e q u a l l y t o r e c o m b i n a n t d o m a i n I I I o f p e r l e c a n t o A l t 1 a n d t o A l t 2 ( a v a r i a n t o f d o m a i n s I I I I w i t h n o h e p a r a n s u l f a t e ) T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t l o w a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s f o r F G F 1 8 a r e p r e s e n t i n d o m a i n I I I o f p e r l e c a n

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85 I n t r o d u c t i o n P e r l e c a n i s a l a r g e ( ~ 6 0 0 k D a ) h e p a r a n s u l f a t e c o n t a i n i n g p r o t e o g l y c a n p r e s e n t i n a l l m a m m a l i a n b a s e m e n t m e m b r a n e s ( H a s s e l l R o b e y e t a l 1 9 8 0 ; I o z z o 2 0 0 5 ) i n c a r t i l a g e ( S u n d a r R a j F i t e e t a l 1 9 9 5 ; H a n d l e r Y u r c h e n c o e t a l 1 9 9 7 ) a n d i n t h e g r o w t h p l a t e ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) P e r l e c a n i s e s s e n t i a l f o r l o n g b o n e g r o w t h T h e a b s e n c e o f p e r l e c a n i n m i c e r e s u l t s i n d e f e c t i v e e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n ( t h e p r o c e s s b y w h i c h l o n g b o n e s g r o w ) d u r i n g e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t ( A r i k a w a H i r a s a w a W a t a n a b e e t a l 1 9 9 9 ; C o s t e l l G u s t a f s s o n e t a l 1 9 9 9 ) T h e c h o n d r o c y t e s i n t h e g r o w t h p l a t e o f p e r l e c a n n u l l m i c e e x h i b i t d e c r e a s e d p r o l i f e r a t i o n a n d m a t r i x d e p o s i t i o n w h i c h l e a d s t o s e v e r e f e t a l d w a r f i s m S i l v e r m a n H a n d m a k e r d y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a ( D D S H ) w h i c h r e s u l t s f r o m a f u n c t i o n a l n u l l m u t a t i o n o f t h e p e r l e c a n g e n e ( A r i k a w a H i r a s a w a W i l c o x e t a l 2 0 0 1 ; A r i k a w a H i r a s a w a a n d Y a m a d a 2 0 0 1 ) i s a n a n a l o g o u s d i s o r d e r i n h u m a n s S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e ( S J S ) i n h u m a n s i s t h o u g h t t o r e s u l t f r o m p r o d u c t i o n o f t r u n c a t e d ( o r r e d u c e d l e v e l s o f f u l l l e n g t h ) p e r l e c a n ( N i c o l e D a v o i n e e t a l 2 0 0 0 ) w i t h p a t i e n t s s h o w i n g v a r y i n g d e g r e e s o f d w a r f i s m a n d s k e l e t a l a b n o r m a l i t i e s t h a t m i r r o r t h o s e o f D D S H p a t i e n t s b u t a r e l e s s s e v e r e F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 ( F G F R 3 ) i s a c e l l s u r f a c e r e c e p t o r e x p r e s s e d i n d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e ( W a n g G r e e n e t a l 2 0 0 1 ) G a i n o f f u n c t i o n m u t a t i o n s i n t h e h u m a n F G F R 3 g e n e c a u s e d w a r f i s m s s u c h a s a c h o n d r o p l a s i a ( S h i a n g T h o m p s o n e t a l 1 9 9 4 ) t h a n a t o p h o r i c d y s p l a s i a ( T a v o r m i n a R i m o i n e t a l 1 9 9 5 ) a n d h y p o c h o n d r o p l a s i a ( W i n t e r p a c h t H i l b e r t e t a l 2 0 0 0 ) A c t i v a t i n g m u t a t i o n s i n m u r i n e F G F R 3 a l s o c a u s e d w a r f i s m ( N a s k i C o l v i n e t a l 1 9 9 8 ; W a n g S p a t z e t a l 1 9 9 9 ; I w a t a C h e n e t a l

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86 2 0 0 0 ) W h e n F G F R 3 e x p r e s s i o n i n t h e g r o w t h p l a t e o f m i c e i s l o s t t h e r e i s i n c r e a s e d c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d h y p e r t r o p h y r e s u l t i n g i n o v e r g r o w t h o f l o n g b o n e s ( C o l v i n B o h n e e t a l 1 9 9 6 ; D e n g W y n s h a w B o r i s e t a l 1 9 9 6 ) T h i s i n d i c a t e s t h a t F G F R 3 i s a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r s ( F G F s ) a r e t h e e n d o g e n o u s l i g a n d s f o r F G F R s F G F s 2 9 a n d 1 8 h a v e b e e n s h o w n t o i n f l u e n c e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n i n t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e a n d s u b s e q u e n t l y i n f l u e n c e l o n g b o n e g r o w t h T h e F G F 2 k n o c k o u t m o u s e h a s n o s e v e r e d e f e c t i n b o n e l e n g t h ( M o n t e r o O k a d a e t a l 2 0 0 0 ) w h e r e a s o v e r e x p r e s s i o n o f F G F 2 i n t h e F G F 2 t r a n s g e n i c m o u s e r e s u l t s i n s h o r t l i m b s i n d i c a t i n g t h a t F G F 2 c a n a c t t h r o u g h F G F R 3 ( C o f f i n F l o r k i e w i c z e t a l 1 9 9 5 ; M a n c i l l a D e L u c a e t a l 1 9 9 8 ) B o t h t h e F G F 9 t r a n s g e n i c m o u s e a n d t h e F G F 1 8 k n o c k o u t m o u s e s h o w s e v e r e a b n o r m a l i t i e s i n l o n g b o n e g r o w t h ( G a r o f a l o K l i g e r S p a t z e t a l 1 9 9 9 ; L i u X u e t a l 2 0 0 2 ; O h b a y a s h i S h i b a y a m a e t a l 2 0 0 2 ) b u t i t i s t h e F G F 1 8 n u l l m o u s e t h a t e x h i b i t s a g r o w t h p l a t e p h e n o t y p e s i m i l a r t o t h a t o f t h e F G F R 3 n u l l m o u s e ( i n t h e i n c r e a s e a l t h o u g h t r a n s i e n t i n c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d i n e n l a r g e d g r o w t h p l a t e s ( L i u X u e t a l 2 0 0 2 ; O h b a y a s h i S h i b a y a m a e t a l 2 0 0 2 ) ) F G F 1 8 h a s a t h r e e t i e r e d i m p o r t a n c e i n l o n g b o n e g r o w t h a f f e c t i n g c h o n d r o g e n e s i s b y s i g n a l i n g t h r o u g h F G F R 3 ( D a v i d s o n B l a n c e t a l 2 0 0 5 ) o s t e o g e n e s i s b y s i g n a l i n g t h r o u g h F G F R 1 a n d / o r F G F R 2 ( L i u X u e t a l 2 0 0 2 ; O h b a y a s h i S h i b a y a m a e t a l 2 0 0 2 ) a n d g r o w t h p l a t e v a s c u l a r i z a t i o n b y r e g u l a t i n g v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ( V E G F ) ( L i u L a v i n e e t a l 2 0 0 6 ) F G F 1 8 i s m a d e b y t h e d e v e l o p i n g p e r i c h o n d r i u m t h e r e g i o n o f c o n n e c t i v e t i s s u e t h a t s u r r o u n d s t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e ( L i u X u e t a l 2 0 0 2 ; O h b a y a s h i S h i b a y a m a e t a l 2 0 0 2 )

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87 A l l F G F s b i n d t o h e p a r i n ( A s h i k a r i H a d a H a b u c h i e t a l 2 0 0 4 ) a n d h e p a r i n h a s b e e n s h o w n t o e n h a n c e t h e b i n d i n g o f F G F s t o F G F R s ( O r n i t z a n d L e d e r 1 9 9 2 ) H e p a r a n s u l f a t e ( H S ) a s t r u c t u r a l a n a l o g u e o f h e p a r i n i s p r e s e n t o n g r o w t h p l a t e p e r l e c a n a t b o t h e n d s ( d o m a i n s I a n d V ) o f t h e c o r e p r o t e i n ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ; T a p a n a d e c h o p o n e H a s s e l l e t a l 1 9 9 9 ) W e h a v e s h o w n t h a t p e r l e c a n b i n d s F G F 2 v i a t h e s e H S c h a i n s a n d c a n m e d i a t e t h e d e l i v e r y o f F G F 2 t o F G F R 1 a n d F G F R 3 ( S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) F G F 1 8 i s k n o w n t o b i n d p r e f e r e n t i a l l y t o 2 O s u l f a t e d H S ( A s h i k a r i H a d a H a b u c h i e t a l 2 0 0 4 ) T h e H S o n g r o w t h p l a t e p e r l e c a n i s 2 O a n d 6 O s u l f a t e d ( W e s t G o v i n d r a j e t a l 2 0 0 6 ) s o i n a d d i t i o n t o b i n d i n g F G F 2 t h e H S o n p e r l e c a n m i g h t a l s o b i n d F G F 1 8 N o t a l l H S h o w e v e r h a s t h e s e q u e n c e o r s u l f a t i o n p a t t e r n n e c e s s a r y t o b i n d t o F G F 1 8 ( K n o x M e r r y e t a l 2 0 0 2 ) I n t h i s s t u d y w e t e s t F G F 1 8 a s a p o t e n t i a l b i n d i n g p a r t n e r o f g r o w t h p l a t e p e r l e c a n E x p e r i m e n t a l P r o c e d u r e s S o u r c e s o f p e r l e c a n D N A p e r l e c a n p r o t e i n g r o w t h f a c t o r s a n d a n t i b o d i e s c D N A c o n s t r u c t s e n c o d i n g f o r p e r l e c a n d o m a i n I I I I a n d f o r d o m a i n I I I w e r e o b t a i n e d f r o m p r e v i o u s w o r k ( C h a k r a v a r t i H o r c h a r e t a l 1 9 9 5 ; D o l a n H o r c h a r e t a l 1 9 9 7 ) L a r g e s c a l e p l a s m i d p r e p s w e r e p r e p a r e d u s i n g t h e E n d o f r e e P l a s m i d M a x i K i t ( Q I A G E N ) a n d c o n s t r u c t s w e r e v e r i f i e d u s i n g r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s R e c o m b i n a n t h u m a n f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 1 8 ( F G F 1 8 ) w a s p u r c h a s e d f r o m P e p r o T e c h P u r i f i e d b o v i n e g r o w t h p l a t e p e r l e c a n

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88 ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) a n d a n t i m o u s e p e r l e c a n a n t i b o d y A b 3 7 8 ( W e s t G o v i n d r a j e t a l 2 0 0 6 ) w e r e p r e p a r e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d T r a n s f e c t i o n H i g h g l u c o s e ( 4 5 g / L ) D M E M ( F i s h e r S c i e n t i f i c ) w a s s u p p l e m e n t e d t o 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m 1 % a n t i b i o t i c s ( p e n i c i l l i n s t r e p t o m y c i n ) a n d 2 % g l u t a m i n e a n d u s e d a s o u r g r o w t h m e d i u m t o c u l t u r e C O S 7 c e l l s i n 1 0 0 m m c e l l c u l t u r e d i s h e s ( F i s h e r S c i e n t i f i c ) L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 ( L 2 0 0 0 I n v i t r o g e n ) w a s u s e d t o t r a n s f e c t c o n f l u e n t C O S 7 c e l l s a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r s d i r e c t i o n s B r i e f l y t h e c e l l s w e r e r i n s e d w i t h s e r u m a n d a n t i b i o t i c f r e e g r o w t h m e d i u m ( o u r t r a n s f e c t i o n m e d i u m ) F o r t h e c o n s t r u c t s A l t 1 ( d o m a i n s I I I I ) a n d A l t 2 ( d o m a i n s I I I I m a d e w i t h o u t h e p a r a n s u l f a t e ) c e l l s w e r e t r a n s f e c t e d w i t h 1 2 g o f D N A u s i n g 4 5 l o f L 2 0 0 0 i n 1 5 m l o f t r a n s f e c t i o n m e d i u m F o r t h e d o m a i n I I I c o n s t r u c t c e l l s w e r e t r a n s f e c t e d w i t h 1 8 g o f D N A u s i n g 4 5 l o f L 2 0 0 0 T h e c e l l s w e r e c u l t u r e d a t 3 7 C / 5 % C O 2 f o r 5 h t h e n c h a n g e d t o g r o w t h m e d i u m f o r a n o t h e r 1 6 1 8 h T h e t r a n s f e c t e d c e l l s w e r e t h e n f u r t h e r c u l t u r e d i n 1 5 m l o f f r e s h t r a n s f e c t i o n m e d i u m a n d h a r v e s t e d a f t e r 4 8 h P u r i f y i n g R e c o m b i n a n t P r o d u c t s T h e 4 8 h m e d i a f r o m t r a n s f e c t e d C O S 7 c e l l s w e r e r e c o n s t i t u t e d t o 4 M g u a n i d i n e H C l b y t h e a d d i t i o n o f 0 5 g o f g u a n i d i n e H C l / m l o f m e d i a T h e m e d i a w e r e t h e n s p i n c o n c e n t r a t e d t o l e s s t h a n 2 m l a n d f r a c t i o n a t e d o n 4 M g u a n i d i n e H C l e q u i l i b r a t e d S u p e r o s e 6 c o l u m n s ( G E H e a l t h c a r e ) F o r t y 3 m l f r a c t i o n s ( 1 2 c o l u m n v o l u m e s ) w e r e c o l l e c t e d t h e n 1 l o f e a c h f r a c t i o n w a s d o t t e d u n t o n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e ( B i o R a d ) a n d i m m u n o b l o t t e d f o r p e r l e c a n u s i n g A b 3 7 8

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89 P e r l e c a n p o s i t i v e f r a c t i o n s w e r e d i a l y z e d a g a i n s t d i s t i l l e d w a t e r a n d 1 8 l a l i q u o t s o f t h e f r a c t i o n s w e r e r u n o n S D S P A G E F r a c t i o n s f r o m t h e A l t 1 c o l u m n r u n w e r e d i g e s t e d w i t h 1 0 m U o f p r o t e a s e f r e e c h o n d r o i t i n a s e A B C a n d 5 m U e a c h o f h e p a r a t i n a s e s I a n d I I ( A s s o c i a t e s o f C a p e C o d ) b e f o r e S D S P A G E a s d e s c r i b e d b e l o w T h e D I I I a n d A l t 2 f r a c t i o n s w e r e l e f t u n d i g e s t e d s i n c e t h e s e r e c o m b i n a n t p r o d u c t s h a v e n o G A G s a t t a c h e d F r a c t i o n s d e t e r m i n e d b y W e s t e r n b l o t t o c o n t a i n t h e r e c o m b i n a n t p r o d u c t b u t n o n e o f t h e e n d o g e n o u s C O S 7 c e l l p e r l e c a n w e r e p o o l e d a n d t h e a m o u n t o f p e r l e c a n e s t i m a t e d b y d i r e c t c o m p a r i s o n s w i t h k n o w n a m o u n t s o f E H S p e r l e c a n i n t h e d i m e t h y l m e t h y l e n e b l u e ( D M M B ) a s s a y ( F a r n d a l e B u t t l e e t a l 1 9 8 6 ) a n d i n W e s t e r n b l o t s G l y c o s i d a s e D i g e s t i o n o f P e r l e c a n G A G s W h e r e i n d i c a t e d i n t h e r e s u l t s p e r l e c a n w a s e i t h e r s h a m d i g e s t e d d i g e s t e d w i t h 1 0 m U o f c h o n d r o i t i n a s e A B C o r d i g e s t e d w i t h 5 m U e a c h o f h e p a r i t i n a s e s I a n d I I b e f o r e b e i n g u s e d i n t h e C A F o r t h e I P a s s a y s D i g e s t i o n s w e r e d o n e i n 1 0 0 l o f d i g e s t i o n b u f f e r ( 2 0 m M T r i s H C l 5 m M c a l c i u m c h l o r i d e a n d 0 2 m g / m l p r o t e a s e f r e e B S A p H 7 4 ) a t 3 7 C f o r 3 h R a d i o l a b e l l i n g o f g r o w t h f a c t o r S o d i u m 1 2 5 I o d i d e ( 0 5 m C i P e r k i n E l m e r ) a c t i v a t e d i n I O D O G E N c o a t e d t u b e s ( P i e r c e ) w a s u s e d t o r a d i o l a b e l 5 g o f F G F 1 8 u s i n g P i e r c e s s u p p l i e d p r o t o c o l ( C h i z z o n i t e i n d i r e c t m e t h o d ) a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d f o r F G F 2 ( S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) T h e i o d i n a t e d F G F 1 8 w a s p u r i f i e d b y c h r o m a t o g r a p h y o n H e p a r i n S e p h a r o s e 6 F a s t F l o w b e a d s ( G E H e a l t h c a r e ) a n d e l u t i o n w i t h 2 M N a C l T h e p u r i f i e d F G F 1 8 w a s d i a l y z e d a g a i n s t P B S a n d t h e

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90 s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e 1 2 5 I F G F 1 8 d e t e r m i n e d a s b e f o r e ( S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) C a t i o n i c F i l t r a t i o n A s s a y T h e b i n d i n g o f 1 2 5 I F G F 1 8 t o p e r l e c a n w a s d e t e r m i n e d u s i n g a c a t i o n i c f i l t r a t i o n ( C A F ) a s s a y a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( F o r s t e n W a n g e t a l 2 0 0 0 ; S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) T h e b i n d i n g b u f f e r w a s 0 0 5 M T r i s H C l 0 1 5 M N a C l a n d 2 m g / m l p r o t e a s e f r e e B S A p H 8 0 B r i e f l y i o d i n a t e d F G F 1 8 w a s i n c u b a t e d w i t h o r w i t h o u t p e r l e c a n i n b i n d i n g b u f f e r a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 h i n a f i n a l i n c u b a t i o n v o l u m e o f 2 0 0 l T h e m i x t u r e w a s t h e n f i l t e r e d t h r o u g h c a t i o n i c Z e t a P r o b e m e m b r a n e ( B i o R a d ) b y v a c u u m f i l t r a t i o n u s i n g a M i n i f o l d I 9 6 w e l l a p p a r a t u s ( S c h l e i c h e r a n d S c h u e l l K e e n e N H U S A ) T h e w e l l s w e r e r i n s e d t o r e m o v e u n b o u n d 1 2 5 I F G F 1 8 t h e m e m b r a n e w a s d r i e d a n d t h e w e l l s e x c i s e d a n d c o u n t e d i n a g a m m a c o u n t e r F o r t h e i n i t i a l d o s e r e s p o n s e C A F a s s a y a s a t u r a t i o n b i n d i n g c u r v e a n d a S c a t c h a r d p l o t o f t h e d a t a w e r e g e n e r a t e d u s i n g t h e S i g m a P l o t R e g r e s s i o n W i z a r d ( S i g m a P l o t 8 0 ) T o s t u d y t h e e f f e c t o f G A G s o n F G F 1 8 p e r l e c a n b i n d i n g p e r l e c a n ( f u l l l e n g t h o r A l t 1 ) w a s d i g e s t e d w i t h c h o n d r o i t i n a s e A B C o r h e p a r i t i n a s e s I a n d I I b e f o r e b e i n g u s e d i n t h e C A F a s s a y O n l y f u l l l e n g t h p e r l e c a n a n d r e c o m b i n a n t d o m a i n I I I I p r o d u c t A l t 1 w e r e u s e d i n t h e C A F a s s a y s i n c e t h e c a t i o n i c Z e t a P r o b e m e m b r a n e c a p t u r e s n e g a t i v e l y c h a r g e d m o l e c u l e s R e c o m b i n a n t p r o d u c t s m a d e w i t h o u t G A G c h a i n s ( t h e D o m a i n I I I a n d t h e A l t 2 p r o d u c t s ) c o u l d b e e v a l u a t e d f o r F G F 1 8 b i n d i n g o n l y b y a n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y I m m u n o p r e c i p i t a t i o n A s s a y T h e b i n d i n g o f F G F 1 8 t o p e r l e c a n w a s s t u d i e d u s i n g a n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a s s a y a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( K n o x

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91 M e r r y e t a l 2 0 0 2 ; S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) P u r i f i e d r e c o m b i n a n t p e r l e c a n w a s r e c o n s t i t u t e d t o 0 2 m l i n I P b u f f e r ( 1 % T r i t o n X 1 0 0 2 0 m M T r i s H C l 0 1 5 M N a C l p H 7 4 ) 1 2 5 I F G F 1 8 w a s a d d e d a n d t h e s a m p l e s w e r e i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 h w i t h m i x i n g F i v e m i c r o l i t e r s o f e i t h e r a n t i m o u s e p e r l e c a n a n t i b o d y A b 3 7 8 ( o r 5 l o f p r e i m m u n e r a b b i t s e r u m a s c o n t r o l ) w e r e a d d e d a n d t h e s a m p l e s i n c u b a t e d a t 4 C f o r 2 h A f t e r a d d i t i o n o f 2 0 l o f P r o t e i n G S e p h a r o s e b e a d s ( G E H e a l t h c a r e ) f o r 2 h a t 4 C t h e s a m p l e s w e r e c e n t r i f u g e d f o r 5 m i n a t 2 5 0 0 x g t h e b e a d s w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h I P b u f f e r a n d t h e r a d i o a c t i v i t y i n t h e p e l l e t s o r i n 2 M e l u a t e s m e a s u r e d i n a g a m m a c o u n t e r P e r l e c a n w a s a l s o e i t h e r s h a m d i g e s t e d o r d i g e s t e d w i t h p r o t e a s e f r e e c h o n d r o i t i n a s e A B C a n d h e p a r a t i n a s e s I a n d I I b e f o r e b e i n g u s e d i n t h e I P a s s a y D e n a t u r a t i o n a n d r e d u c t i o n / a l k y l a t i o n o f t h e p e r l e c a n c o r e p r o t e i n T o d e t e r m i n e i f F G F 1 8 : p e r l e c a n b i n d i n g w a s d e p e n d e n t o n c o r e p r o t e i n s t r u c t u r e w e u s e d F G F 1 8 i n a C A F a s s a y w i t h p u r i f i e d p e r l e c a n t h a t w a s e i t h e r u n t r e a t e d o r d e n a t u r e d w i t h 8 M u r e a o r b o t h d e n a t u r e d a n d r e d u c e d / a l k y l a t e d w i t h u r e a a n d 2 5 m M D T T ( G E H e a l t h c a r e ) / 5 0 m M I o d o c a e t a m i d e ( P i e r c e ) T h e p e r l e c a n w a s d i a l y z e d a g a i n s t d i s t i l l e d w a t e r a f t e r t r e a t m e n t a n d b e f o r e u s e i n t h e a s s a y S t a t i s t i c s A l l d a t a a r e e x p r e s s e d a s t h e m e a n o f f o u r r e p l i c a t e s + / s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n S t a t i s t i c a l c o m p a r i s o n s w e r e m a d e u s i n g S t u d e n t s t t e s t w h e r e a p p l i c a b l e P < 0 0 5 w a s c o n s i d e r e d s i g n i f i c a n t

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92 R e s u l t s B i n d i n g o f F G F 1 8 t o f u l l l e n g t h p e r l e c a n i n t h e C A F a s s a y 1 2 5 I F G F 1 8 ( 3 3 2 3 8 5 n g / m l ; 0 7 5 1 0 9 n M ) w a s i n c u b a t e d w i t h o r w i t h o u t 2 n g ( i n D M M B G A G c o n t e n t t h e r e f o r e 1 0 n g o f t o t a l p e r l e c a n ) / m l o f p e r l e c a n p u r i f i e d f r o m t h e g r o w t h p l a t e T h e s a m p l e s w e r e f i l t e r e d o v e r a c a t i o n i c m e m b r a n e a n d r a d i o l i g a n d b i n d i n g t o t h e m e m b r a n e w a s d e t e r m i n e d u s i n g a g a m m a c o u n t e r C o u n t s f r o m i n c u b a t i o n s w i t h o u t p e r l e c a n w e r e s u b t r a c t e d f r o m t h o s e w i t h p e r l e c a n a t e q u i v a l e n t F G F 1 8 c o n c e n t r a t i o n s t o d e t e r m i n e t h e s p e c i f i c b i n d i n g T h e n a n o m o l a r a m o u n t s o f F G F 1 8 c o r r e s p o n d i n g t o t h e b o u n d c o u n t s w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e l a b e l e d F G F 1 8 a n d a r e s h o w n ( F i g 1 3 ) T h e d a t a s h o w t h a t t h e b i n d i n g o f F G F 1 8 t o p e r l e c a n w a s s a t u r a b l e a b o v e 8 4 5 n M F G F 1 8 a d d e d w i t h a d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( k d ) o f 1 4 5 n M a s d e t e r m i n e d f r o m S i g m a P l o t S c a t c h a r d a n a l y s i s E f f e c t o f G l y c o s i d a s e T r e a t m e n t o f P e r l e c a n o n F G F 1 8 B i n d i n g i n t h e C A F a n d I P a s s a y s G r o w t h p l a t e p e r l e c a n c o n t a i n s b o t h C S a n d H S c h a i n s ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) P u r i f i e d g r o w t h p l a t e p e r l e c a n ( 1 0 n g G A G / m l ) w a s f i r s t s h a m d i g e s t e d o r d i g e s t e d w i t h c h o n d r o i t i n a s e A B C o r w i t h h e p a r i t i n a s e I a n d I I b e f o r e i n c u b a t i o n w i t h 1 2 5 I F G F 1 8 ( 8 0 n g / m l ) i n t h e C A F a s s a y C o n t r o l b i n d i n g ( n o p e r l e c a n ) w a s s u b t r a c t e d f r o m t o t a l b i n d i n g ( w i t h p e r l e c a n ) t o g i v e s p e c i f i c b i n d i n g s h o w n W e f o u n d t h a t n e i t h e r c h o n d r o i t i n a s e ( C ) n o r h e p a r i t i n a s e ( H ) t r e a t m e n t o f p e r l e c a n s i g n i f i c a n t l y a f f e c t e d t h e b i n d i n g o f p e r l e c a n t o F G F 1 8 i n c o m p a r i s o n t o s h a m d i g e s t e d

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93 p e r l e c a n ( s h a m F i g 1 4 ) W e a l s o u s e d t h e I P a s s a y t o d e t e r m i n e i f 1 2 5 I F G F 1 8 c o u l d b i n d t o p e r l e c a n w i t h o u t i n t a c t G A G c h a i n s p r e s e n t P u r i f i e d p e r l e c a n ( 3 0 n g G A G / m l ) w a s e i t h e r s h a m d i g e s t e d ( s h a m F i g 1 5 ) o r d i g e s t e d w i t h c h o n d r o i t i n a s e ( C ) o r h e p a r i t i n a s e s I a n d I I ( H ) o r a m i x t u r e o f b o t h ( C + H ) T h e p e r l e c a n w a s t h e n i n c u b a t e d w i t h 1 2 5 I F G F 1 8 ( 4 0 n g / m l ) a n d s e r u m ( p r e i m m u n e o r a n t i p e r l e c a n ) c a p t u r e d w i t h P r o t e i n G b e a d s a n d t h e F G F 1 8 b i n d i n g d e t e r m i n e d T h e r e w a s s i g n i f i c a n t l y m o r e b i n d i n g o f 1 2 5 I F G F 1 8 t o t h e b e a d s w i t h a n t i p e r l e c a n s e r u m t h a n w i t h p r e i m m u n e s e r u m T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e h o w e v e r w h e t h e r t h e p e r l e c a n u s e d h a d i t s G A G c h a i n s i n t a c t ( s h a m t r e a t m e n t ) o r h a d o n l y o n e t y p e o f G A G ( C o r H t r e a t m e n t ) o r h a d n o i n t a c t G A G s ( C + H t r e a t m e n t ) E f f e c t o f C o r e P r o t e i n D e n a t u r a t i o n a n d R e d u c t i o n / A l k y l a t i o n o n 1 2 5 I F G F 1 8 B i n d i n g T o d e t e r m i n e i f c o r e p r o t e i n s t r u c t u r e h a s a n e f f e c t o n F G F 1 8 : p e r l e c a n b i n d i n g w e u s e d 5 0 n g o f F G F 1 8 i n a C A F a s s a y w i t h 2 n g G A G o f p e r l e c a n t h a t w a s e i t h e r u n t r e a t e d o r d e n a t u r e d w i t h 8 M u r e a o r b o t h d e n a t u r e d a n d r e d u c e d / a l k y l a t e d w i t h u r e a a n d 5 0 m M D T T / 1 0 0 m M I o d o c a e t a m i d e T h e b i n d i n g o f F G F 1 8 t o p e r l e c a n w a s r e d u c e d b y m o r e t h a n 5 0 % w h e n t h e c o r e p r o t e i n w a s s t r u c t u r e w a s a l t e r e d b y r e d u c t i o n a n d a l k y l a t i o n ( F i g u r e 1 6 ) T h e d e c r e a s e w a s l e s s d r a s t i c b u t s t i l l s i g n i f i c a n t w h e n t h e c o r e p r o t e i n w a s d e n a t u r e d o n l y B i n d i n g o f 1 2 5 I F G F 1 8 t o f u l l l e n g t h p e r l e c a n a n d t o A l t 1 i n t h e C A F a s s a y F o r F i g 1 7 t h e b i n d i n g o f 1 2 5 I F G F 1 8 t o f u l l l e n g t h p e r l e c a n w a s c o m p a r e d t o t h a t o f A l t I a r e c o m b i n a n t p r o d u c t c o n t a i n i n g o n l y t h e

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94 N t e r m i n a l d o m a i n s I I I I o f p e r l e c a n ( D o l a n H o r c h a r e t a l 1 9 9 7 ) A t c o n c e n t r a t i o n s w e l l b e l o w s a t u r a t i o n ( a s d e t e r m i n e d i n F i g 1 3 ) 1 2 5 I F G F 1 8 ( 2 0 n g / m l i n F i g 1 7 A 1 6 0 n g / m l i n F i g 1 7 B ) w a s i n c u b a t e d w i t h f u l l l e n g t h p e r l e c a n o r r e c o m b i n a n t A l t 1 ( 1 0 n g G A G / m l ) B o t h p e r l e c a n p r o d u c t s h a d s i m i l a r b i n d i n g c a p a c i t y ( ~ 5 0 % ) f o r 1 2 5 I F G F 1 8 a t b o t h F G F 1 8 c o n c e n t r a t i o n s u s e d B i n d i n g o f 1 2 5 I F G F 1 8 t o p e r l e c a n d o m a i n s I I I I a n d t o d o m a i n I I I i n t h e I P a s s a y T h e d o m a i n i n t h e N t e r m i n a l h a l f o f p e r l e c a n t h a t b i n d s F G F 1 8 w a s d e t e r m i n e d i n t h e I P a s s a y b y i n c u b a t i n g 4 0 n g / m l o f 1 2 5 I F G F 1 8 w i t h o u t p e r l e c a n o r w i t h 1 5 0 n g / m l o f a r e c o m b i n a n t p r o d u c t f o r d o m a i n I I I o f p e r l e c a n ( C h a k r a v a r t i H o r c h a r e t a l 1 9 9 5 ) o r w i t h A l t 1 o r w i t h A l t 2 a r e c o m b i n a n t p r o d u c t o f d o m a i n s I I I I m a d e w i t h o u t G A G s ( D o l a n H o r c h a r e t a l 1 9 9 7 ) F G F 1 8 b o u n d e q u a l l y t o d o m a i n I I I a s i t b o u n d t o t h e d o m a i n I I I I p r o d u c t s ( F i g 1 8 ) D i s c u s s i o n I n t h i s s t u d y w e u s e d a c a t i o n i c f i l t r a t i o n ( C A F ) a s s a y a n d a n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a s s a y t o i d e n t i f y F G F 1 8 a s a n o v e l b i n d i n g p a r t n e r o f g r o w t h p l a t e p e r l e c a n F G F 1 8 b o u n d t o n a t i v e p e r l e c a n p u r i f i e d f r o m t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e ( F i g 1 3 ) R e m o v a l o f t h e c h o n d r o i t i n s u l f a t e ( C S ) a n d h e p a r a n s u l f a t e ( H S ) c h a i n s o f p e r l e c a n d i d n o t s i g n i f i c a n t l y r e d u c e F G F 1 8 b i n d i n g ( F i g s 1 4 a n d 1 5 ) T h e s e d a t a s h o w t h a t n o o t h e r g r o w t h p l a t e m o l e c u l e s a r e n e e d e d t o m e d i a t e t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n p e r l e c a n a n d F G F 1 8 a n d t h a t t h e b i n d i n g i s t o t h e c o r e p r o t e i n o f p e r l e c a n

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95 I n f u r t h e r c o n f i r m a t i o n o f t h i s f i n d i n g d e n a t u r i n g a n d r e d u c i n g / a l k y l a t i n g t h e c o r e p r o t e i n o f p e r l e c a n s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d t h e b i n d i n g o f F G F 1 8 t o p e r l e c a n ( F i g 1 6 ) W i t h t h e c o m p l e t e t r e a t m e n t ( u r e a f o r d e n a t u r a t i o n D T T f o r r e d u c t i o n a n d I o d o a c e t a m i d e f o r a l k y l a t i o n ) t h e b i n d i n g o f F G F 1 8 t o p e r l e c a n w a s r e d u c e d c l o s e t o b a c k g r o u n d ( b i n d i n g o f F G F 1 8 t o t h e C A F a s s a y m e m b r a n e a l o n e ) F G F 1 8 a l s o b o u n d e q u a l l y w e l l t o t h e r e c o m b i n a n t p r o d u c t s A l t 1 A l t 2 a n d D I I I o f p e r l e c a n m a d e i n C O S 7 c e l l s ( F i g s 1 7 a n d 1 8 ) T h e s e r e c o m b i n a n t p r o d u c t s a r e o f t h e e x p e c t e d s i z e c o n f o r m a t i o n a n d G A G c o n t e n t a s s e e n i n W e s t e r n b l o t s o f t h e v a r i o u s p r o d u c t s u n r e d u c e d r e d u c e d o r t r e a t e d w i t h G A G l y a s e s ( d a t a n o t s h o w n ) P u r i f i e d f u l l l e n g t h p e r l e c a n f r o m t h e g r o w t h p l a t e c o n t a i n s 2 5 % o f i t s t o t a l G A G s a s H S a n d 7 5 % a s C S r e c o m b i n a n t A l t 1 c o n t a i n s 6 0 % H S a n d 4 0 % C S a n d r e c o m b i n a n t A l t 2 d o e s n o t c o n t a i n G A G s y e t t h e y a l l b i n d F G F 1 8 c o m p a r a b l y T h i s s u g g e s t s t h a t n e i t h e r t h e i n t a c t G A G s o n p e r l e c a n n o r t h e G A G s t u b s a f t e r g l y c o s i d a s e d i g e s t i o n i n f l u e n c e F G F 1 8 b i n d i n g T h e A l t 1 p r o d u c t i s t h e N t e r m i n a l t h i r d o f d o m a i n I c o n t a i n i n g t h e s e r i n e G A G a t t a c h m e n t s i t e s p l u s a l l o f d o m a i n s I I a n d I I I ( D o l a n H o r c h a r e t a l 1 9 9 7 ) T h e A l t 2 p r o d u c t i s m a d e w i t h o u t G A G s s i n c e t h e s e r i n e s i n d o m a i n I t h a t a r e G A G a t t a c h m e n t s i t e s w e r e m u t a t e d t o t h r e o n i n e s ( D o l a n H o r c h a r e t a l 1 9 9 7 ) D o m a i n I I I a l s o b o u n d e q u a l l y w e l l t o F G F 1 8 a s A l t 1 a n d A l t 2 d i d w h i c h p i n p o i n t s t h e b i n d i n g s i t e o f F G F 1 8 t o d o m a i n I I I o f p e r l e c a n ( F i g 1 8 ) T h e G A G o n p e r l e c a n c o n s t i t u t e s 2 0 % o f i t s m o l e c u l a r m a s s ( D o l a n H o r c h a r e t a l 1 9 9 7 ; T a p a n a d e c h o p o n e H a s s e l l e t a l 1 9 9 9 ; G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) T h e r e f o r e t h e 2 n g / t u b e ( 1 0 n g / m l ) o f p e r l e c a n G A G u s e d i n o u r i n i t i a l d o s e r e s p o n s e C A F a s s a y ( F i g 1 3 ) c o r r e s p o n d s t o 1 0 n g o f p e r l e c a n T h e m o l e c u l a r m a s s e s o f p e r l e c a n a n d F G F 1 8 a r e ~ 6 0 0 k D a ( S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) a n d 2 2 k D a

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96 ( P e p r o t e c h p r o d u c t d a t a s h e e t ) r e s p e c t i v e l y A s d e t e r m i n e d f r o m o u r s a t u r a t i o n b i n d i n g c u r v e s h o w n i n F i g u r e 1 3 n e a r s a t u r a t i o n ( i e a t 8 5 4 n M F G F 1 8 a d d e d ) o u r c a l c u l a t i o n s y i e l d a s t o i c h i o m e t r y o f ~ 1 0 3 F G F 1 8 m o l e c u l e s b o u n d p e r m o l e c u l e o f p e r l e c a n T h i s s u g g e s t s t h a t g r o w t h p l a t e p e r l e c a n i s c a p a b l e o f s e r v i n g a s a r e s e r v o i r f o r l a r g e a m o u n t s o f F G F 1 8 a f u n c t i o n p r e v i o u s l y s h o w n f o r p e r l e c a n w i t h o t h e r g r o w t h f a c t o r s ( I o z z o 1 9 9 4 ; M o n g i a t T a y l o r e t a l 2 0 0 0 ; S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) S c a t c h a r d a n a l y s i s o f t h e b i n d i n g d a t a u s i n g S i g m a P l o t s h o w e d a k d o f 1 4 4 n M f o r t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n F G F 1 8 a n d p e r l e c a n ( F i g u r e 1 3 ) T h u s g r o w t h p l a t e p e r l e c a n i s a l o w a f f i n i t y b i n d i n g p a r t n e r f o r F G F 1 8 ( Y a y o n K l a g s b r u n e t a l 1 9 9 1 ; F a y e i n C o u r t o i s e t a l 1 9 9 2 ; M o s c a t e l l i 1 9 9 2 ) F G F 1 8 b o u n d t o d o m a i n I I I o f p e r l e c a n D o m a i n I I I h a s a c a l c u l a t e d m o l e c u l a r m a s s o f 1 2 0 1 3 5 k D a ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ) a c c o u n t i n g f o r ~ 2 5 % o f t h e m a s s o f t o t a l c o r e p r o t e i n a n d i s o r g a n i z e d i n t o t h r e e i d e n t i c a l s u b d o m a i n s t h a t s h o w e x t e n s i v e t e r t i a r y s t r u c t u r e E a c h o f t h e t h r e e s u b d o m a i n s c o n s i s t s o f a 2 8 4 1 a m i n o a c i d c y s t e i n e r i c h r e p e a t f o l l o w e d b y a 1 9 2 1 9 9 a m i n o a c i d c y s t e i n e f r e e g l o b u l a r d o m a i n f o l l o w e d b y t h r e e a d d i t i o n a l c y s t e i n e r i c h r e p e a t s ( t o t a l i n g 1 4 7 1 6 8 a m i n o a c i d s ) ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ) D o m a i n I I I s h o w s s u b s t a n t i a l h o m o l o g y t o t h e s h o r t a r m o f t h e l a m i n i n A c h a i n e v e n s h o w i n g t h e s a m e v a r i a b i l i t y i n t h e n u m b e r s o f c y s t e i n e r e s i d u e s p e r r e p e a t a n d t h e s a m e R G D S a m i n o a c i d s e q u e n c e i n t h e s e c o n d g l o b u l a r d o m a i n ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ) ; t h i s s e q u e n c e i s a c t i v e i n i n t e g r i n b i n d i n g a n d m e d i a t e s t h e c e l l a d h e s i v e p r o p e r t i e s o f p e r l e c a n ( C h a k r a v a r t i H o r c h a r e t a l 1 9 9 5 ; I o z z o 2 0 0 5 ; K n o x a n d W h i t e l o c k 2 0 0 6 ) T h e d i s u l f i d e b o n d e d c y s t e i n e r i c h r e p e a t s o f d o m a i n I I I a r e h o m o l o g o u s t o e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) a n d c o n f e r a r e s i s t a n c e t o p r o t e o l y s i s

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97 ( C h a k r a v a r t i H o r c h a r e t a l 1 9 9 5 ) W e c a n s p e c u l a t e t h e n t h a t a g r o w t h f a c t o r ( s u c h a s F G F 1 8 ) b o u n d t o t h i s s t a b l e d o m a i n I I I m i g h t b e m o r e e f f e c t i v e l y p r o t e c t e d i n t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x T h e r e p e t i t i v e s t r u c t u r e o f d o m a i n I I I ( w h i c h w o u l d p r o v i d e m u l t i p l e b i n d i n g s i t e s ) a n d t h e t e n d e n c y o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r s t o m u l t i m e r i z e ( H a r m e r R o b i n s o n e t a l 2 0 0 6 ) m a y e x p l a i n t h e 1 4 3 : 1 s t o i c h i o m e t r y o f t h e F G F 1 8 : p e r l e c a n i n t e r a c t i o n ; t h e b i n d i n g o f F G F 1 8 t o p e r l e c a n c o u l d e n h a n c e F G F 1 8 m u l t i m e r i z a t i o n D o m a i n I I I i s a l r e a d y k n o w n t o b i n d t o v a r i o u s p r o t e i n s i n c l u d i n g i n t e g r i n s F G F 7 F G F B P ( F G F b i n d i n g p r o t e i n ) P D G F ( p l a t e l e t d e r i v e d g r o w t h f a c t o r ) a n d W A R P ( v o n W i l l e b r a n d f a c t o r A d o m a i n r e l a t e d p r o t e i n w h i c h i s e x p r e s s e d i n c h o n d r o c y t e s a n d a f f e c t s E C M s t r u c t u r e ) ( C h a k r a v a r t i H o r c h a r e t a l 1 9 9 5 ; G o h r i n g S a s a k i e t a l 1 9 9 8 ; M o n g i a t T a y l o r e t a l 2 0 0 0 ; M o n g i a t O t t o e t a l 2 0 0 1 ; A l l e n B a t e m a n e t a l 2 0 0 6 ) W e h a v e s h o w n i n t h i s s t u d y t h a t d o m a i n I I I a l s o b i n d s F G F 1 8 F G F 2 i s a n o t h e r l o w a f f i n i t y b i n d i n g p a r t n e r o f p e r l e c a n a n d b i n d s e x c l u s i v e l y v i a p e r l e c a n s H S c h a i n s ( A v i e z e r L e v y e t a l 1 9 9 4 ; K n o x M e r r y e t a l 2 0 0 2 ; S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) P e r l e c a n i n t h e m o u s e m o d e l h s p g 2 3 / 3 l a c k s t h e H S a t t a c h m e n t s i t e s i n d o m a i n I b u t i s s t i l l s y n t h e s i z e d a s a H S P G b e c a u s e o f t h e H S a t t a c h m e n t s i t e i n d o m a i n V T h e h s p g 2 3 / 3 m o u s e s h o w s d e f e c t i v e l e n s c a p s u l e f o r m a t i o n ( R o s s i M o r i t a e t a l 2 0 0 3 ) d e l a y e d w o u n d h e a l i n g a n d i m p a i r e d a n g i o g e n e s i s ( Z h o u W a n g e t a l 2 0 0 4 ) i n c r e a s e d s m o o t h m u s c l e c e l l p r o l i f e r a t i o n ( T r a n T r a n L u n d m a r k e t a l 2 0 0 4 ) a n d a b n o r m a l g l o m e r u l a r f i l t r a t i o n ( M o r i t a Y o s h i m u r a e t a l 2 0 0 5 ) b u t n o s i g n i f i c a n t c a r t i l a g e o r b o n e d e f e c t s T h i s s u g g e s t s e i t h e r t h a t t h e s i n g l e H S c h a i n o n d o m a i n V i s s u f f i c i e n t f o r g r o w t h f a c t o r ( i e F G F 2 ) a c t i o n i n t h e g r o w t h p l a t e o r t h a t a s t h e n o r m a l l e n g t h b o n e s o f t h e F G F 2 k n o c k o u t i n d i c a t e ( M o n t e r o O k a d a e t a l 2 0 0 0 )

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98 F G F 2 i s n o t a c r u c i a l l i g a n d f o r F G F R 3 a n d t h u s f o r e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n i n t h e g r o w t h p l a t e I n c o n t r a s t t h e F G F 1 8 k n o c k o u t h a s d e f e c t s i n e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n ( L i u X u e t a l 2 0 0 2 ; O h b a y a s h i S h i b a y a m a e t a l 2 0 0 2 ) w h i c h s u g g e s t s t h a t F G F 1 8 i s t h e c r u c i a l F G F i n l o n g b o n e g r o w t h F G F 1 8 b i n d s t o t h e c o r e p r o t e i n o f p e r l e c a n T h e c o r e p r o t e i n o f p e r l e c a n i s p r e s e n t i n t h e h s p g 2 3 / 3 m o u s e w h i c h h a s n o r m a l e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n b u t i s a b s e n t i n t h e p e r l e c a n n u l l m o u s e w h i c h h a s d e f e c t i v e e n d o c h o n d r a l o s s i f i c a t i o n ( A r i k a w a H i r a s a w a W a t a n a b e e t a l 1 9 9 9 ; C o s t e l l G u s t a f s s o n e t a l 1 9 9 9 ) W e p r o p o s e t h e n f r o m o u r f i n d i n g s t h a t t h e c o r e p r o t e i n o f p e r l e c a n m a y b e a n i m p o r t a n t m e d i a t o r o f F G F 1 8 a c t i o n

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99 F i g u r e s F i g u r e 1 3 S a t u r a t i o n b i n d i n g o f 1 2 5 I F G F 1 8 t o g r o w t h p l a t e p e r l e c a n i n t h e c a t i o n i c f i l t r a t i o n ( C A F ) a s s a y 1 2 5 I F G F 1 8 ( 3 3 2 3 8 5 n g / m l ; 0 7 5 1 0 9 n M ) w a s a d d e d t o t u b e s w i t h o u t o r w i t h p e r l e c a n ( 8 n g G A G / m l ) A f t e r i n c u b a t i o n t h e s a m p l e s w e r e f i l t e r e d a c r o s s t h e c a t i o n i c m e m b r a n e a n d t h e c o u n t s r e t a i n e d o n t h e m e m b r a n e w e r e d e t e r m i n e d S p e c i f i c a l l y b o u n d F G F 1 8 ( s p e c i f i c c o u n t s [ t o t a l c o u n t s m i n u s c o u n t s b o u n d w i t h o u t p e r l e c a n ] d i v i d e d b y s p e c i f i c a c t i v i t y a n d e x p r e s s e d a s n a n o m o l a r ) i s s h o w n i n t h e s a t u r a t i o n b i n d i n g c u r v e S c a t c h a r d a n a l y s i s ( i n s e t ) o f t h e b i n d i n g d a t a g a v e a d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( k d ) o f 1 4 5 n M E r r o r b a r s r e p r e s e n t S E M

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100 F i g u r e 1 4 E f f e c t o f c h o n d r o i t i n a s e o r h e p a r i t i n a s e p r e t r e a t m e n t o f g r o w t h p l a t e p e r l e c a n o n 1 2 5 I F G F 1 8 b i n d i n g u s i n g t h e C A F a s s a y P e r l e c a n w a s e i t h e r s h a m d i g e s t e d ( s h a m ) o r d i g e s t e d s e p a r a t e l y w i t h e i t h e r c h o n d r o i t i n a s e A B C ( C ) o r a m i x t u r e o f h e p a r i t i n a s e s I a n d I I ( H ) A f t e r i n c u b a t i o n o f p e r l e c a n ( 1 0 n g G A G / m l ) w i t h 1 2 5 I F G F 1 8 ( 8 0 n g / m l ) f o r 1 h t h e s a m p l e s w e r e f i l t e r e d a c r o s s t h e c a t i o n i c m e m b r a n e a n d t h e c o u n t s r e t a i n e d o n t h e f i l t e r w e r e d e t e r m i n e d F o r e a c h t r e a t m e n t c o n t r o l v a l u e s ( n o p e r l e c a n ) w e r e s u b t r a c t e d f r o m e x p e r i m e n t a l v a l u e s ( w i t h p e r l e c a n ) t o g i v e o u r r e s u l t s N e i t h e r c h o n d r o i t i n a s e n o r h e p a r i t i n a s e d i g e s t i o n o f p e r l e c a n s i g n i f i c a n t l y c h a n g e d 1 2 5 I F G F 1 8 p e r l e c a n b i n d i n g E r r o r b a r s r e p r e s e n t S E M

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101 F i g u r e 1 5 E f f e c t s o f c h o n d r o i t i n a s e a n d h e p a r i t i n a s e p r e t r e a t m e n t o f p e r l e c a n o n 1 2 5 I F G F 1 8 b i n d i n g u s i n g t h e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a s s a y P e r l e c a n ( 3 0 n g G A G / m l ) w a s e i t h e r s h a m d i g e s t e d ( s h a m ) d i g e s t e d w i t h c h o n d r o i t i n a s e A B C ( C ) d i g e s t e d w i t h a m i x t u r e o f h e p a r i t i n a s e s I a n d I I ( H ) o r d i g e s t e d w i t h b o t h c h o n d r o i t i n a s e a n d h e p a r i t i n a s e s ( C + H ) i n c u b a t e d w i t h 1 2 5 I F G F 1 8 ( 4 0 n g / m l ) a n d i m m u n o p r e c i p i t a t e d u s i n g p r e i m m u n e s e r u m o r p e r l e c a n a n t i s e r u m a n d p r o t e i n G b e a d s A f t e r w a s h i n g t o r e m o v e u n b o u n d 1 2 5 I F G F 1 8 t h e a m o u n t o f 1 2 5 I F G F 1 8 r e l e a s e d f r o m t h e b e a d s b y 2 M N a C l w a s m e a s u r e d F o r e a c h t r e a t m e n t c o n t r o l v a l u e s ( n o p e r l e c a n ) w e r e s u b t r a c t e d f r o m e x p e r i m e n t a l v a l u e s ( w i t h p e r l e c a n ) t o g i v e o u r r e s u l t s C h o n d r o i t i n a s e h e p a r i t i n a s e a n d c h o n d r o i t i n a s e + h e p a r i t i n a s e t r e a t m e n t s o f p e r l e c a n d i d n o t s i g n i f i c a n t l y c h a n g e t h e a m o u n t o f 1 2 5 I F G F 1 8 r e l e a s e d f r o m t h e b e a d s b y 2 M N a C l E r r o r b a r s r e p r e s e n t S E M d e n o t e s s i g n i f i c a n c e c o m p a r e d t o p r e i m m u n e c o n t r o l ( p < 0 0 5 )

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102 F i g u r e 1 6 E f f e c t o f g r o w t h p l a t e p e r l e c a n c o r e p r o t e i n d e n a t u r a t i o n a n d r e d u c t i o n / a l k y l a t i o n o n 1 2 5 I F G F 1 8 b i n d i n g T o d e t e r m i n e i f c o r e p r o t e i n s t r u c t u r e h a s a n e f f e c t o n F G F 1 8 : p e r l e c a n b i n d i n g w e u s e d 5 0 n g o f F G F 1 8 i n a C A F a s s a y w i t h 2 n g G A G o f p e r l e c a n t h a t w a s e i t h e r u n t r e a t e d o r d e n a t u r e d w i t h 8 M u r e a o r b o t h d e n a t u r e d a n d r e d u c e d / a l k y l a t e d w i t h u r e a a n d 5 0 m M D T T / 1 0 0 m M I o d o a c e t a m i d e T h e b i n d i n g o f F G F 1 8 t o p e r l e c a n w a s r e d u c e d b y m o r e t h a n 5 0 % w h e n t h e c o r e p r o t e i n w a s s t r u c t u r e w a s a l t e r e d b y r e d u c t i o n a n d a l k y l a t i o n ( F i g u r e 1 6 ) T h e d e c r e a s e w a s l e s s d r a s t i c b u t s t i l l s i g n i f i c a n t w h e n t h e c o r e p r o t e i n w a s d e n a t u r e d o n l y

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103 F i g u r e 1 7 B i n d i n g o f 1 2 5 I F G F 1 8 t o n a t i v e f u l l l e n g t h p e r l e c a n a n d t o r e c o m b i n a n t p e r l e c a n d o m a i n s I I I I i n t h e C A F a s s a y 1 2 5 I F G F 1 8 ( F i g u r e 1 7 A : 2 0 n g / m l F i g u r e 1 7 B : 1 6 0 n g / m l ) w a s i n c u b a t e d w i t h n o p e r l e c a n ( ) o r w i t h 1 0 n g G A G / m l o f e i t h e r f u l l l e n g t h p e r l e c a n p u r i f i e d f r o m t h e g r o w t h p l a t e o r A l t 1 ( r e c o m b i n a n t d o m a i n s I I I I ) A f t e r 1 h t h e s a m p l e s w e r e f i l t e r e d a c r o s s t h e c a t i o n i c m e m b r a n e a n d t h e c o u n t s r e t a i n e d o n t h e f i l t e r w e r e d e t e r m i n e d a n d d i v i d e d b y t h e s p e c i f i c a c t i v i t y t o d e t e r m i n e n g b o u n d F o r b o t h p e r l e c a n p r e p a r a t i o n s t h e r e w e r e s i m i l a r p e r c e n t a g e s ( ~ 5 0 % ) o f F G F 1 8 b o u n d a t b o t h t h e l o w ( F i g u r e 1 7 A ) a n d h i g h ( F i g u r e 1 7 B ) c o n c e n t r a t i o n s o f F G F 1 8 u s e d E r r o r b a r s r e p r e s e n t S E M d e n o t e s s i g n i f i c a n c e c o m p a r e d t o c o n t r o l w i t h n o p e r l e c a n ( p < 0 0 5 )

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104 F i g u r e 1 8 B i n d i n g o f 1 2 5 I F G F 1 8 t o d i f f e r e n t p e r l e c a n d o m a i n s i n t h e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a s s a y R e c o m b i n a n t p e r l e c a n d o m a i n I I I ( D I I I ) d o m a i n s I I I I ( A l t 1 ) a n d d o m a i n s I I I I w i t h n o G A G s ( A l t 2 ) e a c h a t 1 5 0 n g / m l w e r e m i x e d s e p a r a t e l y w i t h 1 2 5 I F G F 1 8 ( 4 0 n g / m l ) a n d t h e p e r l e c a n w a s i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h P r o t e i n G b e a d s a f t e r i n c u b a t i o n w i t h p r e i m m u n e s e r u m o r w i t h a n t i s e r u m t o p e r l e c a n A c o n t r o l w a s a d d e d w h e r e n o p e r l e c a n w a s u s e d i n t h e i n c u b a t i o n ( ) A f t e r w a s h i n g t o r e m o v e u n b o u n d 1 2 5 I F G F 1 8 t h e a m o u n t o f 1 2 5 I F G F 1 8 r e m a i n i n g o n t h e b e a d s w a s d e t e r m i n e d 1 2 5 I F G F 1 8 b o u n d t o t h e b e a d s w a s s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r u s i n g a n t i p e r l e c a n s e r u m v e r s u s p r e i m m u n e s e r u m ( p < 0 0 5 p a i r e d t t e s t ) T h e r e w e r e n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s h o w e v e r a m o n g t h e t h r e e t y p e s o f p e r l e c a n t h a t w e r e u s e d E r r o r b a r s r e p r e s e n t S E M d e n o t e s s i g n i f i c a n c e c o m p a r e d t o c o n t r o l w i t h n o p e r l e c a n ( p < 0 0 5 )

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105 R e f e r e n c e s F o r P a p e r I I A l l e n J M J F B a t e m a n e t a l ( 2 0 0 6 ) W A R P i s a n o v e l m u l t i m e r i c c o m p o n e n t o f t h e c h o n d r o c y t e p e r i c e l l u l a r m a t r i x t h a t i n t e r a c t s w i t h p e r l e c a n J B i o l C h e m 2 8 1 ( 1 1 ) : 7 3 4 1 9 A r i k a w a H i r a s a w a E H W a t a n a b e e t a l ( 1 9 9 9 ) P e r l e c a n i s e s s e n t i a l f o r c a r t i l a g e a n d c e p h a l i c d e v e l o p m e n t N a t G e n e t 2 3 ( 3 ) : 3 5 4 8 A r i k a w a H i r a s a w a E W R W i l c o x e t a l ( 2 0 0 1 ) D y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e i s c a u s e d b y f u n c t i o n a l n u l l m u t a t i o n s o f t h e p e r l e c a n g e n e N a t G e n e t 2 7 ( 4 ) : 4 3 1 4 A r i k a w a H i r a s a w a E W R W i l c o x e t a l ( 2 0 0 1 ) D y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e : u n e x p e c t e d r o l e o f p e r l e c a n i n c a r t i l a g e d e v e l o p m e n t A m J M e d G e n e t 1 0 6 ( 4 ) : 2 5 4 7 A s h i k a r i H a d a S H H a b u c h i e t a l ( 2 0 0 4 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f g r o w t h f a c t o r b i n d i n g s t r u c t u r e s i n h e p a r i n / h e p a r a n s u l f a t e u s i n g a n o c t a s a c c h a r i d e l i b r a r y J B i o l C h e m 2 7 9 ( 1 3 ) : 1 2 3 4 6 5 4 A v i e z e r D E L e v y e t a l ( 1 9 9 4 ) D i f f e r e n t i a l s t r u c t u r a l r e q u i r e m e n t s o f h e p a r i n a n d h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s t h a t p r o m o t e b i n d i n g o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r t o i t s r e c e p t o r J B i o l C h e m 2 6 9 ( 1 ) : 1 1 4 2 1 C h a k r a v a r t i S T H o r c h a r e t a l ( 1 9 9 5 ) R e c o m b i n a n t d o m a i n I I I o f p e r l e c a n p r o m o t e s c e l l a t t a c h m e n t t h r o u g h i t s R G D S s e q u e n c e J B i o l C h e m 2 7 0 ( 1 ) : 4 0 4 9 C o f f i n J D R Z F l o r k i e w i c z e t a l ( 1 9 9 5 ) A b n o r m a l b o n e g r o w t h a n d s e l e c t i v e t r a n s l a t i o n a l r e g u l a t i o n i n b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F 2 ) t r a n s g e n i c m i c e M o l B i o l C e l l 6 ( 1 2 ) : 1 8 6 1 7 3 C o l v i n J S B A B o h n e e t a l ( 1 9 9 6 ) S k e l e t a l o v e r g r o w t h a n d d e a f n e s s i n m i c e l a c k i n g f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 N a t G e n e t 1 2 ( 4 ) : 3 9 0 7 C o s t e l l M E G u s t a f s s o n e t a l ( 1 9 9 9 ) P e r l e c a n m a i n t a i n s t h e i n t e g r i t y o f c a r t i l a g e a n d s o m e b a s e m e n t m e m b r a n e s J C e l l B i o l 1 4 7 ( 5 ) : 1 1 0 9 2 2

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106 D a v i d s o n D A B l a n c e t a l ( 2 0 0 5 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) 1 8 s i g n a l s t h r o u g h F G F r e c e p t o r 3 t o p r o m o t e c h o n d r o g e n e s i s J B i o l C h e m 2 8 0 ( 2 1 ) : 2 0 5 0 9 1 5 D e n g C A W y n s h a w B o r i s e t a l ( 1 9 9 6 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 i s a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f b o n e g r o w t h C e l l 8 4 ( 6 ) : 9 1 1 2 1 D o l a n M T H o r c h a r e t a l ( 1 9 9 7 ) I d e n t i f i c a t i o n o f s i t e s i n d o m a i n I o f p e r l e c a n t h a t r e g u l a t e h e p a r a n s u l f a t e s y n t h e s i s J B i o l C h e m 2 7 2 ( 7 ) : 4 3 1 6 2 2 F a r n d a l e R W D J B u t t l e e t a l ( 1 9 8 6 ) I m p r o v e d q u a n t i t a t i o n a n d d i s c r i m i n a t i o n o f s u l p h a t e d g l y c o s a m i n o g l y c a n s b y u s e o f d i m e t h y l m e t h y l e n e b l u e B i o c h i m B i o p h y s A c t a 8 8 3 ( 2 ) : 1 7 3 7 F a y e i n N A Y C o u r t o i s e t a l ( 1 9 9 2 ) B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r h i g h a n d l o w a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s i n d e v e l o p i n g m o u s e b r a i n h i p p o c a m p u s a n d c e r e b e l l u m B i o l C e l l 7 6 ( 1 ) : 1 1 3 F o r s t e n K E N W a n g e t a l ( 2 0 0 0 ) A s i m p l e a s s a y f o r e v a l u a t i n g i n h i b i t o r s o f p r o t e o g l y c a n l i g a n d b i n d i n g A n n B i o m e d E n g 2 8 ( 1 ) : 1 1 9 2 7 G a r o f a l o S M K l i g e r S p a t z e t a l ( 1 9 9 9 ) S k e l e t a l d y s p l a s i a a n d d e f e c t i v e c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n b y t a r g e t e d o v e r e x p r e s s i o n o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 9 i n t r a n s g e n i c m i c e J B o n e M i n e r R e s 1 4 ( 1 1 ) : 1 9 0 9 1 5 G o h r i n g W T S a s a k i e t a l ( 1 9 9 8 ) M a p p i n g o f t h e b i n d i n g o f p l a t e l e t d e r i v e d g r o w t h f a c t o r t o d i s t i n c t d o m a i n s o f t h e b a s e m e n t m e m b r a n e p r o t e i n s B M 4 0 a n d p e r l e c a n a n d d i s t i n c t i o n f r o m t h e B M 4 0 c o l l a g e n b i n d i n g e p i t o p e E u r J B i o c h e m 2 5 5 ( 1 ) : 6 0 6 G o v i n d r a j P L W e s t e t a l ( 2 0 0 2 ) I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e m a j o r h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s i n t h e d e v e l o p i n g b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e J B i o l C h e m 2 7 7 ( 2 2 ) : 1 9 4 6 1 9 H a n d l e r M P D Y u r c h e n c o e t a l ( 1 9 9 7 ) D e v e l o p m e n t a l e x p r e s s i o n o f p e r l e c a n d u r i n g m u r i n e e m b r y o g e n e s i s D e v D y n 2 1 0 ( 2 ) : 1 3 0 4 5

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107 H a r m e r N J C J R o b i n s o n e t a l ( 2 0 0 6 ) M u l t i m e r s o f t h e f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) F G F r e c e p t o r s a c c h a r i d e c o m p l e x a r e f o r m e d o n l o n g o l i g o m e r s o f h e p a r i n B i o c h e m J 3 9 3 ( P t 3 ) : 7 4 1 8 H a s s e l l J R P G R o b e y e t a l ( 1 9 8 0 ) I s o l a t i o n o f a h e p a r a n s u l f a t e c o n t a i n i n g p r o t e o g l y c a n f r o m b a s e m e n t m e m b r a n e P r o c N a t l A c a d S c i U S A 7 7 ( 8 ) : 4 4 9 4 8 I o z z o R V ( 1 9 9 4 ) P e r l e c a n : a g e m o f a p r o t e o g l y c a n M a t r i x B i o l 1 4 ( 3 ) : 2 0 3 8 I o z z o R V ( 2 0 0 5 ) B a s e m e n t m e m b r a n e p r o t e o g l y c a n s : f r o m c e l l a r t o c e i l i n g N a t R e v M o l C e l l B i o l 6 ( 8 ) : 6 4 6 5 6 I w a t a T L C h e n e t a l ( 2 0 0 0 ) A n e o n a t a l l e t h a l m u t a t i o n i n F G F R 3 u n c o u p l e s p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s i n e m b r y o s H u m M o l G e n e t 9 ( 1 1 ) : 1 6 0 3 1 3 K n o x S C M e r r y e t a l ( 2 0 0 2 ) N o t a l l p e r l e c a n s a r e c r e a t e d e q u a l : i n t e r a c t i o n s w i t h f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) 2 a n d F G F r e c e p t o r s J B i o l C h e m 2 7 7 ( 1 7 ) : 1 4 6 5 7 6 5 K n o x S M a n d J M W h i t e l o c k ( 2 0 0 6 ) P e r l e c a n : h o w d o e s o n e m o l e c u l e d o s o m a n y t h i n g s ? C e l l M o l L i f e S c i L i u Z K J L a v i n e e t a l ( 2 0 0 6 ) F G F 1 8 i s r e q u i r e d f o r e a r l y c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n h y p e r t r o p h y a n d v a s c u l a r i n v a s i o n o f t h e g r o w t h p l a t e D e v B i o l L i u Z J X u e t a l ( 2 0 0 2 ) C o o r d i n a t i o n o f c h o n d r o g e n e s i s a n d o s t e o g e n e s i s b y f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 1 8 G e n e s D e v 1 6 ( 7 ) : 8 5 9 6 9 M a n c i l l a E E F D e L u c a e t a l ( 1 9 9 8 ) E f f e c t s o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 o n l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h E n d o c r i n o l o g y 1 3 9 ( 6 ) : 2 9 0 0 4 M o n g i a t M J O t t o e t a l ( 2 0 0 1 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r b i n d i n g p r o t e i n i s a n o v e l p a r t n e r f o r p e r l e c a n p r o t e i n c o r e J B i o l C h e m 2 7 6 ( 1 3 ) : 1 0 2 6 3 7 1 M o n g i a t M K T a y l o r e t a l ( 2 0 0 0 ) T h e p r o t e i n c o r e o f t h e p r o t e o g l y c a n p e r l e c a n b i n d s s p e c i f i c a l l y t o f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 7 J B i o l C h e m 2 7 5 ( 1 0 ) : 7 0 9 5 1 0 0

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108 M o n t e r o A Y O k a d a e t a l ( 2 0 0 0 ) D i s r u p t i o n o f t h e f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 g e n e r e s u l t s i n d e c r e a s e d b o n e m a s s a n d b o n e f o r m a t i o n J C l i n I n v e s t 1 0 5 ( 8 ) : 1 0 8 5 9 3 M o r i t a H A Y o s h i m u r a e t a l ( 2 0 0 5 ) H e p a r a n s u l f a t e o f p e r l e c a n i s i n v o l v e d i n g l o m e r u l a r f i l t r a t i o n J A m S o c N e p h r o l 1 6 ( 6 ) : 1 7 0 3 1 0 M o s c a t e l l i D ( 1 9 9 2 ) B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( b F G F ) d i s s o c i a t e s r a p i d l y f r o m h e p a r a n s u l f a t e s b u t s l o w l y f r o m r e c e p t o r s I m p l i c a t i o n s f o r m e c h a n i s m s o f b F G F r e l e a s e f r o m p e r i c e l l u l a r m a t r i x J B i o l C h e m 2 6 7 ( 3 6 ) : 2 5 8 0 3 9 N a s k i M C J S C o l v i n e t a l ( 1 9 9 8 ) R e p r e s s i o n o f h e d g e h o g s i g n a l i n g a n d B M P 4 e x p r e s s i o n i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e b y f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 D e v e l o p m e n t 1 2 5 ( 2 4 ) : 4 9 7 7 8 8 N i c o l e S C S D a v o i n e e t a l ( 2 0 0 0 ) P e r l e c a n t h e m a j o r p r o t e o g l y c a n o f b a s e m e n t m e m b r a n e s i s a l t e r e d i n p a t i e n t s w i t h S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e ( c h o n d r o d y s t r o p h i c m y o t o n i a ) N a t G e n e t 2 6 ( 4 ) : 4 8 0 3 N o o n a n D M A F u l l e e t a l ( 1 9 9 1 ) T h e c o m p l e t e s e q u e n c e o f p e r l e c a n a b a s e m e n t m e m b r a n e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n r e v e a l s e x t e n s i v e s i m i l a r i t y w i t h l a m i n i n A c h a i n l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n r e c e p t o r a n d t h e n e u r a l c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e J B i o l C h e m 2 6 6 ( 3 4 ) : 2 2 9 3 9 4 7 O h b a y a s h i N M S h i b a y a m a e t a l ( 2 0 0 2 ) F G F 1 8 i s r e q u i r e d f o r n o r m a l c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n d u r i n g o s t e o g e n e s i s a n d c h o n d r o g e n e s i s G e n e s D e v 1 6 ( 7 ) : 8 7 0 9 O r n i t z D M a n d P L e d e r ( 1 9 9 2 ) L i g a n d s p e c i f i c i t y a n d h e p a r i n d e p e n d e n c e o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r s 1 a n d 3 J B i o l C h e m 2 6 7 ( 2 3 ) : 1 6 3 0 5 1 1 R o s s i M H M o r i t a e t a l ( 2 0 0 3 ) H e p a r a n s u l f a t e c h a i n s o f p e r l e c a n a r e i n d i s p e n s a b l e i n t h e l e n s c a p s u l e b u t n o t i n t h e k i d n e y E m b o J 2 2 ( 2 ) : 2 3 6 4 5 S h i a n g R L M T h o m p s o n e t a l ( 1 9 9 4 ) M u t a t i o n s i n t h e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f F G F R 3 c a u s e t h e m o s t c o m m o n g e n e t i c f o r m o f d w a r f i s m a c h o n d r o p l a s i a C e l l 7 8 ( 2 ) : 3 3 5 4 2

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109 S m i t h S M L A W e s t e t a l ( 2 0 0 6 ) H e p a r a n a n d c h o n d r o i t i n s u l f a t e o n g r o w t h p l a t e p e r l e c a n m e d i a t e b i n d i n g a n d d e l i v e r y o f F G F 2 t o F G F r e c e p t o r s M a t r i x B i o l S u n d a r R a j N D F i t e e t a l ( 1 9 9 5 ) P e r l e c a n i s a c o m p o n e n t o f c a r t i l a g e m a t r i x a n d p r o m o t e s c h o n d r o c y t e a t t a c h m e n t J C e l l S c i 1 0 8 ( P t 7 ) : 2 6 6 3 7 2 T a p a n a d e c h o p o n e P J R H a s s e l l e t a l ( 1 9 9 9 ) L o c a l i z a t i o n o f g l y c o s a m i n o g l y c a n s u b s t i t u t i o n s i t e s o n d o m a i n V o f m o u s e p e r l e c a n B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n 2 6 5 ( 3 ) : 6 8 0 9 0 T a v o r m i n a P L D L R i m o i n e t a l ( 1 9 9 5 ) A n o t h e r m u t a t i o n t h a t r e s u l t s i n t h e s u b s t i t u t i o n o f a n u n p a i r e d c y s t e i n e r e s i d u e i n t h e e x t r a c e l l u l a r d o m a i n o f F G F R 3 i n t h a n a t o p h o r i c d y s p l a s i a t y p e I H u m M o l G e n e t 4 ( 1 1 ) : 2 1 7 5 7 T r a n P K K T r a n L u n d m a r k e t a l ( 2 0 0 4 ) I n c r e a s e d i n t i m a l h y p e r p l a s i a a n d s m o o t h m u s c l e c e l l p r o l i f e r a t i o n i n t r a n s g e n i c m i c e w i t h h e p a r a n s u l f a t e d e f i c i e n t p e r l e c a n C i r c R e s 9 4 ( 4 ) : 5 5 0 8 W a n g Q R P G r e e n e t a l ( 2 0 0 1 ) D i f f e r e n t i a l r e g u l a t i o n o f e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h a n d j o i n t d e v e l o p m e n t b y F G F R 1 a n d F G F R 3 t y r o s i n e k i n a s e d o m a i n s D e v e l o p m e n t 1 2 8 ( 1 9 ) : 3 8 6 7 7 6 W a n g Y M K S p a t z e t a l ( 1 9 9 9 ) A m o u s e m o d e l f o r a c h o n d r o p l a s i a p r o d u c e d b y t a r g e t i n g f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 6 ( 8 ) : 4 4 5 5 6 0 W e s t L P G o v i n d r a j e t a l ( 2 0 0 6 ) C h a n g e s i n p e r l e c a n d u r i n g c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n i n t h e f e t a l b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e J O r t h o p R e s 2 4 ( 6 ) : 1 3 1 7 2 6 W i n t e r p a c h t A K H i l b e r t e t a l ( 2 0 0 0 ) A n o v e l m u t a t i o n i n F G F R 3 d i s r u p t s a p u t a t i v e N g l y c o s y l a t i o n s i t e a n d r e s u l t s i n h y p o c h o n d r o p l a s i a P h y s i o l G e n o m i c s 2 ( 1 ) : 9 1 2 Y a y o n A M K l a g s b r u n e t a l ( 1 9 9 1 ) C e l l s u r f a c e h e p a r i n l i k e m o l e c u l e s a r e r e q u i r e d f o r b i n d i n g o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r t o i t s h i g h a f f i n i t y r e c e p t o r C e l l 6 4 ( 4 ) : 8 4 1 8 Z h o u Z J W a n g e t a l ( 2 0 0 4 ) I m p a i r e d a n g i o g e n e s i s d e l a y e d w o u n d h e a l i n g a n d r e t a r d e d t u m o r g r o w t h i n p e r l e c a n h e p a r a n s u l f a t e d e f i c i e n t m i c e C a n c e r R e s 6 4 ( 1 4 ) : 4 6 9 9 7 0 2

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110 P a p e r I I I H i s t o n e H 3 i s a b i n d i n g p a r t n e r o f p e r l e c a n i n t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e m a t r i x S i m o n e M L S m i t h 1 P r a s a n t h i G o v i n d r a j 2 L e i g h W e s t 2 a n d J o h n R H a s s e l l 1 D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r M e d i c i n e 1 C o l l e g e o f M e d i c i n e U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a T a m p a F l 3 3 6 1 2 a n d C e n t e r f o r R e s e a r c h i n S k e l e t a l D e v e l o p m e n t a n d P e d i a t r i c O r t h o p e d i c s 2 S h r i n e r s H o s p i t a l s f o r C h i l d r e n T a m p a F l R u n n i n g T i t l e : H i s t o n e H 3 b i n d i n g t o p e r l e c a n A b b r e v i a t i o n s u s e d : 1 2 5 I I o d i n e 1 2 5 ; C A F c a t i o n i c f i l t r a t i o n a s s a y ; C S c h o n d r o i t i n s u l f a t e ; D D S H d y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e ; E C M e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ; G A G g l y c o s a m i n o g l y c a n ; H D A C h i s t o n e d e a c e t y l a s e ; H S h e p a r a n s u l f a t e ; H S P G h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n ; S J S S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : J o h n R H a s s e l l P h D D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r M e d i c i n e C o l l e g e o f M e d i c i n e U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a 1 2 9 0 1 B r u c e B D o w n s B l v d M D C B o x 7 T a m p a F L 3 3 6 1 2 S u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e S h r i n e r s H o s p i t a l s f o r C h i l d r e n ( t o J R H )

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111 A b s t r a c t P e r l e c a n i s t h e m a j o r h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n ( H S P G ) i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e I t s c o r e p r o t e i n a n d a t t a c h e d h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s m e d i a t e i n t e r a c t i o n s w i t h m a n y d i v e r s e p r o t e i n s P e r l e c a n i s e s s e n t i a l f o r p r o p e r s k e l e t a l d e v e l o p m e n t e s p e c i a l l y i n l o n g b o n e s T h e a i m o f t h i s s t u d y w a s t o i d e n t i f y p e r l e c a n b i n d i n g p r o t e i n s t h a t a r e e n d o g e n o u s t o t h e g r o w t h p l a t e A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y i s o l a t e d h i s t o n e H 3 a s a p e r l e c a n b i n d i n g p r o t e i n f r o m t h e c h o n d r o c y t e s u r f a c e / m a t r i x L i q u i d p h a s e ( c a t i o n i c f i l t r a t i o n ) b i n d i n g a s s a y s c o n f i r m e d t h e i n t e r a c t i o n a s s p e c i f i c a n d d e p e n d e n t p r i m a r i l y o n H S c h a i n s o f p e r l e c a n a l t h o u g h c h o n d r o i t i n s u l f a t e c h a i n s a n d t h e p e r l e c a n c o r e w e r e a l s o i n v o l v e d I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a l s o s h o w e d s t a i n i n g f o r p e r l e c a n a n d h i s t o n e H 3 i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e w i t h a n o t i c e a b l e c o l o c a l i z a t i o n o f t h e t w o p r o t e i n s T h e s e r e s u l t s c a n h e l p u s b e t t e r u n d e r s t a n d t h e g r o w t h f a c t o r i n d e p e n d e n t c o n t r o l t h a t p e r l e c a n e x e r t s t o f a c i l i t a t e l o n g b o n e g r o w t h K e y w o r d s : p e r l e c a n g r o w t h p l a t e h i s t o n e

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112 I n t r o d u c t i o n T h e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n ( H S P G ) p e r l e c a n h a s a p r o t e i n c o r e o f f i v e d i s t i n c t h i g h l y c o n s e r v e d d o m a i n s ( I V ) w i t h g l y c o s a m i n o g l y c a n ( G A G ) c h a i n s a t t a c h e d t o d o m a i n s I a n d V ( I o z z o 1 9 9 4 ; I o z z o C o h e n e t a l 1 9 9 4 ; S m i t h a n d H a s s e l l 2 0 0 6 ) D o m a i n I w a s f i r s t c o n s i d e r e d u n i q u e t o p e r l e c a n ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ) b u t w a s l a t e r s h o w n t o c o n t a i n a n S E A m o d u l e i m p o r t a n t f o r g l y c o s y l a t i o n o f t h e G A G a t t a c h m e n t s i t e s i n D o m a i n I ( B o r k a n d P a t t h y 1 9 9 5 ) D o m a i n s I I t o V h o w e v e r h a v e h o m o l o g y t o m o t i f s i n e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r l a m i n i n t h e l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n r e c e p t o r a n d N e u r a l C e l l A d h e s i o n M o l e c u l e ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ) P e r l e c a n i s a c o m p o n e n t o f a l l b a s e m e n t m e m b r a n e s a n d h a s b e e n s h o w n t o i n t e r a c t w i t h o t h e r c o m p o n e n t s f o u n d i n b a s e m e n t m e m b r a n e i n c l u d i n g l a m i n i n n i d o g e n c o l l a g e n I I a n d f i b r o n e c t i n ( I o z z o 1 9 9 4 ; I o z z o C o h e n e t a l 1 9 9 4 ) P e r l e c a n h a s a l s o b e e n s h o w n t o b i n d c e r t a i n g r o w t h f a c t o r s s u c h a s F G F 2 ( A v i e z e r H e c h t e t a l 1 9 9 4 ) a n d F G F 7 ( M o n g i a t T a y l o r e t a l 2 0 0 0 ) a n d i s k n o w n t o b e u p r e g u l a t e d b y T G F ( I o z z o P i l l a r i s e t t i e t a l 1 9 9 7 ) P e r l e c a n i s a l s o p r e s e n t i n c a r t i l a g e a n d i n t h e g r o w t h p l a t e ( S u n d a r R a j F i t e e t a l 1 9 9 5 ; H a n d l e r Y u r c h e n c o e t a l 1 9 9 7 ; F r e n c h S m i t h e t a l 1 9 9 9 ) T h e g r o w t h p l a t e i s a s p e c i a l i z e d r e g i o n o f c a r t i l a g e t h a t r e g u l a t e s t h e g r o w t h o f l o n g b o n e s ( H u n t l e y B u s h e t a l 2 0 0 3 ) T h e g r o w t h p l a t e c o n t a i n s d i s c r e t e t r a n s v e r s e z o n e s o f c h o n d r o c y t e s i n d i f f e r e n t s t a g e s o f d i f f e r e n t i a t i o n f r o m t h e r e s t i n g z o n e ( f a r t h e s t f r o m t h e b o n e ) t o t h e u p p e r a n d l o w e r p r o l i f e r a t i n g z o n e s ( c l o s e r t o t h e b o n e ) a n d t h e h y p e r t r o p h i c z o n e ( c l o s e s t t o t h e b o n e ) w h e r e c e l l s a r e t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d l a r g e r a n d a r e s e c r e t i n g t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( E C M ) t h a t o s t e o b l a s t s w i l l u s e a s

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113 a t e m p l a t e f o r b o n e f o r m a t i o n S t u d i e s h a v e s h o w n t h a t p e r l e c a n i s e s s e n t i a l f o r l o n g b o n e g r o w t h ( A r i k a w a H i r a s a w a W a t a n a b e e t a l 1 9 9 9 ; C o s t e l l G u s t a f s s o n e t a l 1 9 9 9 ; H a s s e l l Y a m a d a e t a l 2 0 0 2 ) a n d t h a t i t i s t h e m a j o r H S P G i n d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) W i t h o u t p e r l e c a n g r o w t h p l a t e c e l l s d o n o t p r o l i f e r a t e a n d t h e c a r t i l a g e a n d h e n c e t h e b o n e t e m p l a t e i s c o m p r o m i s e d N o t s u r p r i s i n g l y p e r l e c a n n u l l m i c e a r e f e t a l d w a r v e s a n d d i e b e f o r e o r s h o r t l y a f t e r b i r t h ( A r i k a w a H i r a s a w a W a t a n a b e e t a l 1 9 9 9 ; C o s t e l l G u s t a f s s o n e t a l 1 9 9 9 ) S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e D y s s e g m e n t a l D y s p l a s i a ( D D S H ) a n d S c h w a r t z J a m p e l S y n d r o m e ( S J S ) a r e t y p e s o f h u m a n d w a r f i s m a l s o k n o w n t o r e s u l t f r o m a l o s s o r a l t e r a t i o n o f p e r l e c a n ( A r i k a w a H i r a s a w a W i l c o x e t a l 2 0 0 1 ; A r i k a w a H i r a s a w a a n d Y a m a d a 2 0 0 1 ; A r i k a w a H i r a s a w a L e e t a l 2 0 0 2 ) T h i s i n d i c a t e s t h a t p e r l e c a n i s n e c e s s a r y f o r p r o p e r s k e l e t a l d e v e l o p m e n t W h i l e t h e i n t e r a c t i o n o f p e r l e c a n w i t h c o m p o n e n t s f o u n d i n b a s e m e n t m e m b r a n e s i s w i d e l y d o c u m e n t e d l e s s i s k n o w n a b o u t t h e i n t e r a c t i o n s o f p e r l e c a n w i t h t h e c o m p o n e n t s i n t h e g r o w t h p l a t e T h e a i m o f t h i s s t u d y w a s t o i d e n t i f y p e r l e c a n b i n d i n g p r o t e i n s e n d o g e n o u s t o t h e g r o w t h p l a t e a n d t o c h a r a c t e r i z e t h e i r i n t e r a c t i o n s w i t h p e r l e c a n U s i n g p e r l e c a n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y p r o t e i n s e q u e n c i n g a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y w e i d e n t i f i e d h i s t o n e H 3 a s a b i n d i n g p a r t n e r o f p e r l e c a n a n d a s a n e n d o g e n o u s p r o t e i n i n t h e g r o w t h p l a t e U s i n g a c a t i o n i c f i l t r a t i o n b i n d i n g a s s a y w e f u r t h e r c h a r a c t e r i z e d H 3 s i n t e r a c t i o n w i t h p e r l e c a n a s o n e o f h i g h s p e c i f i c i t y d e p e n d e n t p a r t l y o n p e r l e c a n s G A G c h a i n s

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114 E x p e r i m e n t a l P r o c e d u r e s S o u r c e s o f P e r l e c a n A n t i b o d i e s a n d E x t r a c t P e r l e c a n w a s p u r i f i e d f r o m w h o l e f e t a l b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e s w i t h 4 M g u a n i d i n e h y d r o c h l o r i d e e x t r a c t i o n c e s i u m c h l o r i d e d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y a n d i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) A n t i h i s t o n e H 3 a n t i b o d y w a s f r o m U p s t a t e T e c h n o l o g y ( C h a r l o t t e s v i l l e V A U S A ) a n d p e r l e c a n a n t i b o d y ( G P P 7 6 ) w a s f r o m a c o m m e r c i a l s e r v i c e ( t h r o u g h I n v i t r o g e n B i o t e c h ) u s i n g g r o w t h p l a t e p e r l e c a n p u r i f i e d i n o u r l a b G r o w t h p l a t e s w e r e a l s o s l i c e d t r a n s v e r s e l y i n t o s i x s e q u e n t i a l 1 m m t h i c k s e c t i o n s a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( P l a a s a n d S a n d y 1 9 9 3 ) T h e s l i c e s w e r e r i n s e d i n P B S t h e n t h e c e l l s u r f a c e a n d e x t r a c e l l u l a r m a t r i x b i o t i n y l a t e d f o r 3 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h 0 5 m g / m l S u l f o N H S L C B i o t i n ( P i e r c e B i o t e c h n o l o g y R o c k f o r d I L U S A ) i n P B S A f t e r b l o c k i n g t h e u n r e a c t e d a m i n e s w i t h 2 0 m M g l y c i n e a n d a f i n a l r i n s e i n P B S t h e c a r t i l a g e s l i c e s w e r e m i n c e d a n d e x t r a c t e d f o r 1 h o u r a t 4 C i n 5 v o l u m e s o f 1 % B r i j 9 7 e x t r a c t i o n b u f f e r ( 1 % B r i j 9 7 0 1 5 M N a C l 2 0 m M T r i s H C l 2 g / m l l e u p e p t i n 1 0 g / m l a p r o t i n i n 1 m M P M S F ) T h e e x t r a c t w a s c e n t r i f u g e d a n d t h e s o l u b l e m a t e r i a l d i a l y z e d a g a i n s t w a t e r P e r l e c a n A f f i n i t y C h r o m a t o g r a p h y P u r i f i e d g r o w t h p l a t e p e r l e c a n w a s c o n j u g a t e d t o N H S a c t i v a t e d a g a r o s e b e a d s ( G E H e a l t h c a r e U p p s a l a S w e d e n ) f o r u s e a s a n a f f i n i t y c o l u m n O n e m i l l i g r a m o f p e r l e c a n ( o r 1 m g o f B S A a s c o n t r o l ) w a s a d d e d t o a 1 m l b e d v o l u m e o f w a s h e d H C l a c t i v a t e d N H S a g a r o s e s l u r r y i n c o u p l i n g b u f f e r ( 0 2 M N a H C O 3 0 5 M N a C l ) T h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 5 h o u r s

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115 t h e l i q u i d d r a i n e d a n d t h e u n r e a c t e d a m i n e s o n t h e b e a d s b l o c k e d w i t h 0 1 M T r i s H C l o v e r n i g h t a t 4 C T h e b e a d s w e r e w a s h e d s e q u e n t i a l l y w i t h P B S P B S / 1 M N a C l a n d c o l d w a t e r T h e y w e r e t h e n w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h a l t e r n a t i n g p H 1 1 ( 0 1 M N a 2 C O 3 / 0 5 M N a C l ) a n d p H 4 ( 0 1 M s o d i u m a c e t a t e / 0 5 M N a C l ) b u f f e r s A f t e r a w a s h i n 1 0 m M N a 2 C O 3 a n d t h e n i n P B S t h e b e a d s w e r e i n c u b a t e d o v e r n i g h t a t 4 C w i t h t h e 1 % B r i j 9 7 / 0 1 5 M N a C l e x t r a c t o f c e l l s u r f a c e b i o t i n y l a t e d g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e P r o t e i n s w e r e e l u t e d f r o m t h e c o l u m n b y a n o n c o n t i n u o u s g r a d i e n t o f N a C l a t 0 1 5 0 5 1 0 a n d 1 5 M O n e m i l l i l i t e r f r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d a t e a c h g r a d i e n t s t e p : h a l f o f e a c h f r a c t i o n w a s r u n o n S D S P A G E a n d b l o t t e d f o r b i o t i n o r s t a i n e d w i t h C o o m a s s i e T h e b a n d s e l u t i n g a t 1 3 1 9 k D a ( p 1 3 / 1 7 / 1 9 ) o n t h e C o o m a s s i e s t a i n e d g e l o f t h e 1 5 M e l u a t e w e r e e x c i s e d u s i n g a r a z o r b l a d e a n d s e n t t o t h e K e c k F a c i l i t y ( Y a l e U n i v e r s i t y N e w H a v e n C N U S A ) f o r t r y p t i c d i g e s t i o n s e p a r a t i o n o f p e p t i d e s b y r e v e r s e p h a s e c h r o m a t o g r a p h y a n d s e q u e n c i n g o f s e l e c t e d p e p t i d e s G l y c o s i d a s e T r e a t m e n t o f P e r l e c a n O n e m i c r o g r a m o f p e r l e c a n p r o t e i n ( 2 0 0 n g G A G e q u i v a l e n t ) w a s e i t h e r s h a m d i g e s t e d o r d i g e s t e d s e p a r a t e l y w i t h e i t h e r c h o n d r o i t i n a s e A B C ( C a s e 2 0 m U ) t o r e m o v e c h o n d r o i t i n s u l f a t e G A G s o r w i t h H e p a r i t i n a s e s I a n d I I ( H a s e 1 0 m U e a c h ) t o r e m o v e h e p a r a n s u l f a t e G A G s T h e d i g e s t i o n w a s i n 0 2 m l o f d i g e s t i o n b u f f e r ( 2 0 m M T r i s H C l 5 0 m M s o d i u m a c e t a t e 5 m M C a C l 2 a n d 0 2 m g / m l B S A p H 7 4 ) f o r 3 h o u r s a t 3 7 C A l l e n z y m e s a r e f r o m A s s o c i a t e s o f C a p e C o d E a s t F a l m o u t h M A

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116 C a t i o n i c F i l t r a t i o n ( C A F ) A s s a y H i s t o n e b i n d i n g t o p e r l e c a n w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e C A F a s s a y a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( F o r s t e n a n d N u g e n t 2 0 0 1 ) I n b r i e f H i s t o n e H 3 ( H 3 ; R o c h e B i o c h e m I n d i a n a p o l i s I N U S A ) w a s l a b e l e d u s i n g I O D O G e n c o a t e d t u b e s ( P i e r c e B i o t e c h ) a n d s o d i u m i o d i d e ( N a 1 2 5 I P e r k i n E l m e r B o s t o n M A U S A ) b y t h e e s t a b l i s h e d C h i z z o n i t e m e t h o d ( F o r s t e n a n d N u g e n t 2 0 0 1 ) T w o n a n o g r a m s o f 1 2 5 I H 3 w e r e a d d e d t o C A F b u f f e r ( 0 1 5 M N a C l 5 0 m M T r i s 2 m g / m l B S A ) w i t h 8 n g o f g r o w t h p l a t e p e r l e c a n p r o t e i n ( e q u i v a l e n t t o 1 6 n g o f g l y c o s a m i n o g l y c a n s [ G A G ] ) a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d f o r d e t e r m i n i n g p e r l e c a n / F G F i n t e r a c t i o n s ( R i s k e C h i z z o n i t e e t a l 1 9 9 0 ; F o r s t e n a n d N u g e n t 2 0 0 1 ; S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) A s c o m p e t i t o r c h o n d r o i t i n s u l f a t e C o r b o v i n e k i d n e y h e p a r a n s u l f a t e ( S i g m a S t L o u i s M O U S A ) w a s a d d e d a t c o n c e n t r a t i o n s f r o m 0 t o 1 6 0 n g t h a t i s 0 t o 1 0 0 f o l d o f t h e p e r l e c a n G A G e q u i v a l e n t u s e d T h e r e a c t i o n w a s i n c u b a t e d a t 3 0 C b e f o r e f i l t e r i n g t h r o u g h Z e t a P r o b e m e m b r a n e ( B i o R a d H e r c u l e s C A U S A ) a n d c o u n t i n g t h e m e m b r a n e i n a T M A n a l y t i c M o d e l 1 1 9 1 g a m m a c o u n t e r A s c o n t r o l s m a t c h i n g i n c u b a t i o n s w e r e d o n e w i t h o n l y 1 2 5 I H 3 a n d t h e 0 t o 1 6 0 n g o f c o m p e t i t o r b u t n o p e r l e c a n T o i d e n t i f y w h e t h e r t h e b i n d i n g o f t h e r a d i o l a b e l e d h i s t o n e t o p e r l e c a n i n v o l v e d p e r l e c a n s G A G s i d e c h a i n s t h e C A F w a s p e r f o r m e d w i t h 1 2 5 I H 3 a n d s h a m d i g e s t e d C h o n d r o i t i n a s e A B C d i g e s t e d o r H e p a r i t i n a s e d i g e s t e d p e r l e c a n I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y F r o z e n t r a n s v e r s e s e c t i o n s o f w h o l e g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e w e r e f i x e d i n a c e t o n e r i n s e d i n P B S a n d b l o c k e d w i t h 1 % h e a t i n a c t i v a t e d g o a t s e r u m ( H I G S ) a t 3 7 C h u m i d i t y T h e s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d w i t h b o t h m o u s e a n t i H 3 ( U p s t a t e ) a n d r a b b i t a n t i

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117 p e r l e c a n ( G P P 7 6 ) a n t i b o d i e s ( e a c h d i l u t e d 1 : 5 0 i n P B S ) t h e n w i t h b o t h T R I T C c o n j u g a t e d a n t i m o u s e a n d F I T C c o n j u g a t e d a n t i r a b b i t a n t i b o d i e s ( S i g m a ) T h e s l i d e s w e r e m o u n t e d i n a q u e o u s m o u n t i n g m e d i u m ( P i e r c e B i o t e c h ) c o v e r e d s e a l e d a n d t h e f l u o r e s c e n t s i g n a l s d e t e c t e d w i t h a m i c r o s c o p e S t a t i s t i c s A l l m e a s u r e m e n t s i n t h e b i n d i n g a s s a y s a r e r e p o r t e d a s t h e m e a n o f t h r e e o r m o r e r e p l i c a t e s s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n R e s u l t s P e r l e c a n A f f i n i t y C h r o m a t o g r a p h y P o t e n t i a l p e r l e c a n b i n d i n g p r o t e i n s i n t h e d e v e l o p i n g b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e w e r e i s o l a t e d b y b i o t i n y l a t i n g t h e t i s s u e e x t r a c t i n g w i t h m i l d d e t e r g e n t ( B r i j 9 7 ) a p p l y i n g t h e e x t r a c t t o a p e r l e c a n a f f i n i t y c o l u m n a n d e l u t i n g t h e b o u n d p r o t e i n s w i t h a s t e p g r a d i e n t o f i n c r e a s i n g N a C l F i g u r e 1 9 s h o w s a n a n t i b i o t i n W e s t e r n b l o t o f s e l e c t e d f r a c t i o n s e l u t e d f r o m a p e r l e c a n c o l u m n ( + ) a n d a B S A c o n t r o l c o l u m n ( ) T h e b a n d s a t 1 3 1 7 a n d 1 9 k D a t h a t e l u t e d a t h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n s w e r e c o n s i d e r e d s t r o n g b i n d i n g p a r t n e r s o f p e r l e c a n T h e l a n e l a b e l e d s h o w s a C o o m a s s i e b l u e s t a i n o f a 1 5 M s a l t f r a c t i o n f r o m t h e p e r l e c a n a f f i n i t y c o l u m n T h e b a n d s l a b e l e d p 1 3 p 1 7 a n d p 1 9 w e r e e x c i s e d f r o m t h e g e l a n d c h a r a c t e r i z e d b y s e q u e n c i n g T h i s i d e n t i f i e d p 1 3 a s h i s t o n e H 4 p 1 7 a s h i s t o n e H 2 A a n d p 1 9 a s h i s t o n e s H 2 B a n d H 3 ( K e c k f a c i l i t y Y a l e U n i v e r s i t y F i g u r e 1 9 )

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118 C a t i o n i c F i l t r a t i o n A s s a y T h e i n s e t i n F i g u r e 2 0 s h o w s t h a t t h e r e t e n t i o n o f r a d i o l a b e l e d H i s t o n e H 3 o n t h e c a t i o n i c Z e t a p r o b e f i l t e r w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n t h e p r e s e n c e o f p e r l e c a n ( b l a c k b a r ) c o m p a r e d t o i t s r e t e n t i o n i n t h e a b s e n c e o f p e r l e c a n ( w h i t e b a r ) T h e m a i n f i g u r e s h o w s t h a t t h i s i n t e r a c t i o n w a s n o t y e t 5 0 % i n h i b i t e d e v e n w i t h t h e a d d i t i o n o f 1 0 0 f o l d e x c e s s o f c o m p e t i n g c h o n d r o i t i n s u l f a t e a n d h e p a r a n s u l f a t e ( C S a n d H S ) B o t h G A G s p r o d u c e d s i m i l a r i n h i b i t o r y e f f e c t s o n t h e b i n d i n g o f H 3 t o p e r l e c a n T h e e n z y m a t i c r e m o v a l o f c h o n d r o i t i n s u l f a t e G A G s f r o m t h e c o r e p r o t e i n o f p e r l e c a n r e d u c e d i t s b i n d i n g t o r a d i o l a b e l e d h i s t o n e H 3 b y 1 7 % w h e r e a s r e m o v a l o f t h e h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s r e d u c e d t h e b i n d i n g b y 3 8 % ( F i g u r e 2 1 ) I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y T h e l o c a t i o n o f b o t h p e r l e c a n a n d h i s t o n e H 3 i n a r e p r e s e n t a t i v e t r a n s v e r s e s e c t i o n o f t h e g r o w t h p l a t e i s s h o w n a s d e t e r m i n e d b y s t a i n i n g w i t h a n t i b o d i e s t o p e r l e c a n a n d H 3 ( F i g u r e 2 2 ) P e r l e c a n i s l o c a l i z e d t o t h e t e r r i t o r i a l ( o r p e r i c e l l u l a r ) m a t r i x a r o u n d t h e c e l l H i s t o n e H 3 a l s o l o c a l i z e s t o t h i s a r e a i n t h e s e i n t a c t ( i e n o n p e r m e a b i l i z e d ) c e l l s T h e r e a r e a r e a s h o w e v e r ( ) w h e r e e a c h p r o t e i n i s p r e s e n t s e p a r a t e l y f r o m t h e o t h e r T h e d a s h e d r e c t a n g l e s h o w s a t y p i c a l c h o n d r o c y t e ( c l e a r r e g i o n ) w i t h i t s s u r r o u n d i n g t e r r i t o r i a l / p e r i c e l l u l a r m a t r i x d i r e c t l y a r o u n d t h e c e l l I n t h e r i g h t p a n e l s t h e n e g a t i v e c o n t r o l s ( s t a i n e d o n l y w i t h F I T C c o n j u g a t e d o r T R I T C c o n j u g a t e d s e c o n d a r y a n t i b o d y a n d n o p r i m a r y a n t i b o d y ) s h o w e d n o b a c k g r o u n d s t a i n i n g o f t h e s e c t i o n s

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119 D i s c u s s i o n T h e r e s u l t s o f o u r s t u d y i n d i c a t e t h a t h i s t o n e H 3 i s p r e s e n t i n t h e p e r i c e l l u l a r m a t r i x o f t h e c h o n d r o c y t e s i n t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e w h e r e i t c o l o c a l i z e s w i t h t h e p r o t e o g l y c a n p e r l e c a n C h r o m a t o g r a p h y o f a m i l d B r i j 9 7 e x t r a c t o f d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e o v e r a p e r l e c a n a f f i n i t y c o l u m n ( F i g u r e 1 9 ) s h o w e d t h e c o r e h i s t o n e s H 2 A H 2 B H 3 a n d H 4 a s p e r l e c a n b i n d i n g p r o t e i n s P r e v i o u s s c i e n t i f i c s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t h i s t o n e s b o t h f r e e a n d c o m p l e x e d i n t o n u c l e o s o m e s c a n b i n d t o h e p a r i n a n d t o h e p a r a n s u l f a t e ( S c h m i e d e k e S t o c k l e t a l 1 9 8 9 ; B i l o z u r a n d B i s w a s 1 9 9 0 ; W a t s o n G o o d e r h a m e t a l 1 9 9 9 ; H e n r i q u e z C a s a r e t a l 2 0 0 2 ) W a t s o n e t a l ( W a t s o n G o o d e r h a m e t a l 1 9 9 9 ) c o n f i r m e d t h a t h i s t o n e s w e r e p r e s e n t o n t h e p l a s m a m e m b r a n e o f a c t i v a t e d T l y m p h o c y t e s T h i s p r e s e n c e o f n u c l e o s o m e s o n t h e T c e l l p l a s m a m e m b r a n e d e c r e a s e d b y 9 0 % i f t h e c e l l s w e r e d i g e s t e d w i t h h e p a r i n a s e o r h e p a r i t i n a s e e n z y m e s t h a t c l e a v e r e s p e c t i v e l y r e g i o n s o f h i g h a n d l o w s u l f a t i o n i n h e p a r a n s u l f a t e T h e y c o n c l u d e d t h a t h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s k e p t t h e h i s t o n e s b o u n d t o t h e c e l l s u r f a c e S c h m i e d e k e e t a l ( S c h m i e d e k e S t o c k l e t a l 1 9 8 9 ) a l s o s h o w e d b i n d i n g o f h i s t o n e s t o h e p a r a n s u l f a t e I n t h e i r w o r k t h e h e p a r a n s u l f a t e w a s a p a r t o f t h e g l o m e r u l a r b a s e m e n t m e m b r a n e o f t h e k i d n e y t h e o r g a n f r o m w h i c h p e r l e c a n w a s i d e n t i f i e d a s a m a j o r H S P G T h e y e v e n p r o p o s e d t h a t t h e h i s t o n e s p r e s e n t i n n u c l e o s o m e s c i r c u l a t i n g i n t h e k i d n e y c o u l d a t s o m e p o i n t s w i t c h t h e i r n u c l e o s o m a l D N A p a r t n e r f o r t h e g l o m e r u l a r H S P G t o w h i c h t h e y b o u n d m o r e a v i d l y t h a n t o D N A A l s o r e s e a r c h e r s ( B i l o z u r a n d B i s w a s 1 9 9 0 ) h a v e p a r t i a l l y p u r i f i e d a n d c h a r a c t e r i z e d s p e c i f i c h e p a r a n s u l f a t e b i n d i n g p r o t e i n s i n a l u n g c a r c i n o m a c e l l l i n e a n d i d e n t i f i e d t h e m a s h i s t o n e s

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120 T h e b i n d i n g o f h i s t o n e s t o h e p a r a n s u l f a t e w o u l d b e o f l i t t l e p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e i n t i s s u e s i f t h e h i s t o n e s w e r e c o n f i n e d t o t h e c e l l n u c l e u s H o w e v e r h i s t o n e s h a v e b e e n f o u n d i n e x t r a c e l l u l a r m a t r i x i n c y t o p l a s m a n d o n p l a s m a m e m b r a n e o f n o n a p o p t o t i c c e l l s ( M e c h e r i D a n n e c k e r e t a l 1 9 9 3 ; W a t s o n E d w a r d s e t a l 1 9 9 5 ; H e n r i q u e z C a s a r e t a l 2 0 0 2 ) H e n r i q u e z e t a l h a v e s h o w n h i s t o n e H 1 t o b e i n s k e l e t a l m u s c l e c e l l e x t r a c e l l u l a r m a t r i x w h e r e i t c o l o c a l i z e s w i t h p e r l e c a n ( H e n r i q u e z C a s a r e t a l 2 0 0 2 ) M e c h e r i e t a l f o u n d t h a t t h e n u c l e o s o m a l c o r e h i s t o n e H 2 B w a s e x p r e s s e d s t r o n g l y o n t h e s u r f a c e o f B c e l l s i s o l a t e d f r o m h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d ( M e c h e r i D a n n e c k e r e t a l 1 9 9 3 ) W a t s o n e t a l h a v e a l s o d o c u m e n t e d t h e p r e s e n c e o f h i s t o n e s o n T c e l l s u r f a c e ( W a t s o n E d w a r d s e t a l 1 9 9 5 ) T h e s e p r e v i o u s r e s u l t s h e l p t o s u p p o r t o u r f i n d i n g s t h a t t h e h i s t o n e s c a n e x i s t e x t r a c e l l u l a r l y i n c h o n d r o c y t e s T h e l a b e l i n g o f t h e h i s t o n e s b y t h e c e l l i m p e r m e a b l e b i o t i n y l a t i o n r e a g e n t S u l f o N H S L C b i o t i n ( F i g u r e 1 9 ) t h e i r e x t r a c t i o n f r o m c a r t i l a g e w i t h t h e m i l d B r i j 9 7 d e t e r g e n t a n d t h e i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x i n d i c a t e s t h a t t h e h i s t o n e s a r e i n t h e g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e m a t r i x i n t h e s a m e r e g i o n a s p e r l e c a n T h e i n t e r a c t i o n o f p e r l e c a n w i t h h i s t o n e H 3 w a s c h a r a c t e r i z e d u s i n g t h e c a t i o n i c f i l t r a t i o n a s s a y ( F i g u r e s 2 0 a n d 2 1 ) T h e b i n d i n g c u r v e s s h o w t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n H 3 a n d p e r l e c a n : 5 0 % i n h i b i t i o n o f t h i s b i n d i n g w a s n o t r e a c h e d e v e n w i t h a d d i t i o n o f 1 0 0 f o l d c o m p e t i n g c h o n d r o i t i n s u l f a t e a n d h e p a r a n s u l f a t e ( F i g u r e 2 0 ) H i s t o n e H 3 h a s b e e n s h o w n t o b i n d h e p a r a n s u l f a t e i n l u n g t i s s u e ( B i l o z u r a n d B i s w a s 1 9 9 0 ) H o w e v e r i n o u r a s s a y i t s e e m s t o b e b i n d i n g p e r l e c a n s c h o n d r o i t i n s u l f a t e G A G s a s w e l l T h e C A F a s s a y a l s o s h o w s t h a t t h e r e r e m a i n s s o m e b i n d i n g t h a t c a n n o t b e i n h i b i t e d c o m p l e t e l y b y c o m p e t i n g G A G s a n d t h a t r e m o v a l o f

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121 c h o n d r o i t i n s u l f a t e f r o m p e r l e c a n r e d u c e d i t s b i n d i n g t o r a d i o l a b e l e d h i s t o n e H 3 b y 1 7 % a n d r e m o v a l o f t h e h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s r e d u c e d t h e b i n d i n g b y 3 8 % b u t d i d n o t e l i m i n a t e b i n d i n g ( F i g u r e 2 1 ) T h i s s u g g e s t s t h a t t h e c o r e p r o t e i n o f p e r l e c a n i s c o n t r i b u t i n g t o t h e b i n d i n g o f h i s t o n e H 3 T h e i m m u n o s t a i n i n g o f t h e g r o w t h p l a t e s h o w s p a r t i a l o v e r l a y o f h i s t o n e H 3 a n d p e r l e c a n ( F i g 2 2 ) g i v i n g m o r e s u p p o r t t o t h e i n v i t r o i n t e r a c t i o n s e e n b e t w e e n t h e t w o T h e r e i s n o s i g n a l f o r t h e p r o t e i n s o n t h e c h o n d r o c y t e i t s e l f ( t h e c l e a r r e g i o n i n t h e d a s h e d r e c t a n g l e ) b u t s t a i n i n g i s a p p a r e n t i n t h e m a t r i x i m m e d i a t e l y s u r r o u n d i n g t h e c e l l ( t e r r i t o r i a l o r p e r i c e l l u l a r m a t r i x ) a n d i n t h e i n t e r t e r r i t o r i a l m a t r i x b e t w e e n t h e c e l l s T h e r e i s b o t h m o r e i n t e n s e a n d m o r e w i d e l y d i s t r i b u t e d s t a i n i n g f o r p e r l e c a n t h a n f o r h i s t o n e H 3 w h i c h i s e x p e c t e d s i n c e p e r l e c a n i s k n o w n t o b e t h e m a j o r H S P G i n t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x o f t h e g r o w t h p l a t e ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) a n d i s c o n s i d e r e d t o b e a s t r u c t u r a l c o m p o n e n t a s w e l l N o t e t h a t d e s p i t e t h e e x t e n s i v e c o l o c a l i z a t i o n o f t h e t w o p r o t e i n s t h e r e a r e s t i l l a r e a s w h e r e o n l y p e r l e c a n ( g r e e n ) o r H 3 ( r e d ) f l u o r e s c e n c e i s d e t e c t e d A n u m b e r o f s t u d i e s h a v e s h o w n t h e b i n d i n g o f h i s t o n e s t o h e p a r a n s u l f a t e a n d p e r l e c a n ( S c h m i e d e k e S t o c k l e t a l 1 9 8 9 ; B i l o z u r a n d B i s w a s 1 9 9 0 ; W a t s o n G o o d e r h a m e t a l 1 9 9 9 ; H e n r i q u e z C a s a r e t a l 2 0 0 2 ) H o w e v e r o u r i d e n t i f i c a t i o n o f h i s t o n e H 3 i n t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e a n d t h e i n v o l v e m e n t o f t h e G A G c h a i n s a n d t h e c o r e p r o t e i n o f p e r l e c a n i n H 3 b i n d i n g a r e n o v e l f i n d i n g s F u r t h e r m o r e t h e d i s c o v e r y o f t h e h i s t o n e s p r o x i m i t y t o p e r l e c a n i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e s u p p o r t s t h e p o s s i b i l i t y o f i n v i v o i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e t w o T h e s e d a t a h i g h l i g h t n e w p o s s i b i l i t i e s f o r d e s c r i b i n g t h e f u n c t i o n o f p e r l e c a n i n c e l l p r o l i f e r a t i o n n o t o n l y t h r o u g h g r o w t h f a c t o r s a n d c e l l s i g n a l i n g m o l e c u l e s ( I o z z o C o h e n e t a l 1 9 9 4 ; M o n g i a t T a y l o r e t a l 2 0 0 0 ; G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 6 ; S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) b u t a l s o v i a e l e m e n t s o f t h e

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122 t r a n s c r i p t i o n a l m a c h i n e r y i t s e l f T h i s i n t e r a c t i o n c o u l d a l l o w p e r l e c a n t o e x e r t a d i r e c t l e v e l o f c o n t r o l o n c h o n d r o c y t e a c t i v i t y a s h a s p r e v i o u s l y b e e n s h o w n f o r p e r l e c a n a n d h i s t o n e H 1 i n r e g e n e r a t i n g m u s c l e c e l l s ( H e n r i q u e z C a s a r e t a l 2 0 0 2 ) I n t e r e s t i n g l y i n a d d i t i o n t o o u r d a t a s h o w i n g h i s t o n e H 3 s c o o c c u r r e n c e a n d i n t e r a c t i o n w i t h p e r l e c a n i n t h e g r o w t h p l a t e t h e c h r o m a t i n a s s o c i a t i n g p r o t e i n s h i s t o n e d e a c e t y l a s e ( H D A C ) 3 a n d H D A C 4 a r e a l s o k n o w n t o a f f e c t c h o n d r o c y t e a c t i v i t y a n d l o n g b o n e g r o w t h H D A C 3 w h i c h r e m o v e s a c e t y l g r o u p s f r o m t h e c o r e h i s t o n e s t o c a u s e g e n e r e p r e s s i o n i s k n o w n t o r e g u l a t e o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n a n d b o n e f o r m a t i o n b y i n h i b i t i n g t h e o s t e o c a l c i n g e n e v i a t h e c h o n d r o c y t e s p e c i f i c r u n x 2 t r a n s c r i p t i o n f a c t o r ( S c h r o e d e r K a h l e r e t a l 2 0 0 4 ) O s t e o b l a s t s a r e t h e c e l l s t h a t r e p l a c e t h e m i n e r a l i z e d c a r t i l a g e m a t r i x p r o d u c e d b y g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s w i t h a c o l l a g e n r i c h m a t r i x l e a d i n g t o t h e f o r m a t i o n o f n e w b o n e H D A C 4 i s a l s o k n o w n t o c o n t r o l b o n e f o r m a t i o n v i a r u n x 2 b y i n h i b i t i n g t h e h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e p h e n o t y p e a l l o w i n g p r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e s t o a v o i d p r e m a t u r e h y p e r t r o p h y a n d t h u s p r e m a t u r e c a r t i l a g e o s s i f i c a t i o n ( V e g a M a t s u d a e t a l 2 0 0 4 ) O n e m e c h a n i s m b y w h i c h H D A C 4 d o e s t h i s i s b y s u p p r e s s i n g a c e t y l a t i o n o f h i s t o n e H 3 o n t h e r u n x 2 p r o m o t e r W i t h H D A C 4 a b s e n t i n a m o u s e k n o c k o u t m o d e l t h e r e i s n o d e a c e t y l a t i o n o f H 3 o n t h e r u n x 2 p r o m o t e r a n d t h e r u n x 2 g e n e b e c o m e s a c t i v e l e a d i n g t o p r e m a t u r e h y p e r t r o p h y o f c h o n d r o c y t e s a n d t h u s p r e m a t u r e o s s i f i c a t i o n o f s k e l e t a l e l e m e n t s B e c a u s e o f t h i s t h e H D A C 4 n u l l m i c e s u f f e r f r o m f e t a l d w a r f i s m d e c r e a s e d m o b i l i t y d u e t o b o n e m a l f o r m a t i o n a n d a n i n a b i l i t y t o b r e a t h e d u e t o t h o r a c i c d e f o r m i t i e s c h a r a c t e r i s t i c s a l l s e e n i n t h e p e r l e c a n k n o c k o u t m o u s e m o d e l P e r h a p s t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n p e r l e c a n a n d h i s t o n e H 3 a l s o i n v o l v e H D A C 4 a n d r u n x 2 i n c o n t r o l l i n g a s p e c t s o f t h e c o m p l e x m e c h a n i s m o f l o n g b o n e g r o w t h

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123 A c k n o w l e d g m e n t T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e S h r i n e r s H o s p i t a l s f o r C h i l d r e n N o r t h A m e r i c a ( t o J R H )

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124 F i g u r e s F i g u r e 1 9 A f f i n i t y p u r i f i c a t i o n o f p e r l e c a n s b i n d i n g p a r t n e r s A n t i b i o t i n w e s t e r n b l o t o f s e l e c t e d f r a c t i o n s f r o m a m i l d d e t e r g e n t e x t r a c t i n c u b a t e d o v e r a p e r l e c a n a f f i n i t y c o l u m n ( + ) o r a c o n t r o l B S A c o u p l e d c o l u m n ( ) a r e s h o w n T h e 0 1 5 M w a s h e s a n d s e l e c t e d s a l t e l u a t e s a t 0 5 M a n d 1 0 M a r e s h o w n T h e b a n d s f o r p 1 3 p 1 7 a n d p 1 9 a r e i n d i c a t e d i n t h e l a n e l a b e l e d s h o w i n g a C o o m a s s i e s t a i n o f a 1 5 M e l u a t e f r a c t i o n T h e p 1 3 / 1 7 / 1 9 b a n d s w e r e i n d i v i d u a l l y e x c i s e d a n d s e n t t o t h e K e c k f a c i l i t y f o r s e q u e n c i n g

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125 F i g u r e 2 0 C a t i o n i c F i l t r a t i o n ( C A F ) A s s a y s s h o w t h a t p e r l e c a n b i n d s t o 1 2 5 I h i s t o n e H 3 T h e b i n d i n g o f H 3 w i t h o u t ( ) a n d w i t h ( + ) 8 n g o f p e r l e c a n i s s h o w n i n C P M i n t h e i n s e t S p e c i f i c b i n d i n g i s t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n b i n d i n g o f H 3 t o t h e Z e t a P r o b e m e m b r a n e w i t h p e r l e c a n i n t h e r e a c t i o n m i n u s t h e n o n s p e c i f i c b i n d i n g t o t h e Z e t a P r o b e a l o n e T h e s p e c i f i c b i n d i n g t o p e r l e c a n i s c a l c u l a t e d a n d s h o w n a s % o f c o n t r o l i n t h e p r e s e n c e o f c o m p e t i t o r s i n t h e m a i n f i g u r e U n l a b e l e d c o m p e t i t o r s w e r e e i t h e r c h o n d r o i t i n s u l f a t e C ( C S ) o r b o v i n e k i d n e y h e p a r a n s u l f a t e ( H S )

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126 F i g u r e 2 1 E f f e c t o f c h o n d r o i t i n a s e a n d h e p a r i t i n a s e p r e t r e a t m e n t o n t h e b i n d i n g o f p e r l e c a n t o 1 2 5 I h i s t o n e H 3 E i g h t n a n o g r a m s o f p e r l e c a n w a s f i r s t d i g e s t e d w i t h C h o n d r o i t i n a s e A B C o r w i t h H e p a r i t i n a s e I a n d I I f o r 3 h o u r s a t 3 7 C o r w a s l e f t u n d i g e s t e d b e f o r e b e i n g u s e d i n t h e C A F a s s a y s

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127 F i g u r e 2 2 I m m u n o l o c a l i z a t i o n o f H i s t o n e H 3 a n d P e r l e c a n i n t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y o f g r o w t h p l a t e s e c t i o n s s h o w s t h e p r e s e n c e o f p e r l e c a n ( g r e e n ) a n d h i s t o n e H 3 ( r e d ) T h e m e r g e d i m a g e s h o w s t h e c o l o c a l i z a t i o n o f t h e t w o p r o t e i n s ( y e l l o w / o r a n g e c o l o r ) a n d s e l e c t e d a r e a s w h e r e t h e t w o a r e s e p a r a t e ( ) A r e p r e s e n t a t i v e c h o n d r o c y t e i s o u t l i n e d w i t h a d a s h e d r e c t a n g l e i n e a c h p a n e l I n t h e t o p p a n e l t h e c l e a r c h o n d r o c y t e c e l l b o d y a n d t h e s t a i n e d p e r i c e l l u l a r / t e r r i t o r i a l m a t r i x a r o u n d t h e c e l l a r e s h o w n S c a l e b a r s = 1 0 m i c r o n T h e r i g h t p a n e l s s h o w t h e c o n t r o l s t a i n i n g w i t h o n l y l a b e l e d s e c o n d a r y a n t i b o d y b u t n o p r i m a r y

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128 R e f e r e n c e s F o r P a p e r I I I A r i k a w a H i r a s a w a E A H L e e t a l ( 2 0 0 2 ) S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l m u t a t i o n s o f t h e p e r l e c a n g e n e c a u s e S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e w i t h m y o t o n i c m y o p a t h y a n d c h o n d r o d y s p l a s i a A m J H u m G e n e t 7 0 ( 5 ) : 1 3 6 8 7 5 A r i k a w a H i r a s a w a E H W a t a n a b e e t a l ( 1 9 9 9 ) P e r l e c a n i s e s s e n t i a l f o r c a r t i l a g e a n d c e p h a l i c d e v e l o p m e n t N a t G e n e t 2 3 ( 3 ) : 3 5 4 8 A r i k a w a H i r a s a w a E W R W i l c o x e t a l ( 2 0 0 1 ) D y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e i s c a u s e d b y f u n c t i o n a l n u l l m u t a t i o n s o f t h e p e r l e c a n g e n e N a t G e n e t 2 7 ( 4 ) : 4 3 1 4 A r i k a w a H i r a s a w a E a n d Y Y a m a d a ( 2 0 0 1 ) [ R o l e s o f p e r l e c a n i n d e v e l o p m e n t a n d d i s e a s e : s t u d i e s i n k n o c k o u t m i c e a n d h u m a n d i s o r d e r s ] S e i k a g a k u 7 3 ( 1 0 ) : 1 2 5 7 6 1 A v i e z e r D D H e c h t e t a l ( 1 9 9 4 ) P e r l e c a n b a s a l l a m i n a p r o t e o g l y c a n p r o m o t e s b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r b i n d i n g m i t o g e n e s i s a n d a n g i o g e n e s i s C e l l 7 9 ( 6 ) : 1 0 0 5 1 3 B i l o z u r M E a n d C B i s w a s ( 1 9 9 0 ) I d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f h e p a r a n s u l f a t e b i n d i n g p r o t e i n s f r o m h u m a n l u n g c a r c i n o m a c e l l s J B i o l C h e m 2 6 5 ( 3 2 ) : 1 9 6 9 7 7 0 3 B o r k P a n d L P a t t h y ( 1 9 9 5 ) T h e S E A m o d u l e : a n e w e x t r a c e l l u l a r d o m a i n a s s o c i a t e d w i t h O g l y c o s y l a t i o n P r o t e i n S c i 4 ( 7 ) : 1 4 2 1 5 C o s t e l l M E G u s t a f s s o n e t a l ( 1 9 9 9 ) P e r l e c a n m a i n t a i n s t h e i n t e g r i t y o f c a r t i l a g e a n d s o m e b a s e m e n t m e m b r a n e s J C e l l B i o l 1 4 7 ( 5 ) : 1 1 0 9 2 2 F o r s t e n K E a n d M A N u g e n t ( 2 0 0 1 ) B i n d i n g c o n s t a n t m e a s u r e m e n t s f o r i n h i b i t o r s o f g r o w t h f a c t o r b i n d i n g t o h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s M e t h o d s M o l B i o l 1 7 1 : 4 1 5 2 6 F r e n c h M M S E S m i t h e t a l ( 1 9 9 9 ) E x p r e s s i o n o f t h e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n p e r l e c a n d u r i n g m o u s e e m b r y o g e n e s i s a n d p e r l e c a n c h o n d r o g e n i c a c t i v i t y i n v i t r o J C e l l B i o l 1 4 5 ( 5 ) : 1 1 0 3 1 5

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129 G o v i n d r a j P L W e s t e t a l ( 2 0 0 2 ) I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e m a j o r h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s i n t h e d e v e l o p i n g b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e J B i o l C h e m 2 7 7 ( 2 2 ) : 1 9 4 6 1 9 G o v i n d r a j P L W e s t e t a l ( 2 0 0 6 ) M o d u l a t i o n o f F G F 2 b i n d i n g t o c h o n d r o c y t e s f r o m t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e b y p e r l e c a n M a t r i x B i o l 2 5 ( 4 ) : 2 3 2 9 H a n d l e r M P D Y u r c h e n c o e t a l ( 1 9 9 7 ) D e v e l o p m e n t a l e x p r e s s i o n o f p e r l e c a n d u r i n g m u r i n e e m b r y o g e n e s i s D e v D y n 2 1 0 ( 2 ) : 1 3 0 4 5 H a s s e l l J Y Y a m a d a e t a l ( 2 0 0 2 ) R o l e o f p e r l e c a n i n s k e l e t a l d e v e l o p m e n t a n d d i s e a s e s G l y c o c o n j J 1 9 ( 4 5 ) : 2 6 3 7 H e n r i q u e z J P J C C a s a r e t a l ( 2 0 0 2 ) E x t r a c e l l u l a r m a t r i x h i s t o n e H 1 b i n d s t o p e r l e c a n i s p r e s e n t i n r e g e n e r a t i n g s k e l e t a l m u s c l e a n d s t i m u l a t e s m y o b l a s t p r o l i f e r a t i o n J C e l l S c i 1 1 5 ( P t 1 0 ) : 2 0 4 1 5 1 H u n t l e y J S P G B u s h e t a l ( 2 0 0 3 ) L o o k i n g a t t h e l i v i n g h u m a n g r o w t h p l a t e C m a j 1 6 8 ( 4 ) : 4 5 9 6 0 I o z z o R V ( 1 9 9 4 ) P e r l e c a n : a g e m o f a p r o t e o g l y c a n M a t r i x B i o l 1 4 ( 3 ) : 2 0 3 8 I o z z o R V I R C o h e n e t a l ( 1 9 9 4 ) T h e b i o l o g y o f p e r l e c a n : t h e m u l t i f a c e t e d h e p a r a n s u l p h a t e p r o t e o g l y c a n o f b a s e m e n t m e m b r a n e s a n d p e r i c e l l u l a r m a t r i c e s B i o c h e m J 3 0 2 ( P t 3 ) : 6 2 5 3 9 I o z z o R V J P i l l a r i s e t t i e t a l ( 1 9 9 7 ) S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e h u m a n p e r l e c a n g e n e p r o m o t e r T r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n b y t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a v i a a n u c l e a r f a c t o r 1 b i n d i n g e l e m e n t J B i o l C h e m 2 7 2 ( 8 ) : 5 2 1 9 2 8 M e c h e r i S G D a n n e c k e r e t a l ( 1 9 9 3 ) A n t i h i s t o n e a u t o a n t i b o d i e s r e a c t s p e c i f i c a l l y w i t h t h e B c e l l s u r f a c e M o l I m m u n o l 3 0 ( 6 ) : 5 4 9 5 7 M o n g i a t M K T a y l o r e t a l ( 2 0 0 0 ) T h e p r o t e i n c o r e o f t h e p r o t e o g l y c a n p e r l e c a n b i n d s s p e c i f i c a l l y t o f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 7 J B i o l C h e m 2 7 5 ( 1 0 ) : 7 0 9 5 1 0 0

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130 N o o n a n D M A F u l l e e t a l ( 1 9 9 1 ) T h e c o m p l e t e s e q u e n c e o f p e r l e c a n a b a s e m e n t m e m b r a n e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n r e v e a l s e x t e n s i v e s i m i l a r i t y w i t h l a m i n i n A c h a i n l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n r e c e p t o r a n d t h e n e u r a l c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e J B i o l C h e m 2 6 6 ( 3 4 ) : 2 2 9 3 9 4 7 P l a a s A H a n d J D S a n d y ( 1 9 9 3 ) A c a r t i l a g e e x p l a n t s y s t e m f o r s t u d i e s o n a g g r e c a n s t r u c t u r e b i o s y n t h e s i s a n d c a t a b o l i s m i n d i s c r e t e z o n e s o f t h e m a m m a l i a n g r o w t h p l a t e M a t r i x 1 3 ( 2 ) : 1 3 5 4 7 R i s k e F R C h i z z o n i t e e t a l ( 1 9 9 0 ) M e a s u r e m e n t o f b i o l o g i c a l l y a c t i v e i n t e r l e u k i n 1 b y a s o l u b l e r e c e p t o r b i n d i n g a s s a y A n a l B i o c h e m 1 8 5 ( 2 ) : 2 0 6 1 2 S c h m i e d e k e T M F W S t o c k l e t a l ( 1 9 8 9 ) H i s t o n e s h a v e h i g h a f f i n i t y f o r t h e g l o m e r u l a r b a s e m e n t m e m b r a n e R e l e v a n c e f o r i m m u n e c o m p l e x f o r m a t i o n i n l u p u s n e p h r i t i s J E x p M e d 1 6 9 ( 6 ) : 1 8 7 9 9 4 S c h r o e d e r T M R A K a h l e r e t a l ( 2 0 0 4 ) H i s t o n e d e a c e t y l a s e 3 i n t e r a c t s w i t h r u n x 2 t o r e p r e s s t h e o s t e o c a l c i n p r o m o t e r a n d r e g u l a t e o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n J B i o l C h e m 2 7 9 ( 4 0 ) : 4 1 9 9 8 2 0 0 7 S m i t h S a n d J R H a s s e l l ( 2 0 0 6 ) F o c u s o n m o l e c u l e s : p e r l e c a n ( H S P G 2 ) E x p E y e R e s 8 3 ( 3 ) : 4 7 1 2 S m i t h S M L A W e s t e t a l ( 2 0 0 6 ) H e p a r a n a n d c h o n d r o i t i n s u l f a t e o n g r o w t h p l a t e p e r l e c a n m e d i a t e b i n d i n g a n d d e l i v e r y o f F G F 2 t o F G F r e c e p t o r s M a t r i x B i o l S u n d a r R a j N D F i t e e t a l ( 1 9 9 5 ) P e r l e c a n i s a c o m p o n e n t o f c a r t i l a g e m a t r i x a n d p r o m o t e s c h o n d r o c y t e a t t a c h m e n t J C e l l S c i 1 0 8 ( P t 7 ) : 2 6 6 3 7 2 V e g a R B K M a t s u d a e t a l ( 2 0 0 4 ) H i s t o n e d e a c e t y l a s e 4 c o n t r o l s c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y d u r i n g s k e l e t o g e n e s i s C e l l 1 1 9 ( 4 ) : 5 5 5 6 6 W a t s o n K R J E d w a r d s e t a l ( 1 9 9 5 ) E x t r a n u c l e a r l o c a t i o n o f h i s t o n e s i n a c t i v a t e d h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s a n d c u l t u r e d T c e l l s B i o c h e m P h a r m a c o l 5 0 ( 3 ) : 2 9 9 3 0 9 W a t s o n K N J G o o d e r h a m e t a l ( 1 9 9 9 ) N u c l e o s o m e s b i n d t o c e l l s u r f a c e p r o t e o g l y c a n s J B i o l C h e m 2 7 4 ( 3 1 ) : 2 1 7 0 7 1 3

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131 C H A P T E R T H R E E C O N C L U S I O N S T h e g r o w t h p l a t e i s t h e p r i m a r y r e g u l a t o r o f e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h i n h u m a n s a n d a n i m a l s E n d o c h o n d r a l b o n e s a r e f o r m e d f r o m a c a r t i l a g e i n t e r m e d i a t e t h a t i s s e c r e t e d b y c e l l s i n t h e g r o w t h p l a t e ( c h o n d r o c y t e s ) a n d u s e d a s a t e m p l a t e f o r b o n e p r o d u c t i o n ( P i n e s a n d H u r w i t z 1 9 9 1 ) T h e f o r m a t i o n o f c h o n d r o c y t e s f r o m m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s ( M S C s ) i s a c o o r d i n a t e d p r o c e s s r e g u l a t e d m a i n l y b y t h e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r S o x 9 ( H u a n g C h u n g e t a l 2 0 0 1 ) A l t h o u g h t h e g r o w t h p l a t e h a s o n l y a s i n g l e c e l l t y p e t h e c h o n d r o c y t e t h e r e a r e t h r e e t r a n s v e r s e z o n e s o f c h o n d r o c y t e s a t d i f f e r e n t s t a g e s o f a c t i v i t y a n d m a t u r i t y r a n g i n g f r o m t h e q u i e s c e n t s t e m l i k e r e s t i n g c h o n d r o c y t e s n e a r e s t t h e e p i p h y s e a l b o n e t o t h e a c t i v e l y r e p l i c a t i n g p r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e s a n d t h e l a r g e r l e s s a c t i v e h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s T h i s l a s t z o n e o f c e l l s s e c r e t e s t h e m a t r i x t h a t b o n e f o r m i n g c e l l s ( o s t e o b l a s t s ) r e m o d e l i n t o n e w b o n e ( F a r n u m a n d W i l s m a n 1 9 8 9 ; M i n i n a K r e s c h e l e t a l 2 0 0 2 ) T h e a c t i v i t y o f t h e c h o n d r o c y t e s i n t h e g r o w t h p l a t e i s a l s o t i g h t l y c o n t r o l l e d w i t h m u l t i p l e e n v i r o n m e n t a l g e n e t i c h o r m o n a l a n d e v e n n u t r i t i o n a l f a c t o r s a f f e c t i n g t h e a c t i v i t y o f t h e s e c e l l s P r o t e o g l y c a n s p l a y i m p o r t a n t r o l e s i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n A g g r e c a n i s t h e m a j o r

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132 p r o t e o g l y c a n i n c a r t i l a g e I t c o n t a i n s o v e r 1 0 0 c h o n d r o i t i n s u l f a t e ( C S ) c h a i n s t h a t b i n d w a t e r a n d s e r v e t o p r o v i d e t h e v o l u m e o f t h e g r o w t h p l a t e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( E C M ) N a t u r a l a g g r e c a n k n o c k o u t s ( R i t t e n h o u s e D u n n e t a l 1 9 7 8 ; L i S c h w a r t z e t a l 1 9 9 3 ; W a t a n a b e K i m a t a e t a l 1 9 9 4 ) h a v e s h o r t l i m b s d u e t o t h e r e d u c e d s i z e o f t h e E C M i n t h e g r o w t h p l a t e P r o t e o g l y c a n s a r e a l s o e s s e n t i a l i n t h e i r b i n d i n g o f g r o w t h f a c t o r s i n c a r t i l a g e p r o t e c t i n g t h e g r o w t h f a c t o r s f r o m d e g r a d a t i o n a n d a l s o s e r v i n g t o a l t e r n a t e l y s e q u e s t e r g r o w t h f a c t o r s f r o m o r d e l i v e r t h e m t o t h e i r g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r s ( K n u d s o n a n d K n u d s o n 2 0 0 1 ) P e r l e c a n i s t h e p r i m a r y h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n ( H S P G ) i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 2 ) M o u s e m o d e l s h a v e p r o v e n t h a t p e r l e c a n i s e s s e n t i a l f o r g r o w t h p l a t e s t r u c t u r e a n d f o r p r o p e r e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h ( A r i k a w a H i r a s a w a W a t a n a b e e t a l 1 9 9 9 ; C o s t e l l G u s t a f s s o n e t a l 1 9 9 9 ) T h e m a j o r e f f e c t o f p e r l e c a n i n l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h i s o n p r o l i f e r a t i o n P e r l e c a n a f f e c t s g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n v i a t h e g r o w t h f a c t o r s t h a t t h i s m u l t i d o m a i n p r o t e o g l y c a n b i n d s n o t o n l y o n t h e v a r i o u s r e g i o n s o f i t s c o r e p r o t e i n b u t a l s o o n t h e g l y c o s a m i n o g l y c a n ( G A G ) c h a i n s a t t a c h e d t o i t s c o r e p r o t e i n ( I o z z o C o h e n e t a l 1 9 9 4 ) T h e t y p e s i z e a n d s e q u e n c e o f t h e G A G s o n p e r l e c a n v a r y d e p e n d i n g o n t h e t i s s u e o r i g i n I n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e p e r l e c a n h a s c h o n d r o i t i n s u l f a t e ( C S ) c h a i n s o f 3 7 4 2 k D a a n d h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s o f 2 0 2 2 k D a ( W e s t G o v i n d r a j e t a l 2 0 0 6 ) T h e C S c h a i n s a c c o u n t f o r 7 5 % o f t h e t o t a l G A G o n p e r l e c a n a n d t h e H S a c c o u n t s f o r t h e o t h e r 2 5 %

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133 P a p e r I W e p r e v i o u s l y k n e w t h a t p e r l e c a n H S c o u l d b i n d F G F 2 b u t c o u l d n o t d e l i v e r i t t o i t s g r o w t h p l a t e F G F R ( G o v i n d r a j W e s t e t a l 2 0 0 6 ) F G F 2 i s a p l e i o t r o p i c g r o w t h f a c t o r t h a t i s p r e s e n t i n c a r t i l a g e a n d n e g a t i v e l y r e g u l a t e s g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n s i n c e m i c e o v e r e x p r e s s i n g F G F 2 a r e s k e l e t a l d w a r v e s I n P a p e r I o f t h i s d i s s e r t a t i o n ( S m i t h W e s t e t a l 2 0 0 6 ) w e u s e d t h e c a t i o n i c f i l t r a t i o n ( C A F ) a n d i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) b i n d i n g a s s a y s t o s h o w t h a t p e r l e c a n p u r i f i e d f r o m t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e b o u n d t o F G F 2 i n d e p e n d e n t l y o f a n y o t h e r g r o w t h p l a t e m o l e c u l e s ( F i g u r e 5 ) W e f o u n d t h a t t h e F G F 2 b i n d i n g w a s p r i m a r i l y t o t h e H S c h a i n s o f p e r l e c a n ( F i g u r e s 6 a n d 7 ) D i g e s t i o n o f t h e H S c h a i n s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d F G F 2 b i n d i n g t o p e r l e c a n ( F i g u r e 6 ) a n d b o v i n e k i d n e y ( b k ) H S a s a c o m p e t i t o r r e d u c e d p e r l e c a n : F G F 2 b i n d i n g b y 9 0 % ( F i g u r e 7 ) W e c o n c l u d e d t h e n t h a t t h e H S c h a i n s o f p e r l e c a n a r e t h e e s s e n t i a l p l a y e r s i n t h e m a x i m a l b i n d i n g o f F G F 2 t o p e r l e c a n W e a l s o s h o w e d t h a t h e p a r i n c o u l d e n h a n c e t h e b i n d i n g o f F G F 2 t o i t s c e l l s u r f a c e F G F R c o n f i r m i n g a p r e v i o u s l y s h o w n r e l a t i o n s h i p ( O r n i t z Y a y o n e t a l 1 9 9 2 ) W e c o n c l u d e d f r o m t h e s e e x p e r i m e n t s ( F i g u r e s 1 0 a n d 1 1 ) t h a t p e r l e c a n c o u l d b i n d F G F 2 b u t c o u l d n o t d e l i v e r i t t o F G F R 1 a n d 3 u n l e s s t h e C S c h a i n s w e r e r e m o v e d F G F R 1 a n d 3 a r e t h e g r o w t h p l a t e F G F R s a n d a r e d i r e c t r e g u l a t o r s o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n ( S h i a n g T h o m p s o n e t a l 1 9 9 4 ; M u e n k e a n d S c h e l l 1 9 9 5 ; W h i t e C a b r a l e t a l 2 0 0 5 ) W e t h u s c o n c l u d e d t h a t t h e C S c h a i n s o n d o m a i n s I a n d V o f g r o w t h p l a t e p e r l e c a n ( i e t h e N a n d C t e r m i n a l e n d s ) p r e v e n t d e l i v e r y o f t h e H S b o u n d F G F 2 t o i t s F G F R W e s p e c u l a t e t h a t t h i s i s d u e t o t h e l a r g e r s i z e o f t h e C S c h a i n s w h i c h c o u l d s t e r i c a l l y h i n d e r t h e

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134 t r a n s f e r o f t h e H S b o u n d F G F 2 t o F G F R 1 a n d 3 T h e s u b s t i t u t i o n o f g r o w t h p l a t e p e r l e c a n w i t h C S i s t h u s a r e g u l a t o r o f t h e d e l i v e r y v e r s u s s e q u e s t r a t i o n a c t i v i t i e s o f p e r l e c a n i n t h e g r o w t h p l a t e a n d t h u s c o n t r o l s t h e a c t i o n o f g r o w t h f a c t o r s o n t h e c h o n d r o c y t e s T h e F G F 2 : F G F R 3 m e d i a t e d p a t h w a y o f G P c h o n d r o c y t e i n h i b i t i o n i n v o l v e s I n d i a n h e d g e h o g ( I h h ) ; w h e n F G F R 3 i s b o u n d b y g r o w t h f a c t o r s i t i n h i b i t s I h h e x p r e s s i o n a n d p r e v e n t s c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n ( M i n i n a K r e s c h e l e t a l 2 0 0 2 ) I t w o u l d b e i n t e r e s t i n g t o s e e t h e d y n a m i c s o f t h i s F G F 2 : F G F R 3 : I h h : p e r l e c a n r e l a t i o n s h i p W e k n o w t h a t p e r l e c a n H S c a n b i n d F G F 2 a n d i s a n e c e s s a r y c o f a c t o r i n t h e s u b s e q u e n t b i n d i n g o f F G F 2 t o F G F R 3 ( O r n i t z 2 0 0 0 ; O r n i t z a n d M a r i e 2 0 0 2 ) W e a l s o k n o w t h a t p e r l e c a n h a s a n L D L r e c e p t o r l i k e r e g i o n i n i t s d o m a i n I I ( N o o n a n F u l l e e t a l 1 9 9 1 ) D o m a i n I I c o u l d b i n d t h e c h o l e s t e r o l m o i e t y k n o w n t o b e o n I h h ( S t J a c q u e s H a m m e r s c h m i d t e t a l 1 9 9 9 ) W e c o u l d i n v e s t i g a t e ( u s i n g t h e C A F o r I P b i n d i n g a s s a y s ) w h e t h e r p e r l e c a n b i n d s I h h P e r l e c a n : I h h b i n d i n g w o u l d a d d a n o t h e r l e v e l o f c o n t r o l t o t h i s r e g u l a t i o n o f c h o n d r o c y t e a c t i v i t y T h e d o c u m e n t e d c h a n g e s i n p e r l e c a n f r o m o n e z o n e o f t h e g r o w t h p l a t e t o t h e n e x t i n c l u d e c h a n g e s i n t h e C S c h a i n s i z e a n d s u l f a t i o n p a t t e r n ( W e s t G o v i n d r a j e t a l 2 0 0 6 ) T h e r e f o r e i n t h e h y p e r t r o p h i c a n d l o w e r p r o l i f e r a t i n g z o n e w h e r e p e r l e c a n h a s l a r g e r C S c h a i n s F G F 2 w o u l d b e s e q u e s t e r e d a w a y f r o m t h e r e c e p t o r m o r e t h a n i t w o u l d b e i n t h e u p p e r p r o l i f e r a t i n g a n d t h e r e s t i n g z o n e s w h e r e p e r l e c a n h a s l e s s C S h e n c e t h e d i f f e r e n t p r o l i f e r a t i v e a c t i v i t i e s o f c e l l s i n t h e s e z o n e s

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135 P a p e r I I I t w a s p r e v i o u s l y k n o w n t h a t F G F 1 8 b i n d s t o h e p a r i n a n d a l s o t o H S H o w e v e r w e a r e t h e f i r s t t o s h o w t h a t F G F 1 8 a l s o b i n d s t o g r o w t h p l a t e p e r l e c a n ( P a p e r I I ) F G F 1 8 i s e x p r e s s e d i n t h e p e r i c h o n d r i a l l a y e r s u r r o u n d i n g t h e g r o w t h p l a t e m a k i n g i t a c a n d i d a t e r e g u l a t o r o f g r o w t h p l a t e f u n c t i o n F G F 1 8 i s e s s e n t i a l f o r p r o l i f e r a t i o n o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s a n d f o r d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e p r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e i n t o h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s I t a l s o r e g u l a t e s o s t e o g e n e s i s a n d v a s c u l o g e n e s i s i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e N o t s u r p r i s i n g l y t h e n F G F 1 8 n u l l m i c e h a v e s e v e r e a b n o r m a l i t i e s i n l o n g b o n e g r o w t h ( L i u X u e t a l 2 0 0 2 ; O h b a y a s h i S h i b a y a m a e t a l 2 0 0 2 ; L i u L a v i n e e t a l 2 0 0 6 ) F G F 1 8 a f f e c t s c h o n d r o c y t e s t h r o u g h F G F R 3 ( D a v i d s o n B l a n c e t a l 2 0 0 5 ) o s t e o g e n e s i s t h r o u g h F G F R 1 a n d / o r 2 ( L i u X u e t a l 2 0 0 2 ) a n d v a s c u l o g e n e s i s t h r o u g h V E G F ( G e r b e r V u e t a l 1 9 9 9 ) W e r e p o r t t h a t F G F 1 8 b i n d s t o p e r l e c a n v i a d o m a i n I I I o f p e r l e c a n s c o r e p r o t e i n D o m a i n I I I h a s a r e p e t i t i v e s t r u c t u r e a n d h a s b e e n s h o w n t o h a v e m u l t i p l e b i n d i n g p a r t n e r s B y b i n d i n g h e r e F G F 1 8 i s p o s s i b l y b e t t e r p o s i t i o n e d t o i n t e r a c t w i t h m u l t i p l e g r o w t h f a c t o r s a n d r e c e p t o r s i n c a r t i l a g e B i n d i n g t o p e r l e c a n w o u l d g i v e t h e p e r i c h o n d r i a l l y e x p r e s s e d g r o w t h f a c t o r a n a c t i v e l i n k t o t h e g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e a n d t o i t s F G F R o n t h e c h o n d r o c y t e s u r f a c e W e d o n o t k n o w y e t w h i c h r e g i o n o f d o m a i n I I I ( s u b d o m a i n s I I I a I I I b o r I I I c ) a n d f u r t h e r w h i c h r e g i o n o f t h e s e s u b d o m a i n s ( c y s t e i n e r i c h r o d l i k e o r c y s t e i n e f r e e g l o b u l a r ) r e g i o n s F G F 1 8 b i n d s T o i n v e s t i g a t e t h i s w e c o u l d d i g e s t t h e r e c o m b i n a n t d o m a i n I I I p r o d u c t ( t o w h i c h F G F 1 8 b o u n d i n o u r e x p e r i m e n t s ) w i t h V 8 p r o t e a s e T h i s e n z y m e d i g e s t s w h o l e p e r l e c a n o r d o m a i n I I I t o p r o d u c e a 4 4 k D a a n d a

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136 4 6 k D a p r o t e a s e r e s i s t a n t d o u b l e t o f f r a g m e n t s ( L e d b e t t e r F i s h e r e t a l 1 9 8 7 ; C h a k r a v a r t i H o r c h a r e t a l 1 9 9 5 ) T h e 4 4 k D a f r a g m e n t i s d e r i v e d f r o m d o m a i n I I I a a n d t h e 4 6 k D a f r a g m e n t i s f r o m d o m a i n I I I b D i g e s t i n g t h e w h o l e p e r l e c a n o r d o m a i n I I I w i t h V 8 p r o t e a s e a n d u s i n g F G F 1 8 i n a n o v e r l a y a s s a y ( u s i n g a u t o r a d i o g r a p h y t o s e e b o u n d 1 2 5 I F G F 1 8 o r W e s t e r n b l o t t o s e e u n l a b e l l e d F G F 1 8 ) w o u l d s h o w i f t h e g r o w t h f a c t o r b o u n d t o d o m a i n I I I a o r I I I b ) I f n e i t h e r o f t h e s e s u b d o m a i n s i s t h e b i n d i n g r e g i o n f o r F G F 1 8 m o r e s t r i n g e n t d i g e s t i o n e g s w i t h h e p a r i t i n a s e p l a s m i n s t r o m e l y s i n o r c o l l a g e n a s e ( M o n g i a t T a y l o r e t a l 2 0 0 0 ) c o u l d l i b e r a t e a d d i t i o n a l r e g i o n s o f d o m a i n I I I w h i c h c o u l d t h e n b e i d e n t i f i e d w h e n t h e d i g e s t s a r e u s e d i n o v e r l a y a s s a y s P a p e r I I I W e h a v e s h o w n i n P a p e r s I a n d I I t h a t p e r l e c a n b i n d s F G F 2 a n d F G F 1 8 m o s t l i k e l y t o s t o r e t h e s e e s s e n t i a l m o l e c u l e s i n t h e d e v e l o p i n g g r o w g r o w t h p l a t e s o t h a t t h e y a r e p r o t e c t e d b u t a v a i l a b l e w h e n n e e d e d H i s t o n e s l i k e g r o w t h f a c t o r s a r e a l s o d e v e l o p m e n t a l l y i m p o r t a n t p r o t e i n s H i s t o n e s a n d D N A f o r m n u c l e o s o m e s t h a t s e r v e t o c o m p l e x m a m m a l i a n g e n e s i n t o i n a c t i v e h e t e r o c h r o m a t i n U p o n m o d i f i c a t i o n ( v i a a c e t y l a t i o n o r d e m e t h y l a t i o n ) t h e h i s t o n e s a f f i n i t y f o r D N A i s d e c r e a s e d d u e t o t h e i r n o w m o r e n e g a t i v e c h a r g e t h e y a r e r e p e l l e d f r o m t h e D N A a n d l e a v e t h e D N A a c c e s s i b l e t o t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s a n d o t h e r e l e m e n t s o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l m a c h i n e r y w h i c h c a u s e s g e n e t r a n s c r i p t i o n ( S c h m i e d e k e S t o c k l e t a l 1 9 8 9 ) W e r e p o r t i n P a p e r I I I o f t h i s d i s s e r t a t i o n t h a t p e r l e c a n b i n d s t o H 3 b y b o t h i t s c o r e p r o t e i n a n d i t s G A G c h a i n s H i s t o n e H 3 i s l i k e t h e o t h e r h i s t o n e s n o r m a l l y e x p r e s s e d

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137 n u c l e a r l y B u t h i s t o n e s h a v e a l s o b e e n i d e n t i f i e d e x t r a n u c l e a r l y a n d e v e n e x t r a c e l l u l a r l y ( W a t s o n E d w a r d s e t a l 1 9 9 5 ; H e n r i q u e z C a s a r e t a l 2 0 0 2 ) I n o u r w o r k w e s h o w t h a t H 3 i s a p a r t o f t h e g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( E C M ) w h e r e i t c o l o c a l i z e s w i t h p e r l e c a n i n t h e p e r i c e l l u l a r m a t r i x s u r r o u n d i n g t h e c h o n d r o c y t e s ( F i g u r e 2 2 ) W e p r o p o s e t h a t h e r e a p o o l o f H 3 c a n b e s t o r e d b y p e r l e c a n i n t h e E C M t o a f f e c t c h o n d r o c y t e f u n c t i o n a s w a s s h o w n f o r h i s t o n e H 1 i n s k e l e t a l m u s c l e c e l l s ( H e n r i q u e z C a s a r e t a l 2 0 0 2 ) F r o m H D A C 4 k n o c k o u t s t u d i e s w e g u e s s e d t h a t t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n p e r l e c a n a n d H 3 a l s o i n v o l v e t h e h i s t o n e d e a c e t y l a s e ( H D A C ) 4 w h i c h r e m o v e s a c e t y l g r o u p s a n d a l s o t h e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r R u n x 2 i n c o n t r o l l i n g a s p e c t s o f e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h ( V e g a M a t s u d a e t a l 2 0 0 4 ) A T a l e o f T w o G r o w t h F a c t o r s P e r l e c a n h a s d i f f e r e n t r e l a t i v e a f f i n i t i e s f o r F G F 2 a n d F G F 1 8 O u r r e s u l t s i n P a p e r I F i g u r e 5 w h e n a n a l y s e d w i t h S i g m a P l o t R e g r e s s i o n W i z a r d g a v e a k d o f 6 5 n M ( F i g u r e 2 3 b e l o w p a r t B ) P a p e r I I r e p o r t s a 1 4 5 n M k d f o r F G F 1 8 : p e r l e c a n b i n d i n g ( P a r t A )

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138 F i g u r e 2 3 : D i f f e r r i n g a f f i n i t i e s o f F G F 1 8 a n d F G F 2 f o r G r o w t h P l a t e P e r l e c a n C o n s i d e r i n g t h e v a r i o u s c a r t i l a g e r e c e p t o r s a n d o t h e r p r o t e i n s t h a t F G F 1 8 i n t e r a c t s w i t h ( F G F R 1 2 3 V E G F a n d V E G F R ) i t i s r e a s o n a b l e t o u n d e r s t a n d w h y F G F 1 8 i s l e s s t i g h t l y a s s o c i a t e d w i t h p e r l e c a n t h a n F G F 2 i s B a s e d o n t h e k n o c k o u t d a t a f o r F G F 2 ( M o n t e r o O k a d a e t a l 2 0 0 0 ) F G F 1 8 ( L i u X u e t a l 2 0 0 2 ; O h b a y a s h i S h i b a y a m a e t a l 2 0 0 2 ; L i u L a v i n e e t a l 2 0 0 6 ) t h e p e r l e c a n G A G s ( R o s s i M o r i t a e t a l 2 0 0 3 ) t o w h i c h F G F 2 b i n d s a n d t h e p e r l e c a n c o r e p r o t e i n ( A r i k a w a H i r a s a w a W a t a n a b e e t a l 1 9 9 9 ; C o s t e l l G u s t a f s s o n e t a l 1 9 9 9 ) t o w h i c h F G F 1 8 b i n d s w e f u r t h e r p r o p o s e i n t h e d i s c u s s i o n o f o u r d a t a i n P a p e r I I I t h a t F G F 1 8 i s t h e c r i t i c a l l i g a n d i n e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h B i n d i n g t i g h t l y b u t w i t h l e s s a f f i n i t y t h a n F G F 2 l e a v e s t h i s m o s t c r u c i a l l i g a n d m o r e r e a d i l y a c c e s s i b l e t o r e c e p t o r s a n d o t h e r r e g u l a t o r y p r o t e i n s

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139 A n o t h e r e x p l a n a t i o n f o r t h e d i f f e r e n t a f f i n i t i e s o f t h e t w o g r o w t h f a c t o r s f o r p e r l e c a n m i g h t l i e i n t h e i n c r e a s e d e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t o n b e t w e e n t h e d e n s e l y n e g a t i v e G A G s o f p e r l e c a n a n d t h e h i g h l y b a s i c F G F 2 v e r s u s t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e F G F 1 8 a n d d o m a i n I I I o f t h e p e r l e c a n c o r e F i n a l l y T a k e n t o g e t h e r t h e d a t a i n t h i s d i s s e r t a t i o n s h o u l d h e l p t o e x p l a i n p a r t o f t h e d y n a m i c s o f t h e p e r l e c a n i n t e r a c t i o n s s h o w n t o b e s o e s s e n t i a l f o r t h e m u l t i f u n c t i o n a l i t y o f t h i s p r o t e o g l y c a n i n t h e g r o w t h p l a t e W e h a v e u n c o v e r e d t h e p r e v i o u s l y u n k n o w n r o l e o f t h e C S c h a i n s o n p e r l e c a n a n d h a v e a d d e d k n o w l e d g e o n t h e r o l e s o f t h e H S c h a i n s a n d t h e p e r l e c a n c o r e p r o t e i n i n t h e b i n d i n g o f r e g u l a t o r y p r o t e i n s T h i s d i s s e r t a t i o n t h e r e f o r e i s a n i m p o r t a n t a d d i t i o n t o t h e e x i s t i n g s c i e n t i f i c l i t e r a t u r e o n t h e c o m p l e x r o l e s o f p e r l e c a n i n e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h R e f e r e n c e s f o r C o n c l u s i o n s A r i k a w a H i r a s a w a E H W a t a n a b e e t a l ( 1 9 9 9 ) P e r l e c a n i s e s s e n t i a l f o r c a r t i l a g e a n d c e p h a l i c d e v e l o p m e n t N a t G e n e t 2 3 ( 3 ) : 3 5 4 8 C h a k r a v a r t i S T H o r c h a r e t a l ( 1 9 9 5 ) R e c o m b i n a n t d o m a i n I I I o f p e r l e c a n p r o m o t e s c e l l a t t a c h m e n t t h r o u g h i t s R G D S s e q u e n c e J B i o l C h e m 2 7 0 ( 1 ) : 4 0 4 9 C o s t e l l M E G u s t a f s s o n e t a l ( 1 9 9 9 ) P e r l e c a n m a i n t a i n s t h e i n t e g r i t y o f c a r t i l a g e a n d s o m e b a s e m e n t m e m b r a n e s J C e l l B i o l 1 4 7 ( 5 ) : 1 1 0 9 2 2

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140 D a v i d s o n D A B l a n c e t a l ( 2 0 0 5 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) 1 8 s i g n a l s t h r o u g h F G F r e c e p t o r 3 t o p r o m o t e c h o n d r o g e n e s i s J B i o l C h e m 2 8 0 ( 2 1 ) : 2 0 5 0 9 1 5 F a r n u m C E a n d N J W i l s m a n ( 1 9 8 9 ) C o n d e n s a t i o n o f h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s a t t h e c h o n d r o o s s e o u s j u n c t i o n o f g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e i n Y u c a t a n s w i n e : r e l a t i o n s h i p t o l o n g b o n e g r o w t h A m J A n a t 1 8 6 ( 4 ) : 3 4 6 5 8 G e r b e r H P T H V u e t a l ( 1 9 9 9 ) V E G F c o u p l e s h y p e r t r o p h i c c a r t i l a g e r e m o d e l i n g o s s i f i c a t i o n a n d a n g i o g e n e s i s d u r i n g e n d o c h o n d r a l b o n e f o r m a t i o n N a t M e d 5 ( 6 ) : 6 2 3 8 G o v i n d r a j P L W e s t e t a l ( 2 0 0 2 ) I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e m a j o r h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s i n t h e d e v e l o p i n g b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e J B i o l C h e m 2 7 7 ( 2 2 ) : 1 9 4 6 1 9 G o v i n d r a j P L W e s t e t a l ( 2 0 0 6 ) M o d u l a t i o n o f F G F 2 b i n d i n g t o c h o n d r o c y t e s f r o m t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e b y p e r l e c a n M a t r i x B i o l 2 5 ( 4 ) : 2 3 2 9 H e n r i q u e z J P J C C a s a r e t a l ( 2 0 0 2 ) E x t r a c e l l u l a r m a t r i x h i s t o n e H 1 b i n d s t o p e r l e c a n i s p r e s e n t i n r e g e n e r a t i n g s k e l e t a l m u s c l e a n d s t i m u l a t e s m y o b l a s t p r o l i f e r a t i o n J C e l l S c i 1 1 5 ( P t 1 0 ) : 2 0 4 1 5 1 H u a n g W U I C h u n g e t a l ( 2 0 0 1 ) T h e c h o n d r o g e n i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r S o x 9 i s a t a r g e t o f s i g n a l i n g b y t h e p a r a t h y r o i d h o r m o n e r e l a t e d p e p t i d e i n t h e g r o w t h p l a t e o f e n d o c h o n d r a l b o n e s P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 8 ( 1 ) : 1 6 0 5 I o z z o R V I R C o h e n e t a l ( 1 9 9 4 ) T h e b i o l o g y o f p e r l e c a n : t h e m u l t i f a c e t e d h e p a r a n s u l p h a t e p r o t e o g l y c a n o f b a s e m e n t m e m b r a n e s a n d p e r i c e l l u l a r m a t r i c e s B i o c h e m J 3 0 2 ( P t 3 ) : 6 2 5 3 9 K n u d s o n C B a n d W K n u d s o n ( 2 0 0 1 ) C a r t i l a g e p r o t e o g l y c a n s S e m i n C e l l D e v B i o l 1 2 ( 2 ) : 6 9 7 8 L e d b e t t e r S R L W F i s h e r e t a l ( 1 9 8 7 ) D o m a i n s t r u c t u r e o f t h e b a s e m e n t m e m b r a n e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n B i o c h e m i s t r y 2 6 ( 4 ) : 9 8 8 9 5

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141 L i H N B S c h w a r t z e t a l ( 1 9 9 3 ) c D N A c l o n i n g o f c h i c k c a r t i l a g e c h o n d r o i t i n s u l f a t e ( a g g r e c a n ) c o r e p r o t e i n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f a s t o p c o d o n i n t h e a g g r e c a n g e n e a s s o c i a t e d w i t h t h e c h o n d r o d y s t r o p h y n a n o m e l i a J B i o l C h e m 2 6 8 ( 3 1 ) : 2 3 5 0 4 1 1 L i u Z K J L a v i n e e t a l ( 2 0 0 6 ) F G F 1 8 i s r e q u i r e d f o r e a r l y c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n h y p e r t r o p h y a n d v a s c u l a r i n v a s i o n o f t h e g r o w t h p l a t e D e v B i o l L i u Z J X u e t a l ( 2 0 0 2 ) C o o r d i n a t i o n o f c h o n d r o g e n e s i s a n d o s t e o g e n e s i s b y f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 1 8 G e n e s D e v 1 6 ( 7 ) : 8 5 9 6 9 M i n i n a E C K r e s c h e l e t a l ( 2 0 0 2 ) I n t e r a c t i o n o f F G F I h h / P t h l h a n d B M P s i g n a l i n g i n t e g r a t e s c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d h y p e r t r o p h i c d i f f e r e n t i a t i o n D e v C e l l 3 ( 3 ) : 4 3 9 4 9 M o n g i a t M K T a y l o r e t a l ( 2 0 0 0 ) T h e p r o t e i n c o r e o f t h e p r o t e o g l y c a n p e r l e c a n b i n d s s p e c i f i c a l l y t o f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 7 J B i o l C h e m 2 7 5 ( 1 0 ) : 7 0 9 5 1 0 0 M o n t e r o A Y O k a d a e t a l ( 2 0 0 0 ) D i s r u p t i o n o f t h e f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 g e n e r e s u l t s i n d e c r e a s e d b o n e m a s s a n d b o n e f o r m a t i o n J C l i n I n v e s t 1 0 5 ( 8 ) : 1 0 8 5 9 3 M u e n k e M a n d U S c h e l l ( 1 9 9 5 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r m u t a t i o n s i n h u m a n s k e l e t a l d i s o r d e r s T r e n d s G e n e t 1 1 ( 8 ) : 3 0 8 1 3 N o o n a n D M A F u l l e e t a l ( 1 9 9 1 ) T h e c o m p l e t e s e q u e n c e o f p e r l e c a n a b a s e m e n t m e m b r a n e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n r e v e a l s e x t e n s i v e s i m i l a r i t y w i t h l a m i n i n A c h a i n l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n r e c e p t o r a n d t h e n e u r a l c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e J B i o l C h e m 2 6 6 ( 3 4 ) : 2 2 9 3 9 4 7 O h b a y a s h i N M S h i b a y a m a e t a l ( 2 0 0 2 ) F G F 1 8 i s r e q u i r e d f o r n o r m a l c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n d u r i n g o s t e o g e n e s i s a n d c h o n d r o g e n e s i s G e n e s D e v 1 6 ( 7 ) : 8 7 0 9 O r n i t z D M ( 2 0 0 0 ) F G F s h e p a r a n s u l f a t e a n d F G F R s : c o m p l e x i n t e r a c t i o n s e s s e n t i a l f o r d e v e l o p m e n t B i o e s s a y s 2 2 ( 2 ) : 1 0 8 1 2

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142 O r n i t z D M a n d P J M a r i e ( 2 0 0 2 ) F G F s i g n a l i n g p a t h w a y s i n e n d o c h o n d r a l a n d i n t r a m e m b r a n o u s b o n e d e v e l o p m e n t a n d h u m a n g e n e t i c d i s e a s e G e n e s D e v 1 6 ( 1 2 ) : 1 4 4 6 6 5 O r n i t z D M A Y a y o n e t a l ( 1 9 9 2 ) H e p a r i n i s r e q u i r e d f o r c e l l f r e e b i n d i n g o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r t o a s o l u b l e r e c e p t o r a n d f o r m i t o g e n e s i s i n w h o l e c e l l s M o l C e l l B i o l 1 2 ( 1 ) : 2 4 0 7 P i n e s M a n d S H u r w i t z ( 1 9 9 1 ) T h e r o l e o f t h e g r o w t h p l a t e i n l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h P o u l t S c i 7 0 ( 8 ) : 1 8 0 6 1 4 R i t t e n h o u s e E L C D u n n e t a l ( 1 9 7 8 ) C a r t i l a g e m a t r i x d e f i c i e n c y ( c m d ) : a n e w a u t o s o m a l r e c e s s i v e l e t h a l m u t a t i o n i n t h e m o u s e J E m b r y o l E x p M o r p h o l 4 3 : 7 1 8 4 R o s s i M H M o r i t a e t a l ( 2 0 0 3 ) H e p a r a n s u l f a t e c h a i n s o f p e r l e c a n a r e i n d i s p e n s a b l e i n t h e l e n s c a p s u l e b u t n o t i n t h e k i d n e y E m b o J 2 2 ( 2 ) : 2 3 6 4 5 S c h m i e d e k e T M F W S t o c k l e t a l ( 1 9 8 9 ) H i s t o n e s h a v e h i g h a f f i n i t y f o r t h e g l o m e r u l a r b a s e m e n t m e m b r a n e R e l e v a n c e f o r i m m u n e c o m p l e x f o r m a t i o n i n l u p u s n e p h r i t i s J E x p M e d 1 6 9 ( 6 ) : 1 8 7 9 9 4 S h i a n g R L M T h o m p s o n e t a l ( 1 9 9 4 ) M u t a t i o n s i n t h e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f F G F R 3 c a u s e t h e m o s t c o m m o n g e n e t i c f o r m o f d w a r f i s m a c h o n d r o p l a s i a C e l l 7 8 ( 2 ) : 3 3 5 4 2 S m i t h S M L A W e s t e t a l ( 2 0 0 6 ) H e p a r a n a n d c h o n d r o i t i n s u l f a t e o n g r o w t h p l a t e p e r l e c a n m e d i a t e b i n d i n g a n d d e l i v e r y o f F G F 2 t o F G F r e c e p t o r s M a t r i x B i o l S t J a c q u e s B M H a m m e r s c h m i d t e t a l ( 1 9 9 9 ) I n d i a n h e d g e h o g s i g n a l i n g r e g u l a t e s p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f c h o n d r o c y t e s a n d i s e s s e n t i a l f o r b o n e f o r m a t i o n G e n e s D e v 1 3 ( 1 6 ) : 2 0 7 2 8 6 V e g a R B K M a t s u d a e t a l ( 2 0 0 4 ) H i s t o n e d e a c e t y l a s e 4 c o n t r o l s c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y d u r i n g s k e l e t o g e n e s i s C e l l 1 1 9 ( 4 ) : 5 5 5 6 6 W a t a n a b e H K K i m a t a e t a l ( 1 9 9 4 ) M o u s e c a r t i l a g e m a t r i x d e f i c i e n c y ( c m d ) c a u s e d b y a 7 b p d e l e t i o n i n t h e a g g r e c a n g e n e N a t G e n e t 7 ( 2 ) : 1 5 4 7

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143 W a t s o n K R J E d w a r d s e t a l ( 1 9 9 5 ) E x t r a n u c l e a r l o c a t i o n o f h i s t o n e s i n a c t i v a t e d h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s a n d c u l t u r e d T c e l l s B i o c h e m P h a r m a c o l 5 0 ( 3 ) : 2 9 9 3 0 9 W e s t L P G o v i n d r a j e t a l ( 2 0 0 6 ) C h a n g e s i n p e r l e c a n d u r i n g c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n i n t h e f e t a l b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e J O r t h o p R e s 2 4 ( 6 ) : 1 3 1 7 2 6 W h i t e K E J M C a b r a l e t a l ( 2 0 0 5 ) M u t a t i o n s t h a t c a u s e o s t e o g l o p h o n i c d y s p l a s i a d e f i n e n o v e l r o l e s f o r F G F R 1 i n b o n e e l o n g a t i o n A m J H u m G e n e t 7 6 ( 2 ) : 3 6 1 7

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144 R E F E R E N C E S A b a d V J L M e y e r s e t a l ( 2 0 0 2 ) T h e r o l e o f t h e r e s t i n g z o n e i n g r o w t h p l a t e c h o n d r o g e n e s i s E n d o c r i n o l o g y 1 4 3 ( 5 ) : 1 8 5 1 7 A l l e n J M J F B a t e m a n e t a l ( 2 0 0 6 ) W A R P i s a n o v e l m u l t i m e r i c c o m p o n e n t o f t h e c h o n d r o c y t e p e r i c e l l u l a r m a t r i x t h a t i n t e r a c t s w i t h p e r l e c a n J B i o l C h e m 2 8 1 ( 1 1 ) : 7 3 4 1 9 A m a n n K J F a u l h a b e r e t a l ( 2 0 0 6 ) I m p a i r e d m y o c a r d i a l c a p i l l a r o g e n e s i s a n d i n c r e a s e d a d a p t i v e c a p i l l a r y g r o w t h i n F G F 2 d e f i c i e n t m i c e L a b I n v e s t 8 6 ( 1 ) : 4 5 5 3 A n d e r s o n H C H H H s u e t a l ( 1 9 9 7 ) M a t r i x v e s i c l e s i n o s t e o m a l a c i c h y p o p h o s p h a t a s i a b o n e c o n t a i n a p a t i t e l i k e m i n e r a l c r y s t a l s A m J P a t h o l 1 5 1 ( 6 ) : 1 5 5 5 6 1 A r i k a w a H i r a s a w a E A H L e e t a l ( 2 0 0 2 ) S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l m u t a t i o n s o f t h e p e r l e c a n g e n e c a u s e S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e w i t h m y o t o n i c m y o p a t h y a n d c h o n d r o d y s p l a s i a A m J H u m G e n e t 7 0 ( 5 ) : 1 3 6 8 7 5 A r i k a w a H i r a s a w a E H W a t a n a b e e t a l ( 1 9 9 9 ) P e r l e c a n i s e s s e n t i a l f o r c a r t i l a g e a n d c e p h a l i c d e v e l o p m e n t N a t G e n e t 2 3 ( 3 ) : 3 5 4 8 A r i k a w a H i r a s a w a E W R W i l c o x e t a l ( 2 0 0 1 ) D y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e i s c a u s e d b y f u n c t i o n a l n u l l m u t a t i o n s o f t h e p e r l e c a n g e n e N a t G e n e t 2 7 ( 4 ) : 4 3 1 4 A r i k a w a H i r a s a w a E W R W i l c o x e t a l ( 2 0 0 1 ) D y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e : u n e x p e c t e d r o l e o f p e r l e c a n i n c a r t i l a g e d e v e l o p m e n t A m J M e d G e n e t 1 0 6 ( 4 ) : 2 5 4 7 A r i k a w a H i r a s a w a E a n d Y Y a m a d a ( 2 0 0 1 ) [ R o l e s o f p e r l e c a n i n d e v e l o p m e n t a n d d i s e a s e : s t u d i e s i n k n o c k o u t m i c e a n d h u m a n d i s o r d e r s ] S e i k a g a k u 7 3 ( 1 0 ) : 1 2 5 7 6 1

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145 A s h i k a r i H a d a S H H a b u c h i e t a l ( 2 0 0 4 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f g r o w t h f a c t o r b i n d i n g s t r u c t u r e s i n h e p a r i n / h e p a r a n s u l f a t e u s i n g a n o c t a s a c c h a r i d e l i b r a r y J B i o l C h e m 2 7 9 ( 1 3 ) : 1 2 3 4 6 5 4 A v i e z e r D D H e c h t e t a l ( 1 9 9 4 ) P e r l e c a n b a s a l l a m i n a p r o t e o g l y c a n p r o m o t e s b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r b i n d i n g m i t o g e n e s i s a n d a n g i o g e n e s i s C e l l 7 9 ( 6 ) : 1 0 0 5 1 3 A v i e z e r D E L e v y e t a l ( 1 9 9 4 ) D i f f e r e n t i a l s t r u c t u r a l r e q u i r e m e n t s o f h e p a r i n a n d h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s t h a t p r o m o t e b i n d i n g o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r t o i t s r e c e p t o r J B i o l C h e m 2 6 9 ( 1 ) : 1 1 4 2 1 B a l l o c k R T a n d R J O K e e f e ( 2 0 0 3 ) P h y s i o l o g y a n d p a t h o p h y s i o l o g y o f t h e g r o w t h p l a t e B i r t h D e f e c t s R e s C E m b r y o T o d a y 6 9 ( 2 ) : 1 2 3 4 3 B e n g t s s o n E M M o r g e l i n e t a l ( 2 0 0 2 ) T h e l e u c i n e r i c h r e p e a t p r o t e i n P R E L P b i n d s p e r l e c a n a n d c o l l a g e n s a n d m a y f u n c t i o n a s a b a s e m e n t m e m b r a n e a n c h o r J B i o l C h e m 2 7 7 ( 1 7 ) : 1 5 0 6 1 8 B e n g t s s o n T A A s z o d i e t a l ( 2 0 0 5 ) L o s s o f a l p h a 1 0 b e t a 1 i n t e g r i n e x p r e s s i o n l e a d s t o m o d e r a t e d y s f u n c t i o n o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s J C e l l S c i 1 1 8 ( P t 5 ) : 9 2 9 3 6 B i W J M D e n g e t a l ( 1 9 9 9 ) S o x 9 i s r e q u i r e d f o r c a r t i l a g e f o r m a t i o n N a t G e n e t 2 2 ( 1 ) : 8 5 9 B i l o z u r M E a n d C B i s w a s ( 1 9 9 0 ) I d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f h e p a r a n s u l f a t e b i n d i n g p r o t e i n s f r o m h u m a n l u n g c a r c i n o m a c e l l s J B i o l C h e m 2 6 5 ( 3 2 ) : 1 9 6 9 7 7 0 3 B o r k P a n d L P a t t h y ( 1 9 9 5 ) T h e S E A m o d u l e : a n e w e x t r a c e l l u l a r d o m a i n a s s o c i a t e d w i t h O g l y c o s y l a t i o n P r o t e i n S c i 4 ( 7 ) : 1 4 2 1 5 C a m a c h o H u b n e r C K A W o o d s e t a l ( 1 9 9 9 ) I n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o r I d e f i c i e n c y c a u s e d b y a p a r t i a l d e l e t i o n o f t h e I G F I g e n e : e f f e c t s o f r h I G F I t h e r a p y G r o w t h H o r m I G F R e s 9 S u p p l B : 4 7 5 1 ; d i s c u s s i o n 5 1 2 C a s t i l l o G M C N g o e t a l ( 1 9 9 7 ) P e r l e c a n b i n d s t o t h e b e t a a m y l o i d p r o t e i n s ( A b e t a ) o f A l z h e i m e r s d i s e a s e a c c e l e r a t e s A b e t a f i b r i l f o r m a t i o n a n d m a i n t a i n s A b e t a f i b r i l s t a b i l i t y J N e u r o c h e m 6 9 ( 6 ) : 2 4 5 2 6 5

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146 C h a k r a v a r t i S T H o r c h a r e t a l ( 1 9 9 5 ) R e c o m b i n a n t d o m a i n I I I o f p e r l e c a n p r o m o t e s c e l l a t t a c h m e n t t h r o u g h i t s R G D S s e q u e n c e J B i o l C h e m 2 7 0 ( 1 ) : 4 0 4 9 C h e l l a i a h A W Y u a n e t a l ( 1 9 9 9 ) M a p p i n g l i g a n d b i n d i n g d o m a i n s i n c h i m e r i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r m o l e c u l e s M u l t i p l e r e g i o n s d e t e r m i n e l i g a n d b i n d i n g s p e c i f i c i t y J B i o l C h e m 2 7 4 ( 4 9 ) : 3 4 7 8 5 9 4 C h i n t a l a S K R R M i l l e r e t a l ( 1 9 9 4 ) B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r b i n d s t o h e p a r a n s u l f a t e i n t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x o f r a t g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s A r c h B i o c h e m B i o p h y s 3 1 0 ( 1 ) : 1 8 0 6 C h i n t a l a S K R R M i l l e r e t a l ( 1 9 9 5 ) R o l e o f h e p a r a n s u l f a t e i n t h e t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s A r c h B i o c h e m B i o p h y s 3 1 6 ( 1 ) : 2 2 7 3 4 C o f f i n J D R Z F l o r k i e w i c z e t a l ( 1 9 9 5 ) A b n o r m a l b o n e g r o w t h a n d s e l e c t i v e t r a n s l a t i o n a l r e g u l a t i o n i n b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F 2 ) t r a n s g e n i c m i c e M o l B i o l C e l l 6 ( 1 2 ) : 1 8 6 1 7 3 C o l v i n J S B A B o h n e e t a l ( 1 9 9 6 ) S k e l e t a l o v e r g r o w t h a n d d e a f n e s s i n m i c e l a c k i n g f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 N a t G e n e t 1 2 ( 4 ) : 3 9 0 7 C o s t e l l M E G u s t a f s s o n e t a l ( 1 9 9 9 ) P e r l e c a n m a i n t a i n s t h e i n t e g r i t y o f c a r t i l a g e a n d s o m e b a s e m e n t m e m b r a n e s J C e l l B i o l 1 4 7 ( 5 ) : 1 1 0 9 2 2 C o s t e l l M K M a n n e t a l ( 1 9 9 7 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f r e c o m b i n a n t p e r l e c a n d o m a i n I a n d i t s s u b s t i t u t i o n b y g l y c o s a m i n o g l y c a n s a n d o l i g o s a c c h a r i d e s E u r J B i o c h e m 2 4 3 ( 1 2 ) : 1 1 5 2 1 C o s t e l l M T S a s a k i e t a l ( 1 9 9 6 ) S t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f r e c o m b i n a n t d o m a i n I I o f t h e b a s e m e n t m e m b r a n e p r o t e o g l y c a n p e r l e c a n F E B S L e t t 3 9 6 ( 2 3 ) : 1 2 7 3 1 C o u c h m a n J R R K a p o o r e t a l ( 1 9 9 6 ) P e r l e c a n a n d b a s e m e n t m e m b r a n e c h o n d r o i t i n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n ( b a m a c a n ) a r e t w o b a s e m e n t m e m b r a n e c h o n d r o i t i n / d e r m a t a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s i n t h e E n g e l b r e t h H o l m S w a r m t u m o r m a t r i x J B i o l C h e m 2 7 1 ( 1 6 ) : 9 5 9 5 6 0 2 C o u c h m a n J R A V L j u b i m o v e t a l ( 1 9 9 5 ) A n t i b o d y m a p p i n g a n d t i s s u e l o c a l i z a t i o n o f g l o b u l a r a n d c y s t e i n e r i c h r e g i o n s o f p e r l e c a n d o m a i n I I I J H i s t o c h e m C y t o c h e m 4 3 ( 9 ) : 9 5 5 6 3

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147 D A n g e l o M Z Y a n e t a l ( 2 0 0 0 ) M M P 1 3 i s i n d u c e d d u r i n g c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y J C e l l B i o c h e m 7 7 ( 4 ) : 6 7 8 9 3 D a v i d s o n D A B l a n c e t a l ( 2 0 0 5 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) 1 8 s i g n a l s t h r o u g h F G F r e c e p t o r 3 t o p r o m o t e c h o n d r o g e n e s i s J B i o l C h e m 2 8 0 ( 2 1 ) : 2 0 5 0 9 1 5 d e C r o m b r u g g h e B V L e f e b v r e e t a l ( 2 0 0 0 ) T r a n s c r i p t i o n a l m e c h a n i s m s o f c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n M a t r i x B i o l 1 9 ( 5 ) : 3 8 9 9 4 D e g u c h i Y H O k u t s u e t a l ( 2 0 0 2 ) I n t e r n a l i z a t i o n o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r a t t h e m o u s e b l o o d b r a i n b a r r i e r i n v o l v e s p e r l e c a n a h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n J N e u r o c h e m 8 3 ( 2 ) : 3 8 1 9 D e n g C A W y n s h a w B o r i s e t a l ( 1 9 9 6 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 i s a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f b o n e g r o w t h C e l l 8 4 ( 6 ) : 9 1 1 2 1 D o l a n M T H o r c h a r e t a l ( 1 9 9 7 ) I d e n t i f i c a t i o n o f s i t e s i n d o m a i n I o f p e r l e c a n t h a t r e g u l a t e h e p a r a n s u l f a t e s y n t h e s i s J B i o l C h e m 2 7 2 ( 7 ) : 4 3 1 6 2 2 D o n o R G T e x i d o e t a l ( 1 9 9 8 ) I m p a i r e d c e r e b r a l c o r t e x d e v e l o p m e n t a n d b l o o d p r e s s u r e r e g u l a t i o n i n F G F 2 d e f i c i e n t m i c e E m b o J 1 7 ( 1 5 ) : 4 2 1 3 2 5 F a r n d a l e R W D J B u t t l e e t a l ( 1 9 8 6 ) I m p r o v e d q u a n t i t a t i o n a n d d i s c r i m i n a t i o n o f s u l p h a t e d g l y c o s a m i n o g l y c a n s b y u s e o f d i m e t h y l m e t h y l e n e b l u e B i o c h i m B i o p h y s A c t a 8 8 3 ( 2 ) : 1 7 3 7 F a r n u m C E a n d N J W i l s m a n ( 1 9 8 9 ) C o n d e n s a t i o n o f h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s a t t h e c h o n d r o o s s e o u s j u n c t i o n o f g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e i n Y u c a t a n s w i n e : r e l a t i o n s h i p t o l o n g b o n e g r o w t h A m J A n a t 1 8 6 ( 4 ) : 3 4 6 5 8 F a r n u m C E a n d N J W i l s m a n ( 1 9 9 3 ) D e t e r m i n a t i o n o f p r o l i f e r a t i v e c h a r a c t e r i s t i c s o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s b y l a b e l i n g w i t h b r o m o d e o x y u r i d i n e C a l c i f T i s s u e I n t 5 2 ( 2 ) : 1 1 0 9 F a y e i n N A Y C o u r t o i s e t a l ( 1 9 9 2 ) B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r h i g h a n d l o w a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s i n d e v e l o p i n g m o u s e b r a i n h i p p o c a m p u s a n d c e r e b e l l u m B i o l C e l l 7 6 ( 1 ) : 1 1 3 F o r s t e n K E a n d M A N u g e n t ( 2 0 0 1 ) B i n d i n g c o n s t a n t m e a s u r e m e n t s f o r i n h i b i t o r s o f g r o w t h f a c t o r b i n d i n g t o h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s M e t h o d s M o l B i o l 1 7 1 : 4 1 5 2 6

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148 F o r s t e n K E N W a n g e t a l ( 2 0 0 0 ) A s i m p l e a s s a y f o r e v a l u a t i n g i n h i b i t o r s o f p r o t e o g l y c a n l i g a n d b i n d i n g A n n B i o m e d E n g 2 8 ( 1 ) : 1 1 9 2 7 F o s t e r J W M A D o m i n g u e z S t e g l i c h e t a l ( 1 9 9 4 ) C a m p o m e l i c d y s p l a s i a a n d a u t o s o m a l s e x r e v e r s a l c a u s e d b y m u t a t i o n s i n a n S R Y r e l a t e d g e n e N a t u r e 3 7 2 ( 6 5 0 6 ) : 5 2 5 3 0 F r e n c h M M S E S m i t h e t a l ( 1 9 9 9 ) E x p r e s s i o n o f t h e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n p e r l e c a n d u r i n g m o u s e e m b r y o g e n e s i s a n d p e r l e c a n c h o n d r o g e n i c a c t i v i t y i n v i t r o J C e l l B i o l 1 4 5 ( 5 ) : 1 1 0 3 1 5 F r i e d r i c h M V W G o h r i n g e t a l ( 1 9 9 9 ) S t r u c t u r a l b a s i s o f g l y c o s a m i n o g l y c a n m o d i f i c a t i o n a n d o f h e t e r o t y p i c i n t e r a c t i o n s o f p e r l e c a n d o m a i n V J M o l B i o l 2 9 4 ( 1 ) : 2 5 9 7 0 G a r o f a l o S M K l i g e r S p a t z e t a l ( 1 9 9 9 ) S k e l e t a l d y s p l a s i a a n d d e f e c t i v e c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n b y t a r g e t e d o v e r e x p r e s s i o n o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 9 i n t r a n s g e n i c m i c e J B o n e M i n e r R e s 1 4 ( 1 1 ) : 1 9 0 9 1 5 G a r o f a l o S E V u o r i o e t a l ( 1 9 9 1 ) R e d u c e d a m o u n t s o f c a r t i l a g e c o l l a g e n f i b r i l s a n d g r o w t h p l a t e a n o m a l i e s i n t r a n s g e n i c m i c e h a r b o r i n g a g l y c i n e t o c y s t e i n e m u t a t i o n i n t h e m o u s e t y p e I I p r o c o l l a g e n a l p h a 1 c h a i n g e n e P r o c N a t l A c a d S c i U S A 8 8 ( 2 1 ) : 9 6 4 8 5 2 G e r b e r H P T H V u e t a l ( 1 9 9 9 ) V E G F c o u p l e s h y p e r t r o p h i c c a r t i l a g e r e m o d e l i n g o s s i f i c a t i o n a n d a n g i o g e n e s i s d u r i n g e n d o c h o n d r a l b o n e f o r m a t i o n N a t M e d 5 ( 6 ) : 6 2 3 8 G o h r i n g W T S a s a k i e t a l ( 1 9 9 8 ) M a p p i n g o f t h e b i n d i n g o f p l a t e l e t d e r i v e d g r o w t h f a c t o r t o d i s t i n c t d o m a i n s o f t h e b a s e m e n t m e m b r a n e p r o t e i n s B M 4 0 a n d p e r l e c a n a n d d i s t i n c t i o n f r o m t h e B M 4 0 c o l l a g e n b i n d i n g e p i t o p e E u r J B i o c h e m 2 5 5 ( 1 ) : 6 0 6 G o s p o d a r o w i c z D ( 1 9 7 5 ) P u r i f i c a t i o n o f a f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r f r o m b o v i n e p i t u i t a r y J B i o l C h e m 2 5 0 ( 7 ) : 2 5 1 5 2 0 G o s p o d a r o w i c z D N F e r r a r a e t a l ( 1 9 8 7 ) S t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n a n d b i o l o g i c a l f u n c t i o n s o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r E n d o c r R e v 8 ( 2 ) : 9 5 1 1 4 G o s p o d a r o w i c z D G N e u f e l d e t a l ( 1 9 8 7 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r : s t r u c t u r a l a n d b i o l o g i c a l p r o p e r t i e s J C e l l P h y s i o l S u p p l S u p p l 5 : 1 5 2 6

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149 G o v i n d r a j P L W e s t e t a l ( 2 0 0 2 ) I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e m a j o r h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s i n t h e d e v e l o p i n g b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e J B i o l C h e m 2 7 7 ( 2 2 ) : 1 9 4 6 1 9 G o v i n d r a j P L W e s t e t a l ( 2 0 0 6 ) M o d u l a t i o n o f F G F 2 b i n d i n g t o c h o n d r o c y t e s f r o m t h e d e v e l o p i n g g r o w t h p l a t e b y p e r l e c a n M a t r i x B i o l 2 5 ( 4 ) : 2 3 2 9 H a l l B K a n d T M i y a k e ( 2 0 0 0 ) A l l f o r o n e a n d o n e f o r a l l : c o n d e n s a t i o n s a n d t h e i n i t i a t i o n o f s k e l e t a l d e v e l o p m e n t B i o e s s a y s 2 2 ( 2 ) : 1 3 8 4 7 H a n d l e r M P D Y u r c h e n c o e t a l ( 1 9 9 7 ) D e v e l o p m e n t a l e x p r e s s i o n o f p e r l e c a n d u r i n g m u r i n e e m b r y o g e n e s i s D e v D y n 2 1 0 ( 2 ) : 1 3 0 4 5 H a r m e r N J C J R o b i n s o n e t a l ( 2 0 0 6 ) M u l t i m e r s o f t h e f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) F G F r e c e p t o r s a c c h a r i d e c o m p l e x a r e f o r m e d o n l o n g o l i g o m e r s o f h e p a r i n B i o c h e m J 3 9 3 ( P t 3 ) : 7 4 1 8 H a s c a l l V C A C a l a b r o e t a l ( 1 9 9 4 ) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o t e o g l y c a n s M e t h o d s E n z y m o l 2 3 0 : 3 9 0 4 1 7 H a s s e l l J Y Y a m a d a e t a l ( 2 0 0 2 ) R o l e o f p e r l e c a n i n s k e l e t a l d e v e l o p m e n t a n d d i s e a s e s G l y c o c o n j J 1 9 ( 4 5 ) : 2 6 3 7 H a s s e l l J R P G R o b e y e t a l ( 1 9 8 0 ) I s o l a t i o n o f a h e p a r a n s u l f a t e c o n t a i n i n g p r o t e o g l y c a n f r o m b a s e m e n t m e m b r a n e P r o c N a t l A c a d S c i U S A 7 7 ( 8 ) : 4 4 9 4 8 H a t o r i M K J K l a t t e e t a l ( 1 9 9 5 ) E n d l a b e l i n g s t u d i e s o f f r a g m e n t e d D N A i n t h e a v i a n g r o w t h p l a t e : e v i d e n c e o f a p o p t o s i s i n t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d c h o n d r o c y t e s J B o n e M i n e r R e s 1 0 ( 1 2 ) : 1 9 6 0 8 H e c h t J T C R H a l l e t a l ( 2 0 0 2 ) H e p a r a n s u l f a t e a b n o r m a l i t i e s i n e x o s t o s i s g r o w t h p l a t e s B o n e 3 1 ( 1 ) : 1 9 9 2 0 4 H e n r i q u e z J P J C C a s a r e t a l ( 2 0 0 2 ) E x t r a c e l l u l a r m a t r i x h i s t o n e H 1 b i n d s t o p e r l e c a n i s p r e s e n t i n r e g e n e r a t i n g s k e l e t a l m u s c l e a n d s t i m u l a t e s m y o b l a s t p r o l i f e r a t i o n J C e l l S c i 1 1 5 ( P t 1 0 ) : 2 0 4 1 5 1 H i l l D J a n d A L o g a n ( 1 9 9 2 ) C e l l c y c l e d e p e n d e n t l o c a l i z a t i o n o f i m m u n o r e a c t i v e b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r t o c y t o p l a s m a n d n u c l e u s o f i s o l a t e d o v i n e f e t a l g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s G r o w t h F a c t o r s 7 ( 3 ) : 2 1 5 3 1

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150 H u a n g W U I C h u n g e t a l ( 2 0 0 1 ) T h e c h o n d r o g e n i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r S o x 9 i s a t a r g e t o f s i g n a l i n g b y t h e p a r a t h y r o i d h o r m o n e r e l a t e d p e p t i d e i n t h e g r o w t h p l a t e o f e n d o c h o n d r a l b o n e s P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 8 ( 1 ) : 1 6 0 5 H u n t l e y J S P G B u s h e t a l ( 2 0 0 3 ) L o o k i n g a t t h e l i v i n g h u m a n g r o w t h p l a t e C m a j 1 6 8 ( 4 ) : 4 5 9 6 0 H u n z i k e r E B ( 1 9 9 4 ) M e c h a n i s m o f l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h a n d i t s r e g u l a t i o n b y g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s M i c r o s c R e s T e c h 2 8 ( 6 ) : 5 0 5 1 9 H u n z i k e r E B E K a p f i n g e r e t a l ( 1 9 9 9 ) H y p e r t r o p h y o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s i n v i v o i s a c c o m p a n i e d b y m o d u l a t i o n s i n t h e a c t i v i t y s t a t e a n d s u r f a c e a r e a o f t h e i r c y t o p l a s m i c o r g a n e l l e s H i s t o c h e m C e l l B i o l 1 1 2 ( 2 ) : 1 1 5 2 3 H u n z i k e r E B R K S c h e n k e t a l ( 1 9 8 7 ) Q u a n t i t a t i o n o f c h o n d r o c y t e p e r f o r m a n c e i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e d u r i n g l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h J B o n e J o i n t S u r g A m 6 9 ( 2 ) : 1 6 2 7 3 I n a d a M T Y a s u i e t a l ( 1 9 9 9 ) M a t u r a t i o n a l d i s t u r b a n c e o f c h o n d r o c y t e s i n C b f a 1 d e f i c i e n t m i c e D e v D y n 2 1 4 ( 4 ) : 2 7 9 9 0 I o z z o R V ( 1 9 9 4 ) P e r l e c a n : a g e m o f a p r o t e o g l y c a n M a t r i x B i o l 1 4 ( 3 ) : 2 0 3 8 I o z z o R V ( 2 0 0 5 ) B a s e m e n t m e m b r a n e p r o t e o g l y c a n s : f r o m c e l l a r t o c e i l i n g N a t R e v M o l C e l l B i o l 6 ( 8 ) : 6 4 6 5 6 I o z z o R V I R C o h e n e t a l ( 1 9 9 4 ) T h e b i o l o g y o f p e r l e c a n : t h e m u l t i f a c e t e d h e p a r a n s u l p h a t e p r o t e o g l y c a n o f b a s e m e n t m e m b r a n e s a n d p e r i c e l l u l a r m a t r i c e s B i o c h e m J 3 0 2 ( P t 3 ) : 6 2 5 3 9 I o z z o R V J P i l l a r i s e t t i e t a l ( 1 9 9 7 ) S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e h u m a n p e r l e c a n g e n e p r o m o t e r T r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n b y t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a v i a a n u c l e a r f a c t o r 1 b i n d i n g e l e m e n t J B i o l C h e m 2 7 2 ( 8 ) : 5 2 1 9 2 8 I o z z o R V a n d T N W i g h t ( 1 9 8 2 ) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o t e o g l y c a n s s y n t h e s i z e d b y h u m a n c o l o n a n d c o l o n c a r c i n o m a J B i o l C h e m 2 5 7 ( 1 8 ) : 1 1 1 3 5 4 4 I w a t a T L C h e n e t a l ( 2 0 0 0 ) A n e o n a t a l l e t h a l m u t a t i o n i n F G F R 3 u n c o u p l e s p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s i n e m b r y o s H u m M o l G e n e t 9 ( 1 1 ) : 1 6 0 3 1 3

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151 K a r a p l i s A C A L u z e t a l ( 1 9 9 4 ) L e t h a l s k e l e t a l d y s p l a s i a f r o m t a r g e t e d d i s r u p t i o n o f t h e p a r a t h y r o i d h o r m o n e r e l a t e d p e p t i d e g e n e G e n e s D e v 8 ( 3 ) : 2 7 7 8 9 K a r p S J E S c h i p a n i e t a l ( 2 0 0 0 ) I n d i a n h e d g e h o g c o o r d i n a t e s e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h a n d m o r p h o g e n e s i s v i a p a r a t h y r o i d h o r m o n e r e l a t e d p r o t e i n d e p e n d e n t a n d i n d e p e n d e n t p a t h w a y s D e v e l o p m e n t 1 2 7 ( 3 ) : 5 4 3 8 K i m I S F O t t o e t a l ( 1 9 9 9 ) R e g u l a t i o n o f c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n b y C b f a 1 M e c h D e v 8 0 ( 2 ) : 1 5 9 7 0 K n o x S C M e r r y e t a l ( 2 0 0 2 ) N o t a l l p e r l e c a n s a r e c r e a t e d e q u a l : i n t e r a c t i o n s w i t h f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) 2 a n d F G F r e c e p t o r s J B i o l C h e m 2 7 7 ( 1 7 ) : 1 4 6 5 7 6 5 K n o x S M a n d J M W h i t e l o c k ( 2 0 0 6 ) P e r l e c a n : h o w d o e s o n e m o l e c u l e d o s o m a n y t h i n g s ? C e l l M o l L i f e S c i K n u d s o n C B a n d W K n u d s o n ( 2 0 0 1 ) C a r t i l a g e p r o t e o g l y c a n s S e m i n C e l l D e v B i o l 1 2 ( 2 ) : 6 9 7 8 K r o n e n b e r g H M ( 2 0 0 3 ) D e v e l o p m e n t a l r e g u l a t i o n o f t h e g r o w t h p l a t e N a t u r e 4 2 3 ( 6 9 3 7 ) : 3 3 2 6 K v i s t A J A E J o h n s o n e t a l ( 2 0 0 6 ) C h o n d r o i t i n s u l f a t e p e r l e c a n e n h a n c e s c o l l a g e n f i b r i l f o r m a t i o n i m p l i c a t i o n s f o r p e r l e c a n c h o n d r o d y s p l a s i a s J B i o l C h e m L e d b e t t e r S R L W F i s h e r e t a l ( 1 9 8 7 ) D o m a i n s t r u c t u r e o f t h e b a s e m e n t m e m b r a n e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n B i o c h e m i s t r y 2 6 ( 4 ) : 9 8 8 9 5 L e f e b v r e V P L i e t a l ( 1 9 9 8 ) A n e w l o n g f o r m o f S o x 5 ( L S o x 5 ) S o x 6 a n d S o x 9 a r e c o e x p r e s s e d i n c h o n d r o g e n e s i s a n d c o o p e r a t i v e l y a c t i v a t e t h e t y p e I I c o l l a g e n g e n e E m b o J 1 7 ( 1 9 ) : 5 7 1 8 3 3 L i H N B S c h w a r t z e t a l ( 1 9 9 3 ) c D N A c l o n i n g o f c h i c k c a r t i l a g e c h o n d r o i t i n s u l f a t e ( a g g r e c a n ) c o r e p r o t e i n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f a s t o p c o d o n i n t h e a g g r e c a n g e n e a s s o c i a t e d w i t h t h e c h o n d r o d y s t r o p h y n a n o m e l i a J B i o l C h e m 2 6 8 ( 3 1 ) : 2 3 5 0 4 1 1 L i u Z K J L a v i n e e t a l ( 2 0 0 6 ) F G F 1 8 i s r e q u i r e d f o r e a r l y c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n h y p e r t r o p h y a n d v a s c u l a r i n v a s i o n o f t h e g r o w t h p l a t e D e v B i o l

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152 L i u Z J X u e t a l ( 2 0 0 2 ) C o o r d i n a t i o n o f c h o n d r o g e n e s i s a n d o s t e o g e n e s i s b y f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 1 8 G e n e s D e v 1 6 ( 7 ) : 8 5 9 6 9 L o e s e r R F ( 2 0 0 0 ) C h o n d r o c y t e i n t e g r i n e x p r e s s i o n a n d f u n c t i o n B i o r h e o l o g y 3 7 ( 1 2 ) : 1 0 9 1 6 L u a n Y C A P r a u l e t a l ( 1 9 9 6 ) B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r : a n a u t o c r i n e g r o w t h f a c t o r f o r e p i p h y s e a l g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s J C e l l B i o c h e m 6 2 ( 3 ) : 3 7 2 8 2 M a c i a s D Y G a n a n e t a l ( 1 9 9 7 ) R o l e o f B M P 2 a n d O P 1 ( B M P 7 ) i n p r o g r a m m e d c e l l d e a t h a n d s k e l e t o g e n e s i s d u r i n g c h i c k l i m b d e v e l o p m e n t D e v e l o p m e n t 1 2 4 ( 6 ) : 1 1 0 9 1 7 M a g n e D M J u l i e n e t a l ( 2 0 0 5 ) C a r t i l a g e f o r m a t i o n i n g r o w t h p l a t e a n d a r t e r i e s : f r o m p h y s i o l o g y t o p a t h o l o g y B i o e s s a y s 2 7 ( 7 ) : 7 0 8 1 6 M a n c i l l a E E F D e L u c a e t a l ( 1 9 9 8 ) E f f e c t s o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 o n l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h E n d o c r i n o l o g y 1 3 9 ( 6 ) : 2 9 0 0 4 M a s c a r e l l i F a n d Y C o u r t o i s ( 1 9 9 3 ) [ H e t e r o c o m p l e x f o r m a t i o n b e t w e e n h i g h a n d l o w a f f i n i t y F G F r e c e p t o r s i s m e d i a t e d b y t h e f o r m a t i o n o f a F G F d i m e r ] B u l l C a n c e r 8 0 ( 9 ) : 7 8 6 9 8 M e c h e r i S G D a n n e c k e r e t a l ( 1 9 9 3 ) A n t i h i s t o n e a u t o a n t i b o d i e s r e a c t s p e c i f i c a l l y w i t h t h e B c e l l s u r f a c e M o l I m m u n o l 3 0 ( 6 ) : 5 4 9 5 7 M e t s a r a n t a M S G a r o f a l o e t a l ( 1 9 9 2 ) C h o n d r o d y s p l a s i a i n t r a n s g e n i c m i c e h a r b o r i n g a 1 5 a m i n o a c i d d e l e t i o n i n t h e t r i p l e h e l i c a l d o m a i n o f p r o a l p h a 1 ( I I ) c o l l a g e n c h a i n J C e l l B i o l 1 1 8 ( 1 ) : 2 0 3 1 2 M i n i n a E C K r e s c h e l e t a l ( 2 0 0 2 ) I n t e r a c t i o n o f F G F I h h / P t h l h a n d B M P s i g n a l i n g i n t e g r a t e s c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n a n d h y p e r t r o p h i c d i f f e r e n t i a t i o n D e v C e l l 3 ( 3 ) : 4 3 9 4 9 M o h a n S C R i c h m a n e t a l ( 2 0 0 3 ) I n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o r r e g u l a t e s p e a k b o n e m i n e r a l d e n s i t y i n m i c e b y b o t h g r o w t h h o r m o n e d e p e n d e n t a n d i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s E n d o c r i n o l o g y 1 4 4 ( 3 ) : 9 2 9 3 6

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153 M o n g i a t M J O t t o e t a l ( 2 0 0 1 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r b i n d i n g p r o t e i n i s a n o v e l p a r t n e r f o r p e r l e c a n p r o t e i n c o r e J B i o l C h e m 2 7 6 ( 1 3 ) : 1 0 2 6 3 7 1 M o n g i a t M S M S w e e n e y e t a l ( 2 0 0 3 ) E n d o r e p e l l i n a n o v e l i n h i b i t o r o f a n g i o g e n e s i s d e r i v e d f r o m t h e C t e r m i n u s o f p e r l e c a n J B i o l C h e m 2 7 8 ( 6 ) : 4 2 3 8 4 9 M o n g i a t M K T a y l o r e t a l ( 2 0 0 0 ) T h e p r o t e i n c o r e o f t h e p r o t e o g l y c a n p e r l e c a n b i n d s s p e c i f i c a l l y t o f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 7 J B i o l C h e m 2 7 5 ( 1 0 ) : 7 0 9 5 1 0 0 M o n t e r o A Y O k a d a e t a l ( 2 0 0 0 ) D i s r u p t i o n o f t h e f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 g e n e r e s u l t s i n d e c r e a s e d b o n e m a s s a n d b o n e f o r m a t i o n J C l i n I n v e s t 1 0 5 ( 8 ) : 1 0 8 5 9 3 M o o r e E E A M B e n d e l e e t a l ( 2 0 0 5 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 1 8 s t i m u l a t e s c h o n d r o g e n e s i s a n d c a r t i l a g e r e p a i r i n a r a t m o d e l o f i n j u r y i n d u c e d o s t e o a r t h r i t i s O s t e o a r t h r i t i s C a r t i l a g e 1 3 ( 7 ) : 6 2 3 3 1 M o r i t a H A Y o s h i m u r a e t a l ( 2 0 0 5 ) H e p a r a n s u l f a t e o f p e r l e c a n i s i n v o l v e d i n g l o m e r u l a r f i l t r a t i o n J A m S o c N e p h r o l 1 6 ( 6 ) : 1 7 0 3 1 0 M o s c a t e l l i D ( 1 9 9 2 ) B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( b F G F ) d i s s o c i a t e s r a p i d l y f r o m h e p a r a n s u l f a t e s b u t s l o w l y f r o m r e c e p t o r s I m p l i c a t i o n s f o r m e c h a n i s m s o f b F G F r e l e a s e f r o m p e r i c e l l u l a r m a t r i x J B i o l C h e m 2 6 7 ( 3 6 ) : 2 5 8 0 3 9 M u e n k e M a n d U S c h e l l ( 1 9 9 5 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r m u t a t i o n s i n h u m a n s k e l e t a l d i s o r d e r s T r e n d s G e n e t 1 1 ( 8 ) : 3 0 8 1 3 M u r a g a k i Y E C M a r i m a n e t a l ( 1 9 9 6 ) A m u t a t i o n i n C O L 9 A 2 c a u s e s m u l t i p l e e p i p h y s e a l d y s p l a s i a ( E D M 2 ) A n n N Y A c a d S c i 7 8 5 : 3 0 3 6 M u r d o c h A D G R D o d g e e t a l ( 1 9 9 2 ) P r i m a r y s t r u c t u r e o f t h e h u m a n h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n f r o m b a s e m e n t m e m b r a n e ( H S P G 2 / p e r l e c a n ) A c h i m e r i c m o l e c u l e w i t h m u l t i p l e d o m a i n s h o m o l o g o u s t o t h e l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n r e c e p t o r l a m i n i n n e u r a l c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e s a n d e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r J B i o l C h e m 2 6 7 ( 1 2 ) : 8 5 4 4 5 7 N a g a i H R T s u k u d a e t a l ( 1 9 9 5 ) E f f e c t s o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( b F G F ) o n b o n e f o r m a t i o n i n g r o w i n g r a t s B o n e 1 6 ( 3 ) : 3 6 7 7 3

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154 N a s k i M C J S C o l v i n e t a l ( 1 9 9 8 ) R e p r e s s i o n o f h e d g e h o g s i g n a l i n g a n d B M P 4 e x p r e s s i o n i n g r o w t h p l a t e c a r t i l a g e b y f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 D e v e l o p m e n t 1 2 5 ( 2 4 ) : 4 9 7 7 8 8 N i c o l e S C S D a v o i n e e t a l ( 2 0 0 0 ) P e r l e c a n t h e m a j o r p r o t e o g l y c a n o f b a s e m e n t m e m b r a n e s i s a l t e r e d i n p a t i e n t s w i t h S c h w a r t z J a m p e l s y n d r o m e ( c h o n d r o d y s t r o p h i c m y o t o n i a ) N a t G e n e t 2 6 ( 4 ) : 4 8 0 3 N i l s s o n O R M a r i n o e t a l ( 2 0 0 5 ) E n d o c r i n e r e g u l a t i o n o f t h e g r o w t h p l a t e H o r m R e s 6 4 ( 4 ) : 1 5 7 6 5 N o o n a n D M A F u l l e e t a l ( 1 9 9 1 ) T h e c o m p l e t e s e q u e n c e o f p e r l e c a n a b a s e m e n t m e m b r a n e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n r e v e a l s e x t e n s i v e s i m i l a r i t y w i t h l a m i n i n A c h a i n l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n r e c e p t o r a n d t h e n e u r a l c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e J B i o l C h e m 2 6 6 ( 3 4 ) : 2 2 9 3 9 4 7 N o o n a n D M a n d J R H a s s e l l ( 1 9 9 3 ) P e r l e c a n t h e l a r g e l o w d e n s i t y p r o t e o g l y c a n o f b a s e m e n t m e m b r a n e s : s t r u c t u r e a n d v a r i a n t f o r m s K i d n e y I n t 4 3 ( 1 ) : 5 3 6 0 N o o n a n K J E B H u n z i k e r e t a l ( 1 9 9 8 ) C h a n g e s i n c e l l m a t r i x c o m p a r t m e n t a n d f i b r i l l a r c o l l a g e n v o l u m e s b e t w e e n g r o w t h p l a t e z o n e s J O r t h o p R e s 1 6 ( 4 ) : 5 0 0 8 N u g e n t M A H M N u g e n t e t a l ( 2 0 0 0 ) P e r l e c a n i s r e q u i r e d t o i n h i b i t t h r o m b o s i s a f t e r d e e p v a s c u l a r i n j u r y a n d c o n t r i b u t e s t o e n d o t h e l i a l c e l l m e d i a t e d i n h i b i t i o n o f i n t i m a l h y p e r p l a s i a P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 7 ( 1 2 ) : 6 7 2 2 7 O K e e f e R J I D C r a b b e t a l ( 1 9 9 4 ) E f f e c t s o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a 1 a n d f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r o n D N A s y n t h e s i s i n g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s a r e e n h a n c e d b y i n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o r I J O r t h o p R e s 1 2 ( 3 ) : 2 9 9 3 1 0 O h b a y a s h i N M S h i b a y a m a e t a l ( 2 0 0 2 ) F G F 1 8 i s r e q u i r e d f o r n o r m a l c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n d u r i n g o s t e o g e n e s i s a n d c h o n d r o g e n e s i s G e n e s D e v 1 6 ( 7 ) : 8 7 0 9 O h l s s o n C J I s g a a r d e t a l ( 1 9 9 3 ) E n d o c r i n e r e g u l a t i o n o f l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h A c t a P a e d i a t r S u p p l 8 2 S u p p l 3 9 1 : 3 3 4 0 ; d i s c u s s i o n 4 1 O l s e n B R ( 1 9 9 9 ) L i f e w i t h o u t p e r l e c a n h a s i t s p r o b l e m s J C e l l B i o l 1 4 7 ( 5 ) : 9 0 9 1 2

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155 O l s e n B R A M R e g i n a t o e t a l ( 2 0 0 0 ) B o n e d e v e l o p m e n t A n n u R e v C e l l D e v B i o l 1 6 : 1 9 1 2 2 0 O r n i t z D M ( 2 0 0 0 ) F G F s h e p a r a n s u l f a t e a n d F G F R s : c o m p l e x i n t e r a c t i o n s e s s e n t i a l f o r d e v e l o p m e n t B i o e s s a y s 2 2 ( 2 ) : 1 0 8 1 2 O r n i t z D M ( 2 0 0 5 ) F G F s i g n a l i n g i n t h e d e v e l o p i n g e n d o c h o n d r a l s k e l e t o n C y t o k i n e G r o w t h F a c t o r R e v 1 6 ( 2 ) : 2 0 5 1 3 O r n i t z D M a n d N I t o h ( 2 0 0 1 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r s G e n o m e B i o l 2 ( 3 ) : R E V I E W S 3 0 0 5 O r n i t z D M a n d P L e d e r ( 1 9 9 2 ) L i g a n d s p e c i f i c i t y a n d h e p a r i n d e p e n d e n c e o f f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r s 1 a n d 3 J B i o l C h e m 2 6 7 ( 2 3 ) : 1 6 3 0 5 1 1 O r n i t z D M a n d P J M a r i e ( 2 0 0 2 ) F G F s i g n a l i n g p a t h w a y s i n e n d o c h o n d r a l a n d i n t r a m e m b r a n o u s b o n e d e v e l o p m e n t a n d h u m a n g e n e t i c d i s e a s e G e n e s D e v 1 6 ( 1 2 ) : 1 4 4 6 6 5 O r n i t z D M J X u e t a l ( 1 9 9 6 ) R e c e p t o r s p e c i f i c i t y o f t h e f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r f a m i l y J B i o l C h e m 2 7 1 ( 2 5 ) : 1 5 2 9 2 7 O r n i t z D M A Y a y o n e t a l ( 1 9 9 2 ) H e p a r i n i s r e q u i r e d f o r c e l l f r e e b i n d i n g o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r t o a s o l u b l e r e c e p t o r a n d f o r m i t o g e n e s i s i n w h o l e c e l l s M o l C e l l B i o l 1 2 ( 1 ) : 2 4 0 7 O r t e g a S M I t t m a n n e t a l ( 1 9 9 8 ) N e u r o n a l d e f e c t s a n d d e l a y e d w o u n d h e a l i n g i n m i c e l a c k i n g f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 5 ( 1 0 ) : 5 6 7 2 7 P e n g H B A A A l i e t a l ( 1 9 9 8 ) T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p e r l e c a n a n d d y s t r o g l y c a n a n d i t s i m p l i c a t i o n i n t h e f o r m a t i o n o f t h e n e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n C e l l A d h e s C o m m u n 5 ( 6 ) : 4 7 5 8 9 P i n e s M a n d S H u r w i t z ( 1 9 9 1 ) T h e r o l e o f t h e g r o w t h p l a t e i n l o n g i t u d i n a l b o n e g r o w t h P o u l t S c i 7 0 ( 8 ) : 1 8 0 6 1 4 P l a a s A H a n d J D S a n d y ( 1 9 9 3 ) A c a r t i l a g e e x p l a n t s y s t e m f o r s t u d i e s o n a g g r e c a n s t r u c t u r e b i o s y n t h e s i s a n d c a t a b o l i s m i n d i s c r e t e z o n e s o f t h e m a m m a l i a n g r o w t h p l a t e M a t r i x 1 3 ( 2 ) : 1 3 5 4 7 P o w e l l A K E A Y a t e s e t a l ( 2 0 0 4 ) I n t e r a c t i o n s o f h e p a r i n / h e p a r a n s u l f a t e w i t h p r o t e i n s : a p p r a i s a l o f s t r u c t u r a l f a c t o r s a n d e x p e r i m e n t a l a p p r o a c h e s G l y c o b i o l o g y 1 4 ( 4 ) : 1 7 R 3 0 R

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156 R a t h N C W E H u f f e t a l ( 1 9 9 7 ) M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e a c t i v i t i e s i n a v i a n t i b i a l d y s c h o n d r o p l a s i a P o u l t S c i 7 6 ( 3 ) : 5 0 1 5 R i s k e F R C h i z z o n i t e e t a l ( 1 9 9 0 ) M e a s u r e m e n t o f b i o l o g i c a l l y a c t i v e i n t e r l e u k i n 1 b y a s o l u b l e r e c e p t o r b i n d i n g a s s a y A n a l B i o c h e m 1 8 5 ( 2 ) : 2 0 6 1 2 R i t t e n h o u s e E L C D u n n e t a l ( 1 9 7 8 ) C a r t i l a g e m a t r i x d e f i c i e n c y ( c m d ) : a n e w a u t o s o m a l r e c e s s i v e l e t h a l m u t a t i o n i n t h e m o u s e J E m b r y o l E x p M o r p h o l 4 3 : 7 1 8 4 R o g a l s k i T M B D W i l l i a m s e t a l ( 1 9 9 3 ) P r o d u c t s o f t h e u n c 5 2 g e n e i n C a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s a r e h o m o l o g o u s t o t h e c o r e p r o t e i n o f t h e m a m m a l i a n b a s e m e n t m e m b r a n e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n G e n e s D e v 7 ( 8 ) : 1 4 7 1 8 4 R o s s i A a n d A S u p e r t i F u r g a ( 2 0 0 1 ) M u t a t i o n s i n t h e d i a s t r o p h i c d y s p l a s i a s u l f a t e t r a n s p o r t e r ( D T D S T ) g e n e ( S L C 2 6 A 2 ) : 2 2 n o v e l m u t a t i o n s m u t a t i o n r e v i e w a s s o c i a t e d s k e l e t a l p h e n o t y p e s a n d d i a g n o s t i c r e l e v a n c e H u m M u t a t 1 7 ( 3 ) : 1 5 9 7 1 R o s s i M H M o r i t a e t a l ( 2 0 0 3 ) H e p a r a n s u l f a t e c h a i n s o f p e r l e c a n a r e i n d i s p e n s a b l e i n t h e l e n s c a p s u l e b u t n o t i n t h e k i d n e y E m b o J 2 2 ( 2 ) : 2 3 6 4 5 R u o s l a h t i E ( 1 9 9 1 ) I n t e g r i n s J C l i n I n v e s t 8 7 ( 1 ) : 1 5 S a h n i M R R a z e t a l ( 2 0 0 1 ) S T A T 1 m e d i a t e s t h e i n c r e a s e d a p o p t o s i s a n d r e d u c e d c h o n d r o c y t e p r o l i f e r a t i o n i n m i c e o v e r e x p r e s s i n g F G F 2 D e v e l o p m e n t 1 2 8 ( 1 1 ) : 2 1 1 9 2 9 S a s a k i T M C o s t e l l e t a l ( 1 9 9 8 ) I n h i b i t i o n o f g l y c o s a m i n o g l y c a n m o d i f i c a t i o n o f p e r l e c a n d o m a i n I b y s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s c h a n g e s p r o t e a s e s e n s i t i v i t y a n d l a m i n i n 1 b i n d i n g a c t i v i t y F E B S L e t t 4 3 5 ( 2 3 ) : 1 6 9 7 2 S c h m i e d e k e T M F W S t o c k l e t a l ( 1 9 8 9 ) H i s t o n e s h a v e h i g h a f f i n i t y f o r t h e g l o m e r u l a r b a s e m e n t m e m b r a n e R e l e v a n c e f o r i m m u n e c o m p l e x f o r m a t i o n i n l u p u s n e p h r i t i s J E x p M e d 1 6 9 ( 6 ) : 1 8 7 9 9 4 S c h r o e d e r T M R A K a h l e r e t a l ( 2 0 0 4 ) H i s t o n e d e a c e t y l a s e 3 i n t e r a c t s w i t h r u n x 2 t o r e p r e s s t h e o s t e o c a l c i n p r o m o t e r a n d r e g u l a t e o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n J B i o l C h e m 2 7 9 ( 4 0 ) : 4 1 9 9 8 2 0 0 7

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157 S h a p i r o I M C S A d a m s e t a l ( 2 0 0 5 ) F a t e o f t h e h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e : m i c r o e n v i r o n m e n t a l p e r s p e c t i v e s o n a p o p t o s i s a n d s u r v i v a l i n t h e e p i p h y s e a l g r o w t h p l a t e B i r t h D e f e c t s R e s C E m b r y o T o d a y 7 5 ( 4 ) : 3 3 0 9 S h i a n g R L M T h o m p s o n e t a l ( 1 9 9 4 ) M u t a t i o n s i n t h e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f F G F R 3 c a u s e t h e m o s t c o m m o n g e n e t i c f o r m o f d w a r f i s m a c h o n d r o p l a s i a C e l l 7 8 ( 2 ) : 3 3 5 4 2 S i m m o n s A D M M M u s y e t a l ( 1 9 9 9 ) A d i r e c t i n t e r a c t i o n b e t w e e n E X T p r o t e i n s a n d g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s i s d e f e c t i v e i n h e r e d i t a r y m u l t i p l e e x o s t o s e s H u m M o l G e n e t 8 ( 1 2 ) : 2 1 5 5 6 4 S m i t h S a n d J R H a s s e l l ( 2 0 0 6 ) F o c u s o n m o l e c u l e s : p e r l e c a n ( H S P G 2 ) E x p E y e R e s 8 3 ( 3 ) : 4 7 1 2 S m i t h S M L A W e s t e t a l ( 2 0 0 6 ) H e p a r a n a n d c h o n d r o i t i n s u l f a t e o n g r o w t h p l a t e p e r l e c a n m e d i a t e b i n d i n g a n d d e l i v e r y o f F G F 2 t o F G F r e c e p t o r s M a t r i x B i o l S p r a n g e r J A W i n t e r p a c h t e t a l ( 1 9 9 4 ) T h e t y p e I I c o l l a g e n o p a t h i e s : a s p e c t r u m o f c h o n d r o d y s p l a s i a s E u r J P e d i a t r 1 5 3 ( 2 ) : 5 6 6 5 S t J a c q u e s B M H a m m e r s c h m i d t e t a l ( 1 9 9 9 ) I n d i a n h e d g e h o g s i g n a l i n g r e g u l a t e s p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f c h o n d r o c y t e s a n d i s e s s e n t i a l f o r b o n e f o r m a t i o n G e n e s D e v 1 3 ( 1 6 ) : 2 0 7 2 8 6 S t a c e y A J B a t e m a n e t a l ( 1 9 8 8 ) P e r i n a t a l l e t h a l o s t e o g e n e s i s i m p e r f e c t a i n t r a n s g e n i c m i c e b e a r i n g a n e n g i n e e r e d m u t a n t p r o a l p h a 1 ( I ) c o l l a g e n g e n e N a t u r e 3 3 2 ( 6 1 6 0 ) : 1 3 1 6 S u l l i v a n R a n d M K l a g s b r u n ( 1 9 8 5 ) P u r i f i c a t i o n o f c a r t i l a g e d e r i v e d g r o w t h f a c t o r b y h e p a r i n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y J B i o l C h e m 2 6 0 ( 4 ) : 2 3 9 9 4 0 3 S u n d a r r a j N D F i t e e t a l ( 1 9 9 8 ) P r o t e o g l y c a n d i s t r i b u t i o n d u r i n g h e a l i n g o f c o r n e a l s t r o m a l w o u n d s i n c h i c k E x p E y e R e s 6 7 ( 4 ) : 4 3 3 4 2 S u n d a r R a j N D F i t e e t a l ( 1 9 9 5 ) P e r l e c a n i s a c o m p o n e n t o f c a r t i l a g e m a t r i x a n d p r o m o t e s c h o n d r o c y t e a t t a c h m e n t J C e l l S c i 1 0 8 ( P t 7 ) : 2 6 6 3 7 2 T a p a n a d e c h o p o n e P J R H a s s e l l e t a l ( 1 9 9 9 ) L o c a l i z a t i o n o f g l y c o s a m i n o g l y c a n s u b s t i t u t i o n s i t e s o n d o m a i n V o f m o u s e p e r l e c a n B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n 2 6 5 ( 3 ) : 6 8 0 9 0

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158 T a v o r m i n a P L D L R i m o i n e t a l ( 1 9 9 5 ) A n o t h e r m u t a t i o n t h a t r e s u l t s i n t h e s u b s t i t u t i o n o f a n u n p a i r e d c y s t e i n e r e s i d u e i n t h e e x t r a c e l l u l a r d o m a i n o f F G F R 3 i n t h a n a t o p h o r i c d y s p l a s i a t y p e I H u m M o l G e n e t 4 ( 1 1 ) : 2 1 7 5 7 T r a n P K K T r a n L u n d m a r k e t a l ( 2 0 0 4 ) I n c r e a s e d i n t i m a l h y p e r p l a s i a a n d s m o o t h m u s c l e c e l l p r o l i f e r a t i o n i n t r a n s g e n i c m i c e w i t h h e p a r a n s u l f a t e d e f i c i e n t p e r l e c a n C i r c R e s 9 4 ( 4 ) : 5 5 0 8 T r i p p e l S B J W r o b l e w s k i e t a l ( 1 9 9 3 ) R e g u l a t i o n o f g r o w t h p l a t e c h o n d r o c y t e s b y i n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o r I a n d b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r J B o n e J o i n t S u r g A m 7 5 ( 2 ) : 1 7 7 8 9 v a n d e r E e r d e n B C M K a r p e r i e n e t a l ( 2 0 0 3 ) S y s t e m i c a n d l o c a l r e g u l a t i o n o f t h e g r o w t h p l a t e E n d o c r R e v 2 4 ( 6 ) : 7 8 2 8 0 1 V e g a R B K M a t s u d a e t a l ( 2 0 0 4 ) H i s t o n e d e a c e t y l a s e 4 c o n t r o l s c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y d u r i n g s k e l e t o g e n e s i s C e l l 1 1 9 ( 4 ) : 5 5 5 6 6 V i t t i t o w J a n d T B o r r a s ( 2 0 0 4 ) G e n e s e x p r e s s e d i n t h e h u m a n t r a b e c u l a r m e s h w o r k d u r i n g p r e s s u r e i n d u c e d h o m e o s t a t i c r e s p o n s e J C e l l P h y s i o l 2 0 1 ( 1 ) : 1 2 6 3 7 V o i g t A R P f l a n z e t a l ( 2 0 0 2 ) P e r l e c a n p a r t i c i p a t e s i n p r o l i f e r a t i o n a c t i v a t i o n o f q u i e s c e n t D r o s o p h i l a n e u r o b l a s t s D e v D y n 2 2 4 ( 4 ) : 4 0 3 1 2 V o l k S W a n d P S L e b o y ( 1 9 9 9 ) R e g u l a t i n g t h e r e g u l a t o r s o f c h o n d r o c y t e h y p e r t r o p h y J B o n e M i n e r R e s 1 4 ( 4 ) : 4 8 3 6 V o r t k a m p A K L e e e t a l ( 1 9 9 6 ) R e g u l a t i o n o f r a t e o f c a r t i l a g e d i f f e r e n t i a t i o n b y I n d i a n h e d g e h o g a n d P T H r e l a t e d p r o t e i n S c i e n c e 2 7 3 ( 5 2 7 5 ) : 6 1 3 2 2 V u T H J M S h i p l e y e t a l ( 1 9 9 8 ) M M P 9 / g e l a t i n a s e B i s a k e y r e g u l a t o r o f g r o w t h p l a t e a n g i o g e n e s i s a n d a p o p t o s i s o f h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s C e l l 9 3 ( 3 ) : 4 1 1 2 2 W a g n e r T J W i r t h e t a l ( 1 9 9 4 ) A u t o s o m a l s e x r e v e r s a l a n d c a m p o m e l i c d y s p l a s i a a r e c a u s e d b y m u t a t i o n s i n a n d a r o u n d t h e S R Y r e l a t e d g e n e S O X 9 C e l l 7 9 ( 6 ) : 1 1 1 1 2 0 W a l l i s G A B R a s h e t a l ( 1 9 9 6 ) M u t a t i o n s w i t h i n t h e g e n e e n c o d i n g t h e a l p h a 1 ( X ) c h a i n o f t y p e X c o l l a g e n ( C O L 1 0 A 1 ) c a u s e m e t a p h y s e a l c h o n d r o d y s p l a s i a t y p e S c h m i d b u t n o t s e v e r a l o t h e r f o r m s o f m e t a p h y s e a l c h o n d r o d y s p l a s i a J M e d G e n e t 3 3 ( 6 ) : 4 5 0 7

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159 W a n g Q R P G r e e n e t a l ( 2 0 0 1 ) D i f f e r e n t i a l r e g u l a t i o n o f e n d o c h o n d r a l b o n e g r o w t h a n d j o i n t d e v e l o p m e n t b y F G F R 1 a n d F G F R 3 t y r o s i n e k i n a s e d o m a i n s D e v e l o p m e n t 1 2 8 ( 1 9 ) : 3 8 6 7 7 6 W a n g Y M K S p a t z e t a l ( 1 9 9 9 ) A m o u s e m o d e l f o r a c h o n d r o p l a s i a p r o d u c e d b y t a r g e t i n g f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3 P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 6 ( 8 ) : 4 4 5 5 6 0 W a t a n a b e H K K i m a t a e t a l ( 1 9 9 4 ) M o u s e c a r t i l a g e m a t r i x d e f i c i e n c y ( c m d ) c a u s e d b y a 7 b p d e l e t i o n i n t h e a g g r e c a n g e n e N a t G e n e t 7 ( 2 ) : 1 5 4 7 W a t a n a b e H Y Y a m a d a e t a l ( 1 9 9 8 ) R o l e s o f a g g r e c a n a l a r g e c h o n d r o i t i n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n i n c a r t i l a g e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n J B i o c h e m ( T o k y o ) 1 2 4 ( 4 ) : 6 8 7 9 3 W a t s o n K R J E d w a r d s e t a l ( 1 9 9 5 ) E x t r a n u c l e a r l o c a t i o n o f h i s t o n e s i n a c t i v a t e d h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s a n d c u l t u r e d T c e l l s B i o c h e m P h a r m a c o l 5 0 ( 3 ) : 2 9 9 3 0 9 W a t s o n K N J G o o d e r h a m e t a l ( 1 9 9 9 ) N u c l e o s o m e s b i n d t o c e l l s u r f a c e p r o t e o g l y c a n s J B i o l C h e m 2 7 4 ( 3 1 ) : 2 1 7 0 7 1 3 W e s t L P G o v i n d r a j e t a l ( 2 0 0 6 ) C h a n g e s i n p e r l e c a n d u r i n g c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n i n t h e f e t a l b o v i n e r i b g r o w t h p l a t e J O r t h o p R e s 2 4 ( 6 ) : 1 3 1 7 2 6 W h i t e K E J M C a b r a l e t a l ( 2 0 0 5 ) M u t a t i o n s t h a t c a u s e o s t e o g l o p h o n i c d y s p l a s i a d e f i n e n o v e l r o l e s f o r F G F R 1 i n b o n e e l o n g a t i o n A m J H u m G e n e t 7 6 ( 2 ) : 3 6 1 7 W h i t e l o c k J M A D M u r d o c h e t a l ( 1 9 9 6 ) T h e d e g r a d a t i o n o f h u m a n e n d o t h e l i a l c e l l d e r i v e d p e r l e c a n a n d r e l e a s e o f b o u n d b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r b y s t r o m e l y s i n c o l l a g e n a s e p l a s m i n a n d h e p a r a n a s e s J B i o l C h e m 2 7 1 ( 1 7 ) : 1 0 0 7 9 8 6 W i n t e r p a c h t A K H i l b e r t e t a l ( 2 0 0 0 ) A n o v e l m u t a t i o n i n F G F R 3 d i s r u p t s a p u t a t i v e N g l y c o s y l a t i o n s i t e a n d r e s u l t s i n h y p o c h o n d r o p l a s i a P h y s i o l G e n o m i c s 2 ( 1 ) : 9 1 2 Y a n a g i s h i t a M a n d V C H a s c a l l ( 1 9 9 2 ) C e l l s u r f a c e h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s J B i o l C h e m 2 6 7 ( 1 4 ) : 9 4 5 1 4 Y a y o n A M K l a g s b r u n e t a l ( 1 9 9 1 ) C e l l s u r f a c e h e p a r i n l i k e m o l e c u l e s a r e r e q u i r e d f o r b i n d i n g o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r t o i t s h i g h a f f i n i t y r e c e p t o r C e l l 6 4 ( 4 ) : 8 4 1 8

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160 Y i S E A D a l u i s k i e t a l ( 2 0 0 0 ) T h e t y p e I B M P r e c e p t o r B M P R I B i s r e q u i r e d f o r c h o n d r o g e n e s i s i n t h e m o u s e l i m b D e v e l o p m e n t 1 2 7 ( 3 ) : 6 2 1 3 0 Z h o u M R L S u t l i f f e t a l ( 1 9 9 8 ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 c o n t r o l o f v a s c u l a r t o n e N a t M e d 4 ( 2 ) : 2 0 1 7 Z h o u Z J W a n g e t a l ( 2 0 0 4 ) I m p a i r e d a n g i o g e n e s i s d e l a y e d w o u n d h e a l i n g a n d r e t a r d e d t u m o r g r o w t h i n p e r l e c a n h e p a r a n s u l f a t e d e f i c i e n t m i c e C a n c e r R e s 6 4 ( 1 4 ) : 4 6 9 9 7 0 2 Z o u H R W i e s e r e t a l ( 1 9 9 7 ) D i s t i n c t r o l e s o f t y p e I b o n e m o r p h o g e n e t i c p r o t e i n r e c e p t o r s i n t h e f o r m a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f c a r t i l a g e G e n e s D e v 1 1 ( 1 7 ) : 2 1 9 1 2 0 3

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161 A P P E N D I X

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162 A p p e n d i x : F o c u s o n P e r l e c a n F o c u s o n M o l e c u l e s : P e r l e c a n ( H S P G 2 ) S i m o n e S m i t h 1 a n d J o h n R H a s s e l l 1 2 1 D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r M e d i c i n e U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a C o l l e g e o f M e d i c i n e T a m p a F l 3 3 6 1 2 2 C e n t e r f o r R e s e a r c h i n S k e l e t a l D e v e l o p m e n t a n d P e d i a t r i c O r t h o p e d i c s S h r i n e r s H o s p i t a l s f o r C h i l d r e n T a m p a F l 3 3 6 1 2 K e y W o r d s : b a s e m e n t m e m b r a n e p r o t e o g l y c a n c a r t i l a g e h s p g 2 i n t r a o c u l a r p r e s s u r e P u b l i s h e d i n E x p e r i m e n t a l E y e R e s e a r c h S e p t e m b e r 2 0 0 6 ; 8 3 ( 3 ) : 4 7 1 2 E p u b M a r c h 2 3 2 0 0 6

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163 A p p e n d i x : ( c o n t i n u e d ) ( 1 ) S t r u c t u r e : P e r l e c a n ( N M 0 0 5 5 2 9 ) w a s f i r s t i d e n t i f i e d a s a h e p a r a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n i n b a s e m e n t m e m b r a n e s ( I o z z o 1 9 9 4 ) I n a r o t a r y s h a d o w e d i m a g e t h e c o r e p r o t e i n o f p e r l e c a n ( w i t h i t s g l o b u l a r d o m a i n s s p a c e d b y r o d l i k e s e q u e n c e s ) r e s e m b l e s a s t r i n g o f p e a r l s h e n c e i t s n a m e ( I o z z o 1 9 9 4 ) T h e p r o t e i n c o r e i s e n c o d e d b y a n a p p r o x i m a t e l y 1 2 0 k b g e n e w i t h 9 7 e x o n s ( N T 0 0 4 5 7 6 ) T h e g e n e i s w e l l c o n s e r v e d a c r o s s s p e c i e s w i t h h o m o l o g u e s o f m a m m a l i a n p e r l e c a n ( h s p g 2 g e n e ) p r e s e n t i n C e l e g a n s ( u n c 5 2 g e n e ) D r o s o p h i l a ( t r o l g e n e ) a n d o t h e r s p e c i e s I n h u m a n s p e r l e c a n s c o r e p r o t e i n i s 4 6 6 k D a i n s i z e M i c e a l s o h a v e a 3 6 9 k D a c o r e p r o t e i n d u e t o a l t e r n a t i v e s p l i c i n g ( H a s s e l l Y a m a d a e t a l 2 0 0 2 ) P e r l e c a n i s a l s o p r e s e n t i n e x t r a c e l l u l a r m a t r i x o f c a r t i l a g e w h e r e i t h a s b o t h c h o n d r o i t i n s u l f a t e ( C S ) a n d h e p a r a n s u l f a t e ( H S ) c h a i n s ( H a s s e l l Y a m a d a e t a l 2 0 0 2 ) T h e C S a n d H S c h a i n s v a r y i n s i z e a n d s u g a r r e s i d u e s e q u e n c e d e p e n d i n g o n t h e t i s s u e l o c a t i o n o f t h e p e r l e c a n T h e c o r e p r o t e i n o f p e r l e c a n c o n s i s t s o f f i v e d o m a i n s D o m a i n I i s t h e m o s t u n i q u e s h o w i n g s i g n i f i c a n t h o m o l o g y t o n o k n o w n p r o t e i n s ( H a s s e l l Y a m a d a e t a l 2 0 0 2 ) D o m a i n I I s h o w s h o m o l o g y t o p o r t i o n s o f t h e L D L r e c e p t o r d o m a i n I I I t o r e g i o n s o f t h e l a m i n i n s h o r t a r m d o m a i n I V t o N C A M a n d d o m a i n V t o t h e g l o b u l a r d o m a i n o f t h e l a m i n i n A c h a i n T h e n e g a t i v e l y c h a r g e d g l y c o s a m i n o g l y c a n ( G A G ) c h a i n s a r e a t t a c h e d a t d o m a i n s I a n d V

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164 A p p e n d i x : ( c o n t i n u e d ) ( 2 ) F u n c t i o n : I n c a r t i l a g e p e r l e c a n i s e s s e n t i a l f o r i n t e g r i t y o f t h e m a t r i x b i n d i n g p r o t e i n s s u c h a s f i b u l i n a n d f i b r o n e c t i n t o f o r m a s c a f f o l d i n g n e t w o r k b e t w e e n t h e c h o n d r o c y t e s t o o r g a n i z e t h e m a n d s t a b i l i z e t h e c a r t i l a g e ( H a s s e l l Y a m a d a e t a l 2 0 0 2 ) P e r l e c a n a l s o f u n c t i o n s i n c e l l a t t a c h m e n t i n a r e a s s u c h a s b a s e m e n t m e m b r a n e s ( B M ) w h e r e i t b i n d s t o o t h e r B M c o m p o n e n t s s u c h a s l a m i n i n a n d C o l l a g e n I V ( I o z z o 1 9 9 4 ) I n s k e l e t a l m u s c l e p e r l e c a n e n a b l e s m u s c l e c e l l p r o l i f e r a t i o n v i a g r o w t h f a c t o r s i g n a l i n g a n d a f f e c t s c e l l s t a b i l i t y t h r o u g h 1 I n t e g r i n s ( I o z z o 1 9 9 4 ) P e r l e c a n a l s o h e l p s t o m e d i a t e m u s c l e c o n t r a c t i o n b y l o c a l i z i n g a c e t y l c h o l i n e e s t e r a s e t o t h e n e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n ( N M J ) s o t h a t m u s c l e s c a n r e l a x a f t e r c o n t r a c t i o n A c e t y l c h o l i n e a c t s a s a n e u r o t r a n s m i t t e r i n s k e l e t a l m u s c l e b i n d i n g i t s r e c e p t o r o n t h e c e l l s u r f a c e a n d a c t i v a t i n g s o d i u m c h a n n e l s t o c a u s e m u s c l e c o n t r a c t i o n A c e t y l c h o l i n e e s t e r a s e r e v e r s e s t h i s p r o c e s s t o c a u s e b o t h m u s c l e r e l a x a t i o n a n d r e c y c l i n g o f t h e n e u r o t r a n s m i t t e r T h i s e s t e r a s e a n d p e r l e c a n a r e b o t h n o r m a l p a r t s o f t h e c l u s t e r o f p r o t e i n s f o r m i n g t h e N M J T h e c o l l a g e n t a i l e d f o r m o f t h e a c e t y l c h o l i n e e s t e r a s e b i n d s p e r l e c a n i n v i t r o a n d i s a b s e n t a t t h e N M J o f p e r l e c a n n u l l m i c e s u p p o r t i n g t h e t h e o r y t h a t p e r l e c a n h e l p s t o l o c a l i z e a c e t y l c h o l i n e e s t e r a s e t o t h e N M J T h e p o l y a n i o n i c G A G c h a i n s o f p e r l e c a n a s w e l l a s i t s c o r e p r o t e i n c a n b i n d g r o w t h f a c t o r s a s d i v e r s e a s F G F 2 F G F 7 P D G F a n d E G F t o a f f e c t p r o c e s s e s s u c h a s a n g i o g e n e s i s c e l l p r o l i f e r a t i o n / d i f f e r e n t i a t i o n e m b r y o g e n e s i s a n d l o n g b o n e g r o w t h ( I o z z o 1 9 9 4 ) T h i s m o d u l a t i o n o f c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n i s a l s o

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165 A p p e n d i x : ( c o n t i n u e d ) i m p o r t a n t f o r t h e r e m o d e l i n g t h a t o c c u r s a f t e r i n j u r y t o t i s s u e s s u c h a s m u s c l e a r t e r i e s a n d c o r n e a P e r l e c a n e x p r e s s i o n i s u p r e g u l a t e d a f t e r c o r n e a l s t r o m a l i n j u r y a n d a f t e r a n a r t i f i c i a l i n c r e a s e i n i n t r a o c u l a r p r e s s u r e w h i c h h e l p s t o m a i n t a i n c o r n e a l s h a p e ( V i t t i t o w a n d B o r r a s 2 0 0 4 ) P e r l e c a n m u s t t h e r e f o r e b e n o t o n l y p r o t e c t i v e i n t h e e y e ( f o r m i n g s t a b l e l e n s b a s e m e n t m e m b r a n e s ) b u t a l s o r e c u p e r a t i v e ( i n r e m o d e l i n g o f i n j u r e d o c u l a r t i s s u e ) P e r l e c a n m a i n t a i n s c e l l a d h e s i o n a n d i n t e g r i t y o f t h e c o r n e a l m a t r i x ( V i t t i t o w a n d B o r r a s 2 0 0 4 ) a n d a l s o h e l p s t o m a i n t a i n t h e s e l e c t i v e b a s e m e n t m e m b r a n e b a r r i e r t h a t c o n t r o l s f l u i d f l o w i n t h e e y e ( R o s s i M o r i t a e t a l 2 0 0 3 ) ( 3 ) D i s e a s e I n v o l v e m e n t : P e r l e c a n i s a n e s s e n t i a l m o l e c u l e i n c a r t i l a g e S i l v e r m a n H a n d m a k e r t y p e d y s s e g m e n t a l d y s p l a s i a ( D D S H ) i s a l e t h a l a u t o s o m a l r e c e s s i v e s k e l e t a l d y s p l a s i a ( H a s s e l l Y a m a d a e t a l 2 0 0 2 ) I t i s a n a l o g o u s t o t h e s e v e r e d w a r f i s m s e e n i n t h e p e r l e c a n n u l l m o u s e T h e s e m i c e h a v e l i m b a n d s k u l l b o n e s t h a t a r e s h o r t e r a n d w i d e r t h a n n o r m a l T h e c r a n i o f a c i a l d e f e c t s a r e s e v e r e a n d d e a t h o c c u r s u p t o d a y s a f t e r b i r t h F o r s o m e o f t h e m i c e d e a t h o c c u r s p r e n a t a l l y d u e t o d e f e c t i v e b a s e m e n t m e m b r a n e f o r m a t i o n i n t h e a b s e n c e o f p e r l e c a n ( H a s s e l l Y a m a d a e t a l 2 0 0 2 ) T h e r e i s a l s o a d e f e c t i n a c e t y l c h o l i n e e s t e r a s e e x p r e s s i o n a t t h e n e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n ( N M J ) o f p e r l e c a n n u l l m i c e W e r e t h e s e m i c e t o s u r v i v e l o n g e n o u g h t h e y m i g h t e x h i b i t p a r a l y z e d o r s p a s t i c m u s c l e s t h a t w e r e u n a b l e t o r e l a x a f t e r c o n t r a c t i o n A d e f e c t i n t h e u n c 5 2 g e n e ( h o m o l o g o u s t o m a m m a l i a n p e r l e c a n g e n e ) i n C e l e g a n s s i m i l a r l y c a u s e s a d u l t m u s c l e p a r a l y s i s M u s c l e e x c i t a b i l i t y a n d m y o t o n i a a r e a l s o s e e n i n h u m a n s w i t h D D S H

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166 A p p e n d i x : ( c o n t i n u e d ) P e r l e c a n i s a n i m p o r t a n t c o m p o n e n t o f b a s e m e n t m e m b r a n e s ( B M ) w h i c h a r e v i t a l i n m a n y t i s s u e s P e r l e c a n s s t r u c t u r a l ( b a r r i e r ) a n d f u n c t i o n a l ( s i g n a l i n g ) r o l e s i n B M s a r e i n t e g r a l i n t h e e y e s a s a n o t h e r m o u s e m o d e l s h o w s M i c e w i t h a t a r g e t e d d i s r u p t i o n i n e x o n 3 o f t h e p e r l e c a n g e n e ( t h e e x o n t h a t e n c o d e s t h e t h r e e G A G a t t a c h m e n t s i t e s o n D o m a i n I o f p e r l e c a n ) h a s a b n o r m a l e y e s ( R o s s i M o r i t a e t a l 2 0 0 3 ) T h e e y e s o f t h e s e h s p g 2 3 / 3 m i c e a r e 7 7 % t h e w e i g h t o f n o r m a l e y e s d u e t o a p o p t o s i s T h e l e n s e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e p e r l e c a n m u t a n t s s h o w n o r m a l p r o l i f e r a t i o n H o w e v e r w h e n t h e s e m u t a n t s a r e c r o s s b r e d w i t h C o l X V I I I m u t a n t s t h e p r o l i f e r a t i o n o f t h e l e n s e p i t h e l i a l c e l l s i s a b n o r m a l T h i s d i f f e r e n c e i n d e f e c t i s l i k e l y d u e t o h a v i n g c o m p e n s a t o r y C o l X V I I I h e p a r a n s u l f a t e c h a i n s s t i l l p r e s e n t a n d f u n c t i o n a l ( b i n d i n g g r o w t h f a c t o r s ) i n t h e p e r l e c a n m u t a n t s b u t l o s t i n t h e d o u b l e m u t a n t s T h e l e n s f i b e r s i n t h e h s p g 2 3 / 3 m u t a n t s f o r m n o r m a l l y a t f i r s t b u t g r a d u a l l y s w e l l b e c o m i n g a m o r p h o u s a n d r u p t u r i n g t h e l e n s b y t h e t i m e t h e m i c e r e a c h 6 m o n t h s o f a g e T h i s s w e l l i n g i s d u e t o a n o t h e r r o l e o f p e r l e c a n i n t h e l e n s c a p s u l e w h e r e p e r l e c a n m a i n t a i n s a s e l e c t i v e b a r r i e r b e t w e e n t h e v i t r e o u s b o d y a n d t h e l e n s b i n d i n g t o m o l e c u l e s v i a i t s G A G c h a i n s a n d a i d i n g t h e s e l e c t i v e e x c h a n g e o f g r o w t h f a c t o r s m e t a b o l i t e s a n d n u t r i e n t s W i t h t h e p e r l e c a n G A G s a b s e n t t h e f l o w f r o m t h e l e n s a n d o t h e r r e g i o n s g o e s u n c h e c k e d w i t h t h e f i b e r s s w e l l i n g d u e t o a b n o r m a l l y h i g h f l u i d i n t a k e T h e r e a r e a l s o e y e a n o m a l i e s i n t h e r e p e r t o i r e o f h u m a n d i s o r d e r s c a u s e d b y d e f e c t i v e p e r l e c a n A D D S H f e t u s h a s b e e n r e p o r t e d w i t h b i l a t e r a l c a t a r a c t s a n d e x o p h t h a l m o s ( a b n o r m a l

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167 A p p e n d i x : ( c o n t i n u e d ) p r o t r u s i o n o f t h e e y e b a l l ) I n t h e m i l d e r p e r l e c a n r e l a t e d S c h w a r t z J a m p e l S y n d r o m e ( S J S ) p a t i e n t s s u f f e r m y o p i a o r n e a r s i g h t e d n e s s ( H a s s e l l Y a m a d a e t a l 2 0 0 2 ) W i t h t h e w i d e e x p r e s s i o n o f p e r l e c a n i n t h e e y e i t i s e a s y t o s e e h o w t h i s p r o t e o g l y c a n c a n b e i n v o l v e d i n d i s e a s e s t h a t c a u s e d e f e c t i v e v i s i o n ( 4 ) F o c u s o f F u t u r e S t u d i e s : H u m a n d i s o r d e r s a n d a n i m a l m o d e l s a r e i n t r i g u i n g t a r g e t s f o r f u r t h e r s t u d i e s o f t h e f u n c t i o n s o f p e r l e c a n i n t h e e y e S J S a n d D D S H p a t i e n t s p r e s e n t a w i d e s p e c t r u m o f p h e n o t y p e s I n D D S H a n d t h e l e s s s e v e r e S J S e y e s c o u l d b e r o u t i n e l y e x a m i n e d f o r d e f e c t s T e s t s c o u l d m i r r o r t h o s e d o n e w i t h t h e h s p g 2 3 / 3 m o u s e t h a t i s a s s e s s i n g l e n s i n t e g r i t y o c u l a r b a s e m e n t m e m b r a n e f o r m a t i o n a n d a n y e v e n t u a l e y e d e g e n e r a t i o n c a u s e d b y t h e l a c k o r a b s e n c e o f f u n c t i o n a l p e r l e c a n A n o t h e r a p p r o a c h f o r f u t u r e s t u d i e s i s t o i n v e s t i g a t e d i s e a s e s t h a t i n v o l v e a v i s u a l d e f e c t b u t h a v e n o t b e e n l i n k e d t o p e r l e c a n B i o c h e m i c a l a n d m o l e c u l a r a n a l y s i s o f p e r l e c a n i n t h e s e p a t i e n t s c o u l d h i g h l i g h t a n y r o l e f o r p e r l e c a n i n t h e s e d i s o r d e r s F o r e x a m p l e o n e n c o u n t e r i n g i n d i v i d u a l s w i t h m u s c u l a r d y s t r o p h y o r s o m e o t h e r c o n g e n i t a l d i s e a s e a n d w h o h a v e d e f e c t i v e v i s i o n a n a l y s i s o f p e r l e c a n e x p r e s s i o n i n t h e i r o c u l a r t i s s u e s w i l l d e t e r m i n e t h e p a t t e r n o f p e r l e c a n e x p r e s s i o n i n t h e s e d i s o r d e r s I n s u c h s t u d i e s c o r r e l a t i o n s b e t w e e n t h e p e r l e c a n g e n o t y p e o f p a t i e n t s a n d t h e e y e p h e n o t y p e s t h e y h a v e c o u l d f u r t h e r u n c o v e r t h e o c u l a r f u n c t i o n a l i t y o f t h i s m u l t i f a c e t e d p r o t e o g l y c a n

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168 A p p e n d i x : ( c o n t i n u e d ) F i g u r e 2 3 P e r l e c a n c o r e p r o t e i n : D e t e r m i n e d d o m a i n s t r u c t u r e a n d G A G a t t a c h m e n t D o m a i n s I I t o V o f p e r l e c a n s h o w h o m o l o g y t o t h e L D L r e c e p t o r ( L D L r ) t h e s h o r t a r m o f l a m i n i n A a n d B t h e n e u r a l c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e ( N C A M ) a n d t h e g l o b u l a r a r m o f l a m i n i n A a n d B T h e h e p a r a n s u l f a t e o r c h o n d r o i t i n s u l f a t e G A G s a r e a t t a c h e d o n d o m a i n s I a n d V A l s o d e p i c t e d i s t h e r e g i o n o f d o m a i n I t h a t i s a b s e n t w h e n e x o n 3 i s d i s r u p t e d R e f e r e n c e s F o r A p p e n d i x H a s s e l l J Y Y a m a d a e t a l ( 2 0 0 2 ) R o l e o f p e r l e c a n i n s k e l e t a l d e v e l o p m e n t a n d d i s e a s e s G l y c o c o n j J 1 9 ( 4 5 ) : 2 6 3 7 I o z z o R V ( 1 9 9 4 ) P e r l e c a n : a g e m o f a p r o t e o g l y c a n M a t r i x B i o l 1 4 ( 3 ) : 2 0 3 8 R o s s i M H M o r i t a e t a l ( 2 0 0 3 ) H e p a r a n s u l f a t e c h a i n s o f p e r l e c a n a r e i n d i s p e n s a b l e i n t h e l e n s c a p s u l e b u t n o t i n t h e k i d n e y E m b o J 2 2 ( 2 ) : 2 3 6 4 5 V i t t i t o w J a n d T B o r r a s ( 2 0 0 4 ) G e n e s e x p r e s s e d i n t h e h u m a n t r a b e c u l a r m e s h w o r k d u r i n g p r e s s u r e i n d u c e d h o m e o s t a t i c r e s p o n s e J C e l l P h y s i o l 2 0 1 ( 1 ) : 1 2 6 3 7

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A b o u t t h e A u t h o r S i m o n e M a r s h a L e e S m i t h w a s b o r n a n d r a i s e d i n J a m a i c a t h e n i m m i g r a t e d w i t h h e r f a m i l y t o F l o r i d a a t t h e a g e o f s i x t e e n S h e g r a d u a t e d f r o m t h e U n i v e r s i t y o f S o u t h F l o r i d a w i t h U n i v e r s i t y H o n o r s a B a c h e l o r o f S c i e n c e i n B i o l o g y a n d a m i n o r i n P s y c h o l o g y S h e c o m p l e t e d a n u n d e r g r a d u a t e r e s e a r c h t h e s i s w i t h D r W i l l i a m G o w e r a t U S F H e r u n d e r g r a d u a t e e x p e r i e n c e f o s t e r e d i n h e r a l o v e f o r r e s e a r c h w h i c h c o n t i n u e d o n h e r e n r o l l m e n t i n U S F s I P 2 C M B ( I n t e r d i s c i p l i n a r y P h D P r o g r a m i n C e l l u l a r a n d M o l e c u l a r B i o l o g y ) i n t h e I n s t i t u t e f o r B i o m o l e c u l a r S c i e n c e ( I B S ) H e r t e n u r e w i t h D r H a s s e l l a n d h i s v a r i o u s l a b m e m b e r s o v e r t h e y e a r s h a s p r o m o t e d h e r c o n t i n u e d c o m m i t m e n t t o r e s e a r c h