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The effect of growth factors on the corneal stroma extracellular matrix production by keratocytes

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Material Information

Title:
The effect of growth factors on the corneal stroma extracellular matrix production by keratocytes
Physical Description:
vii, 91 leaves : ill. (some col.) ; 28 cm.
Language:
English
Creator:
Etheredge, LaTia Shaquan
Publication Date:

Subjects

Subjects / Keywords:
Cornea -- injuries   ( mesh )
Cornea -- cytology   ( mesh )
Corneal Stroma -- cytology   ( mesh )
Wound Healing   ( mesh )
Extracellular Matrix   ( mesh )
Cell Proliferation   ( mesh )
Cornea
Proteoglycans
Extracellular matrix
Wound healing
Collagen
Dissertations, Academic -- Pathology and Cell Biology -- Doctoral -- USF   ( lcsh )
Genre:
bibliography   ( marcgt )
non-fiction   ( marcgt )

Notes

Summary:
ABSTRACT: The corneal wound healing process is a complex process, which often leads to the development of scar tissue with loss of transparency. When the cornea is wounded, some of the viable keratocytes are activated by growth factors to proliferate, and repair the wound by the production of a new extracellular matrix (ECM) that is either normal or is disorganized (fibrotic). The first part of this dissertation aims to show that the growth factors IGF-I, TGF-β, FGF-2, and PDGF stimulate keratocytes to synthesize different levels of collagens and proteoglycans and are therefore responsible for initiating the wound healing repair process. FGF-2 stimulated keratocytes to proliferate but did not stimulate collagen production; IGF-I and PDGF stimulated keratocytes to proliferate and produce a collagenous ECM that could restore transparency; while, TGF-β stimulated keratocytes produce a fibrocollagenous ECM that is opaque.The second part of this dissertation aims to evaluate collagen fibril content, distribution, and orientation in the ECM deposited by keratocytes cultured in IGF-I, TGF-β, FGF-2, and PDGF under a layer of agarose: a culture modification that enhances the formation of ECM in vitro. FGF-2 agarose cultures had little ECM and the keratocytes were in close cell contact while IGF-I, TGF-β, and PDGF agarose cultures had the least cell contact with an extensive fibrillar ECM. This newly developed agarose overlay cell culture system increases ECM formation with the cell layer only when the synthesis of collagen is stimulated and that the ECM morphology is growth factor specific. Cell culture has proven to be a reliable technique to study the keratocytes response to trauma and disease; however, limitations exist. Primary keratocytes that possess quiescent phenotype are unable to be rapidly expanded or subcultured without the addition of a mitogen(s).Most commonly, keratocytes are cultured and passaged in the presence of fetal bovine serum (FBS), which activate the cells to proliferate and differentiate into fibroblasts or myofibroblasts as well as lose expression of their unique transparency enabling gene products. The third part of this dissertation aims to develop a defined culture media that can be used to expand and subculture keratocytes that express keratocyte specific markers. Culture medium supplemented with FGF-2 combined with ITS was used to: expand and subculture primary bovine keratocytes while maintaining their expression of keratocan and to restore keratocan expression to bovine keratocytes expanded and subcultured with media containing 2.5% FBS. This dissertation shows the significance of signaling molecules in vitro to produce keratocyte cultures useful for understanding normal stromal biology and its repair process.
Thesis:
Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2009.
Bibliography:
Includes bibliographical references.
Additional Physical Form:
Also available online.
Statement of Responsibility:
by LaTia Shaquan Etheredge.
General Note:
Includes vita.

Record Information

Source Institution:
University of South Florida Library
Holding Location:
University of South Florida
Rights Management:
All applicable rights reserved by the source institution and holding location.
Resource Identifier:
aleph - 002068006
oclc - 601775080
usfldc doi - E14-SFE0003238
usfldc handle - e14.3238
System ID:
SFS0027554:00001


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Full Text

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T h e E f f e ct o f G r o w t h F a ct o r s o n t h e C o r n e a l S t r o m a E xt r a ce l l u l a r M a t r i x P r o d u ct i o n b y K e r a t o cyt e s b y L a T i a S h a q u a n E t h e r e d g e A d i sse r t a t i o n su b m i t t e d i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D o ct o r o f P h i l o so p h y D e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y a n d C e l l B i o l o g y C o l l e g e o f M e d i ci n e U n i ve r si t y o f S o u t h F l o r i d a M a j o r P r o f e sso r : J o h n R H a ss e l l P h D D a vi d E B i r k, P h D P a t r i ci a A K r u k, P h D S a n t o V N i co si a M D H o r m u z W a d i a M D D a t e o f A p p r o va l : O ct o b e r 3 0 2 0 0 9 K e yw o r d s: co r n e a p r o t e o g l yca n s e xt r a ce l l u l a r m a t r i x, w o u n d h e a l i n g c o l l a g e n C o p yr i g h t 2 0 0 9 L a T i a S h a q u a n E t h e r e d g e

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D e d i c a t i o n I d e d i ca t e t h i s d i sse r t a t i o n t o m y f a m i l y a n d f r i e n d s. B e i n g co n f i d e n t o f t h i s ve r y t h i n g t h a t h e w h i c h h a t h b e g u n a g o o d w o r k i n yo u w i l l p e r f o r m i t u n t i l t h e d a y o f Je su s C h r i st : P h i l i p p i a n s 1 : 6

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A c k n o w l e d g m e n t s T h a n k yo u G o d f o r yo u r a g a p e l o ve a n d f a i t h f u l n e ss, f o r w i t h Y o u a l l t h i n g s a r e p o ssi b l e M y p a r e n t s, J. C a n d M a r y E t h e r e d g e t h a n k y o u f o r yo u r p r a ye r s a n d e n c o u r a g e m e n t w h e n I w a n t e d t o g i ve u p T o m y si st e r s, L a ki sh a D o n t r e l l e T a T a n ya a n d Jo h n n i se ; t h a n k yo u a l l f o r b e i n g j u st a p h o n e c a l l a w a y. T o m y a d o p t e d si st e r s, T o n i S h e l l y, N a t a sh a N i co l e a n d K a t h r yn ; t h a n k yo u a l l f o r yo u r e n d l e ss l o v e w i t a n d p a t i e n ce T o m y h o st o f n i e c e s a n d n e p h e w s, t h a n k yo u a l l f o r b e i n g m y i n s p i r a t i o n I w i l l a l w a ys b e g r a t e f u l t o m y m e n t o r D r Jo h n R H a sse l l w h o h a s m o l d e d m e i n t o a n i n d i vi d u a l t h a t e m b r a c e s s ci e n t i f i c i n q u i r y w i t h d i l i g e n ce cu r i o si t y, a n d i n t e g r i t y. I t h a s b e e n b o t h a p l e a su r e a n d a n h o n o r t o b e y o u r st u d e n t C o u n t l e ss p e o p l e h a ve co n t r i b u t e d t o m y w o r k a t S o u t h F l o r i d a I n p a r t i cu l a r D r P a t r i ci a K r u k, D r D a vi d B i r k, D r H o r m u z W a d i a D r S a n t o s N i co si a a n d D r M a r i a n Y o u n g t h a n k yo u a l l f o r yo u r t i m e su p p o r t a n d e xp e r t i se I n a d d i t i o n M r B e r n a r d B a t so n B r a d l e y K a n e a n d S h e i l a A d a m s, t h a n k yo u a l l f o r yo u r p a t i e n ce a n d h e l p M a n y n e w f r i e n d s a n d ch u r ch f a m i l y a d d e d va l u e a n d e n j o ym e n t t o m y t i m e a t U S F a s t h e y q u i ckl y b e ca m e a si g n i f i c a n t p a r t o f m y l i f e T h a n k yo u a l l f o r p r o vi d i n g m e w i t h a h o m e a w a y f r o m h o m e

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i T a b l e o f C o n t e n t s L i st o f F i g u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i i i A b st r a ct . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v C h a p t e r O n e : I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 T h e C o r n e a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 D e ve l o p m e n t o f t h e C o r n e a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 E C M C o m p o n e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 C o l l a g e n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 P r o t e o g l yca n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 G r o w t h F a ct o r s a n d R e ce p t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 W o u n d H e a l i n g O v e r vi e w . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 C o r n e a l W o u n d H e a l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 C a u se s o f B l i n d n e ss . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 O u t l i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 S p e ci f i c A i m s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 C h a p t e r T w o : T h e E f f e ct o f G r o w t h F a c t o r S i g n a l i n g o n K e r a t o cyt e s I n V i t r o a n d I t s R e l a t i o n sh i p t o t h e P h a s e s o f S t r o m a l W o u n d R e p a i r . . . . . . . . . 1 7 A b st r a ct . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 I n t r o d u ct i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9

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i i M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 R e su l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 D i scu ssi o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 C h a p t e r T h r e e : G r o w t h F a ct o r S p e ci f i c E xt r a ce l l u l a r M a t r i x F o r m a t i o n B y K e r a t o cyt e C u l t u r e s U n d e r A g a r o se . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7 A b st r a ct . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 I n t r o d u ct i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1 R e su l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 D i scu ssi o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9 C h a p t e r F o u r : P r i m a r y K e r a t o cyt e E xp a n si o n w i t h R e t e n t i o n o f N a t i ve P h e n o t yp e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 0 I n t r o d u ct i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2 R e su l t s a n d D i scu ssi o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2 C h a p t e r F i ve : C o n cl u si o n s a n d F u t u r e D i r e ct i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 8 R e f e r e n ce s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 3 A p p e n d i ce s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 0 A p p e n d i x A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1 A b o u t t h e A u t h o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E n d P a g e

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i i i L i s t o f F i g u r e s F i g u r e 1 C o r n e a i n r e l a t i o n s h i p t o t h e e ye . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 F i g u r e 2 A n a t o m y o f t h e C o r n e a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 F i g u r e 3 S m a l l l e u ci n e r i ch p r o t e o g l yca n ( S L R P ) st r u ct u r e . . . . . . . . . . . . . . 7 F i g u r e 4 P h a se s o f c o r n e a l st r o m a l w o u n d h e a l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 F i g u r e 5 K e r a t o cyt e D N A syn t h e si s a n d ce l l d e n si t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 F i g u r e 6 P r o t e i n a n d c o l l a g e n syn t h e si s b y ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e . . . . . . . . 3 8 F i g u r e 7 W e st e r n b l o t a n a l ysi s o f m e d i a f r o m d a y 1 0 k e r a t o cyt e cu l t u r e s u si n g a n t i b o d i e s t o E D A f i b r o n e ct i n a n d t o t a l f i b r o n e ct i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 F i g u r e 8 C o o m a ssi e b l u e st a i n a b l e p r o t e i n s se c r e t e d i n t o t h e m e d i a b y ke r a t o cyt e c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 F i g u r e 9 W e st e r n b l o t a n a l ysi s o f m e d i a f r o m d a y 1 0 k e r a t o cyt e cu l t u r e s u si n g a n t i b o d i e s t o p r o co l l a g e n t yp e I . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 F i g u r e 1 0 F i b r i l l a r co l l a g e n p r e se n t i n t h e m e d i u m a n d c e l l l a ye r o f d a y 1 0 ke r a t o cyt e s cu l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 F i g u r e 1 1 G l yco sa m i n o g l yca n syn t h e si s b y ke r a t o cyt e c u l t u r e s . . . . . . . . . . . 4 3 F i g u r e 1 2 W e st e r n b l o t a n a l ysi s o f m e d i u m f r o m d a y 1 0 ke r a t o cyt e cu l t u r e s u si n g a n t i b o d i e s t o d e co r i n b i g l yca n ke r a t o ca n a n d l u m i ca n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 F i g u r e 1 3 D N A co n t e n t a n d p r o co l l a g e n t yp e I p r o d u ct i o n ke r a t o cyt e s

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i v cu l t u r e d f i r st w i t h F G F 2 a n d t h e n ch a n g e d t o e a ch o f t h e g r o w t h f a ct o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 F i g u r e 1 4 S ch e m a t i c r e p r e se n t a t i o n o f p o ssi b l e g r o w t h f a ct o r m e d i a t e d w o u n d h e a l i n g o f t h e co r n e a l st r o m a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 F i g u r e 1 5 C o l l a g e n l e ve l s a sso ci a t e d w i t h t h e ce l l l a ye r o f ke r a t o cy t e s i n st a n d a r d a n d a g a r o s e cu l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 3 F i g u r e 1 6 C o l l a g e n l e ve l s i n t h e m e d i a o f ke r a t o cyt e s i n st a n d a r d a n d a g a r o se c u l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 4 F i g u r e 1 7 C o l l a g e n l e ve l s a sso ci a t e d w i t h t h e ce l l l a ye r a n d m e d i a co m b i n e d o f ke r a t o cyt e s i n s t a n d a r d a n d a g a r o se cu l t u r e s . . . . . . 6 5 F i g u r e 1 8 P r o co l l a g e n t o co l l a g e n c o n ve r si o n r a t e s f o r k e r a t o cyt e s i n st a n d a r d a n d a g a r o s e cu l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 6 F i g u r e 1 9 F i b r o n e c t i n l e ve l s i n t h e m e d i a o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d u n d e r a g a r o se . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 F i g u r e 2 0 I m m u n o f l o r e sce n t st a i n i n g o f t h e ce l l l a ye r o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d u n d e r a g a r o se . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 8 F i g u r e 2 1 E l e ct r o n m i cr o s co p y o f t h e ce l l l a ye r o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d u n d e r a g a r o s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 F i g u r e 2 2 C e l l g r o w t h a n d ke r a t o ca n e xp r e ssi o n b y cu l t u r e s d e r i ve d f r o m p a sse d b o vi n e ke r a t o cyt e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 F i g u r e 2 3 C e l l g r o w t h a n d ke r a t o ca n e xp r e ssi o n b y cu l t u r e s d e r i ve d f r o m p a sse d b o vi n e co r n e a l f i b r o b l a st s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 7 F i g u r e 2 4 A g a r o se o ve r l a y e n h a n ce s t h e co n ve r si o n o f p r o co l l a g e n t o

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v co l l a g e n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 0 F i g u r e 2 5 P r o p o se d se q u e n t i a l a c t i o n o f g r o w t h f a ct o r s t o p r o d u c e t h e p h a se s o f w o u n d h e a l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1 F i g u r e 2 6 S D S / P A G E / B l u e st a i n o f p e p si n d i g e st s f r o m ke r a t o cyt e cu l t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 2

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vi T h e E f f e c t o f G r o w t h F a c t o r s o n t h e C o r n e a l S t r o m a E x t r a c e l l u l a r M a t r i x P r o d u c t i o n b y K e r a t o c y t e L a T i a S h a q u a n E t h e r e d g e A B S T R A C T T h e co r n e a l w o u n d h e a l i n g p r o ce ss i s a co m p l e x p r o ce ss, w h i c h o f t e n l e a d s t o t h e d e ve l o p m e n t o f sca r t i ssu e w i t h l o ss o f t r a n s p a r e n cy. W h e n t h e co r n e a i s w o u n d e d so m e o f t h e vi a b l e ke r a t o cyt e s a r e a c t i va t e d b y g r o w t h f a ct o r s t o p r o l i f e r a t e a n d r e p a i r t h e w o u n d b y t h e p r o d u ct i o n o f a n e w e xt r a ce l l u l a r m a t r i x ( E C M ) t h a t i s e i t h e r n o r m a l o r i s d i so r g a n i ze d ( f i b r o t i c) T h e f i r st p a r t o f t h i s d i ss e r t a t i o n a i m s t o sh o w t h a t t h e g r o w t h f a ct o r s I G F I T G F F G F 2 a n d P D G F st i m u l a t e ke r a t o cyt e s t o sy n t h e si ze d i f f e r e n t l e v e l s o f co l l a g e n s a n d p r o t e o g l yca n s a n d a r e t h e r e f o r e r e sp o n si b l e f o r i n i t i a t i n g t h e w o u n d h e a l i n g r e p a i r p r o ce ss. F G F 2 st i m u l a t e d ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e b u t d i d n o t st i m u l a t e co l l a g e n p r o d u ct i o n ; I G F I a n d P D G F st i m u l a t e d ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e a n d p r o d u ce a co l l a g e n o u s E C M t h a t co u l d r e st o r e t r a n s p a r e n cy; w h i l e T G F st i m u l a t e d ke r a t o cyt e s p r o d u ce a f i b r o co l l a g e n o u s E C M t h a t i s o p a q u e T h e se co n d p a r t o f t h i s d i sse r t a t i o n a i m s t o e v a l u a t e co l l a g e n f i b r i l co n t e n t d i st r i b u t i o n a n d o r i e n t a t i o n i n t h e E C M d e p o si t e d b y ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n I G F I T G F F G F 2 a n d P D G F u n d e r a l a y e r o f a g a r o s e : a c u l t u r e

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vi i m o d i f i ca t i o n t h a t e n h a n ce s t h e f o r m a t i o n o f E C M i n vi t r o F G F 2 a g a r o se cu l t u r e s h a d l i t t l e E C M a n d t h e ke r a t o cyt e s w e r e i n cl o se c e l l co n t a ct w h i l e I G F I T G F a n d P D G F a g a r o se cu l t u r e s h a d t h e l e a st ce l l co n t a c t w i t h a n e xt e n si ve f i b r i l l a r E C M T h i s n e w l y d e v e l o p e d a g a r o se o ve r l a y ce l l cu l t u r e syst e m i n cr e a se s E C M f o r m a t i o n w i t h t h e ce l l l a ye r o n l y w h e n t h e sy n t h e si s o f co l l a g e n i s st i m u l a t e d a n d t h a t t h e E C M m o r p h o l o g y i s g r o w t h f a ct o r sp e ci f i c. C e l l cu l t u r e h a s p r o ve n t o b e a r e l i a b l e t e ch n i q u e t o st u d y t h e k e r a t o cyt e s r e sp o n se t o t r a u m a a n d d i se a se ; h o w e v e r l i m i t a t i o n s e xi st P r i m a r y ke r a t o cyt e s t h a t p o sse ss q u i e sce n t p h e n o t yp e a r e u n a b l e t o b e r a p i d l y e xp a n d e d o r su b cu l t u r e d w i t h o u t t h e a d d i t i o n o f a m i t o g e n ( s) M o st c o m m o n l y, ke r a t o cyt e s a r e cu l t u r e d a n d p a ssa g e d i n t h e p r e se n ce o f f e t a l b o vi n e s e r u m ( F B S ) w h i ch a ct i va t e t h e c e l l s t o p r o l i f e r a t e a n d d i f f e r e n t i a t e i n t o f i b r o b l a st s o r m yo f i b r o b l a st s a s w e l l a s l o se e xp r e ssi o n o f t h e i r u n i q u e t r a n sp a r e n cy e n a b l i n g g e n e p r o d u ct s T h e t h i r d p a r t o f t h i s d i sse r t a t i o n a i m s t o d e v e l o p a d e f i n e d cu l t u r e m e d i a t h a t ca n b e u se d t o e x p a n d a n d su b c u l t u r e k e r a t o cyt e s t h a t e x p r e ss ke r a t o cyt e sp e ci f i c m a r ke r s. C u l t u r e m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h F G F 2 co m b i n e d w i t h I T S w a s u se d t o : e xp a n d a n d su b cu l t u r e p r i m a r y b o vi n e ke r a t o cyt e s w h i l e m a i n t a i n i n g t h e i r e x p r e ssi o n o f ke r a t o ca n a n d t o r e st o r e ke r a t o ca n e xp r e ssi o n t o b o vi n e ke r a t o cyt e s e x p a n d e d a n d s u b cu l t u r e d w i t h m e d i a co n t a i n i n g 2 5 % F B S T h i s d i sse r t a t i o n sh o w s t h e si g n i f i c a n ce o f si g n a l i n g m o l e c u l e s i n vi t r o t o p r o d u ce k e r a t o cyt e cu l t u r e s u se f u l f o r u n d e r st a n d i n g n o r m a l st r o m a l b i o l o g y a n d i t s r e p a i r p r o ce ss.

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1 C h a p t e r O n e I n t r o d u c t i o n

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2 T h e C o r n e a T h e co r n e a i s a u n i q u e l y t r a n sp a r e n t st r u ct u r e t h a t h a s a p o w e r f u l r e f r a ct i ve su r f a c e w h i c h p r o d u ce s 2 / 3 o f t h e e ye s t o t a l f o cu si n g p o w e r ( F i g 1 ) T h e co r n e a i s vo i d o f b l o o d su p p l y; t h e r e f o r e i t r e ce i ve s i t s n u t r i e n t s b y d i f f u si o n f r o m t h e t e a r f l u i d a n d a q u e o u s h u m o u r I n h u m a n s, t h e co r n e a h a s a t h i ckn e ss o f 0 5 0 8 m m a n d a d i a m e t e r o f a b o u t 1 1 5 m m T h e co r n e a i s m a d e u p o f t h r e e d i st i n ct ce l l u l a r l a y e r s t h a t a r e se p a r a t e d b y b a se m e n t m e m b r a n e s ( F i g 2 ) [ se e r e vi e w s [ 1 2 ] T h e e p i t h e l i a l l a ye r i s t h e o u t e r m o st r e g i o n t h a t f u n ct i o n s a s a b a r r i e r a n d t o a b so r b o xyg e n a n d o t h e r ce l l n u t r i e n t s l o ca t e d i n t h e t e a r f l u i d T h e st r o m a i s t h e t h i cke st l a ye r a n d f u n c t i o n s t o p r o vi d e t h e co r n e a w i t h st r e n g t h a n d sh a p e I t i s se p a r a t e d f r o m t h e e p i t h e l i u m a n t e r i o r l y b y b o w m a n s m e m b r a n e a n d f r o m t h e e n d o t h e l i u m p o st e r i o r l y b y d e sc e m e t s m e m b r a n e b o t h o f w h i ch a r e a ce l l u l a r T h e e n d o t h e l i a l l a y e r i s a si n g l e l a ye r o f ce l l s t h a t p u m p s e xce ss f l u i d o u t o f t h e st r o m a A l l o f t h e se l a y e r s w o r k t o g e t h e r t o t r a n sm i t a n d r e f r a c t l i g h t o n t h e su r f a c e o f t h e r e t i n a

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3 F i g u r e 1 C o r n e a i n r e l a t i o n sh i p t o t h e e ye W i l so n S A a n d A L a st M a n a g e m e n t o f c o r n e a l a b r a si o n s. A m F a m P h ysi ci a n 2 0 0 4 7 0 ( 1 ) : p 1 2 3 8 F i g u r e 2 A n a t o m y o f t h e co r n e a W i l so n S A a n d A L a st M a n a g e m e n t o f co r n e a l a b r a si o n s. A m F a m P h ysi ci a n 2 0 0 4 7 0 ( 1 ) : p 1 2 3 8

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4 D e v e l o p m e n t o f t h e C o r n e a C o r n e a l m o r p h o g e n e si s r e su l t s f r o m a se q u e n ce o f co n t r o l l e d d e ve l o p m e n t a l e ve n t s. I n s o m e l o w e r ve r t e b r a t e s, t h e c o r n e a l e p i t h e l i u m se cr e t e s a n d a sse m b l e s a p r i m a r y st r o m a t h a t i s a ce l l u l a r a n d co n t a i n s co l l a g e n t yp e s I I I X a n d I T h e p r i m a r y st r o m a i s co m p o se d o f o n e o r t w o l a ye r s o f o r t h o g o n a l l a ye r s o f f i b r i l s a n d h a s b e e n sh o w n t o se r ve a s a t e m p l a t e f o r t h e su b se q u e n t i n va si o n o f n e u r a l cr e s t ce l l s t h a t d i f f e r e n t i a t e i n t o k e r a t o cy t e s. T h e p r e su m p t i ve ke r a t o cyt e s p r o l i f e r a t e a n d syn t h e si ze t h e se co n d a r y o r m a t u r e st r o m a T h e d e ve l o p m e n t o f t h e m a t u r e st r o m a i s i n i t i a t e d b y t h e sw e l l i n g o f t h e p r i m a r y s t r o m a t h a t i s t r i g g e r e d b y t h e r e m o va l o f co l l a g e n t y p e I X f r o m t h e p r i m a r y s t r o m a a n d t h e p r o d u ct i o n o f h ya l u r o n i c a ci d T h e st r o m a t h e n u n d e r g o e s d e h y d r a t i o n a n d c o m p a ct i o n ; t h u s t h e e xt r a c e l l u l a r ( E C M ) co m p o n e n t s o f t h e st r o m a b e c o m e m o r e co n c e n t r a t e d r e s u l t i n g i n t h e h i g h l y o r g a n i ze d a n d u n i f o r m a r r a y o f co l l a g e n f i b r i l s t h a t i s t r a n sp a r e n t T h e m a t u r e st r o m a p r i m a r i l y co n si st s o f c o l l a g e n t y p e s I a n d V a n d p r o t e o g l yca n s. E C M C o m p o n e n t s o f t h e M a t u r e C o r n e a T h e t r a n sp a r e n cy o f a m a t u r e co r n e a i s m o st l y a t t r i b u t e d t o t h e co r n e a st r o m a w h i ch co n st i t u t e s 9 0 % o f t h e m a t u r e c o r n e a l t h i ck n e ss. T h e co r n e a st r o m a i s c o m p r i se d o f a h i g h l y o r g a n i ze d u n i q u e l y t r a n s p a r e n t E C M sp a r se l y p o p u l a t e d w i t h ke r a t o cyt e s. T h e E C M i s c o m p o se d p r i m a r i l y o f co l l a g e n t yp e s I a n d V a n d t w o m a j o r t yp e s o f sm a l l l e u ci n e r i c h p r o t e o g l yca n s; ch o n d r o i t i n su l f a t e ( d e co r i n ) a n d k e r a t a n su l f a t e ( l u m i ca n a n d ke r a t o ca n ) [ 2 ] T h e co l l a g e n

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5 f i b r i l s p r e se n t i n t h e co r n e a l st r o m a a r e h e t e r o t r o p h i c a n d a r e a r r a n g e d i n a l t e r n a t e l a ye r s a n d a r e se p a r a t e d b y p r o t e o g l yca n s [ 3 4 ] T h e sm a l l si ze o f t h e p r o t e o g l yc a n s d e t e r m i n e s t h e sp a ci n g o f f i b r i l s a n d t h e c o r e p r o t e i n s o f t h e p r o t e o g l yc a n s a n d co l l a g e n t yp e V r e g u l a t e t h e f i b r i l d i a m e t e r [ 5 6 ] E m b e d d e d i n t h e co r n e a l co l l a g e n o u s m a t r i x a r e ke r a t o cy t e s. T h e y a cco u n t f o r 2 4 % o f t h e st r o m a l vo l u m e a n d a r e r e sp o n si b l e f o r t h e E C M p r o d u c t i o n T h e y a r e ch a r a ct e r i ze d b y a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y a n d f o r m a t h r e e d i m e n si o n a l n e t w o r k b y co n t a ct w i t h t h e i r e x t e n si ve p r o ce sse s [ 7 9 ] C o l l a g e n C o l l a g e n i s t h e m o st a b u n d a n t p r o t e i n i n ve r t e b r a t e co r n e a s a n d m a ke s u p a p p r o xi m a t e l y 8 0 % o f t h e t o t a l co r n e a l p r o t e i n T h e r e a r e t h r e e m a j o r f a m i l i e s o f co l l a g e n s: f i b r i l f o r m i n g co l l a g e n s, f i b r i l a sso ci a t e d co l l a g e n s w i t h i n t e r r u p t e d t r i p l e h e l i ce s, a n d n o n f i b r i l l a r co l l a g e n s. T h e co l l a g e n st r o m a co n t a i n s co l l a g e n t yp e s I a n d V w h i ch a r e f i b r i l f o r m i n g a n d t h e b a se m e n t m e m b r a n e o f t h e e p i t h e l i u m a n d e n d o t h e l i u m co n t a i n s co l l a g e n t yp e I V w h i c h i s a n o n f i b r i l f o r m i n g co l l a g e n A l t h o u g h t h e r e a r e d i f f e r e n ce s a m o n g c o l l a g e n s, t h e y a l l co n t a i n r e g i o n s w h e r e a g l yci n e i s e ve r y t h i r d r e si d u e a n d a r e co m p r i se d o f 3 p o l yp e p t i d e ch a i n s [ 1 0 ] T h e se ch a i n s u n d e r g o e xt e n si ve p o st t r a n sl a t i o n a l m o d i f i ca t i o n s su ch a s h yd r o xyl a t i o n g l yco syl a t i o n a n d d i s u l f i d e f o r m a t i o n [ 1 1 ] T h e h yd r o xyl a t i o n o f se l e ct e d p r o l i n e a n d l ysi n e r e si d u e s i s n e c e ss a r y t o st a b i l i ze t h e t r i p l e h e l i ca l r e g i o n s a n d a sco r b a t e i s c o f a ct o r n e e d e d f o r h yd r o l yl a t i o n [ 1 2 ]

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6 T h e d i su l f i d e b o n d s a i d i n a l i g n i n g t h e m o d i f i e d p o l yp e p t i d e ch a i n s a n d i n i t i a t e t h e f o r m a t i o n o f t h e t r i p l e h e l i x st a r t i n g a t t h e C t e r m i n a l e n d T h e r e su l t a n t p r o co l l a g e n m o l e cu l e i s co m p r i se d o f a t r i p l e h e l i ca l d o m a i n w h i ch i s 3 3 % g l yci n e a n d n o n h e l i ca l N a n d C t e r m i n a l g l o b u l a r r e g i o n s [ 1 1 ] T h e p r o c o l l a g e n N a n d C p r o p e p t i d e s a r e cl e a ve d b y e n zy m e s: a p r o c o l l a g e n N p r o t e i n a se a n d p r o co l l a g e n a C p r o t e i n a se r e sp e ct i ve l y, p r o d u ci n g co l l a g e n m o l e cu l e s t h a t a sso ci a t e i n t o c o l l a g e n f i b r i l s [ 1 3 ] T h e se co l l a g e n f i b r i l s a r e t h e m a j o r co m p o n e n t s o f m o st E C M s. P r o t e o g l y c a n s P r o t e o g l yca n s a r e a l so p a r t o f m o s t E C M s a n d a r e a ss o ci a t e d w i t h co l l a g e n f i b r i l s. P r o t e o g l yc a n s a r e co m p o se d o f a co r e p r o t e i n w i t h co va l e n t l y l i n ke d g l yco sa m i n o g l yca n ( G A G ) ch a i n s vi a s e r i n e r e si d u e s. G l yco sa m i n o g l yca n s a r e l i n e a r r e p e a t e d d i sa cch a r i d e s t h a t a r e u su a l l y su l f a t e d a n d h a ve a m o l e c u l a r w e i g h t o f 1 0 1 0 0 kD A H ya l u r o n a n i s a n u n s u l f a t e d G A G S u l f a t e d G A G s a r e ch o n d r o i t i n su l f a t e d e r m a t a n su l f a t e k e r a t a n su l f a t e h e p a r i n su l f a t e a n d h e p a r a n su l f a t e P r o t e o g l yca n s a r e cl a ssi f i e d b y t h e i r c o r e p r o t e i n s a n d a r e g r o u p e d i n t o t h r e e m a j o r f a m i l i e s: m o d u l a r ce l l s u r f a ce a n d s m a l l l e u ci n e r i ch p r o t e o g l yca n s ( S L R P s)

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7 M o d u l a r p r o t e o g l yca n s c o n t a i n l a r g e co r e p r o t e i n s co m p r i s e d o f m u l t i p l e a n d o f t e n r e p e a t i n g su b u n i t s a n d ca n b e h i g h l y g l yco syl a t e d [ 1 4 ] T h e se ca n b e f u r t h e r d i vi d e d i n t o t w o su b f a m i l i e s: h y a l e ct a n s ( ve r si ca n a g g r e ca n n e u r o c a n a n d b r e vi c a n ) w h i ch b i n d h y a l u r o n a n a n d l e c t i n b i n d i n g p r o t e o g l yca n s ( p e r l i ca n a g r i n a n d t e st i ca n ) T h e ce l l su r f a c e p r o t e o g l yca n s a r e a l s o d i vi d e d i n t o t w o su b f a m i l i e s: co r e p r o t e i n s w i t h a m e m b r a n e s p a n n i n g d o m a i n ( syn d e ca n ) a n d w i t h a g l yco syl p h o sp h a t i d yl i n o si t o l ( G P I ) l i n k a g e ( g l yp i ca n ) T h e S L R P s a r e ch a r a ct e r i ze d b y t a n d e m a r r a ys o f l e u ci n e r i ch r e p e a t s a n d t h e p r e se n ce o f a t l e a st o n e G A G si d e ch a i n ( F i g 3 ) [ 1 5 ] T h e r e a r e t w o su b f a m i l i e s o f S L R P s: d e r m a t a n / ch o n d r o i t i n s u l f a t e ( d e co r i n a n d b i g l yca n ) a n d ke r a t a n su l f a t e ( l u m i c a n ke r a t o ca n a n d f i b r o m o d u l i n ) p r o t e o g l yca n s. L u m i ca n a n d ke r a t o ca n a r e i m p o r t a n t f o r t h e t r a n sp a r e n cy o f t h e co r n e a b y r e g u l a t i n g t h e sp a ci n g a n d d i a m e t e r o f t h e co l l a g e n f i b r i l s [ 5 6 1 6 ] F i g u r e 3 S m a l l l e u ci n e r i ch p r o t e o g l yca n ( S L R P ) st r u ct u r e

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8 G r o w t h F a c t o r s a n d R e c e p t o r s G r o w t h f a ct o r s a r e ce l l se c r e t e d so l u b l e p r o t e i n s t h a t b i n d r e ce p t o r s o n t h e ce l l su r f a ce o f t h e sa m e ce l l o r i n o t h e r ce l l s [ 1 7 ] T h e r e a r e t w o f a m i l i e s o f ce l l su r f a ce r e ce p t o r s: r e ce p t o r t yr o si n e ki n a s e a n d G p r o t e i n co u p l e d r e ce p t o r [ 1 8 ] B o t h t h e r e c e p t o r a n d g r o w t h f a ct o r m a y h a ve m u l t i p l e i so f o r m s t h a t h a ve d i f f e r e n t b i n d i n g a f f i n i t i e s a n d f u n ct i o n s [ 1 7 ] T h e b i n d i n g o f g r o w t h f a ct o r s t o t h e i r r e s p e ct i ve r e ce p t o r s ca n p r o m o t e t h e p r o l i f e r a t i o n m i g r a t i o n d i f f e r e n t i a t i o n o r su r vi va l o f ce l l s d u r i n g d e ve l o p m e n t t i ssu e r e p a i r a n d p a t h o l o g i e s. T h e e f f e ct o f g r o w t h f a ct o r s ca n va r y d e p e n d i n g o n w h e n i t i s a ct i va t e d i n w h i ch ce l l t yp e i s i t p r o d u ce d a n d h o w i t i n t e r a ct s w i t h o t h e r f a c t o r s su ch a s e xt r a c e l l u l a r m a t r i x co m p o n e n t s. T h e r e a r e m a n y d i f f e r e n t g r o w t h f a ct o r s a n d t h e r e se a r ch co n d u ct e d i n t h i s t h e si s h a s f o cu se d o n i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r ( I G F I ) t r a n sf o r m i n g g r o w t h f a ct o r b e t a ( T G F ) F i b r o b l a s t g r o w t h f a ct o r 2 ( F G F 2 ) p l a t e l e t d e r i ve d g r o w t h f a ct o r ( P D G F ) I G F I a n d F G F 2 a r e si n g l e ch a i n p o l yp e p t i d e s. I G F I h a s a 5 0 % a m i n o a ci d h o m o l o g y t o i n su l i n a n d I G F 2 a n d i t b i n d s t o t h e I G F I r e ce p t o r [ 1 8 ] F G F 2 b e l o n g s t o t h e h e p a r i n b i n d i n g g r o w t h f a ct o r f a m i l y. F G F 2 i s c o m p o s e d o f 1 4 6 a m i n o a ci d s a n d b i n d s w i t h a l o w a f f i n i t y t o h e p a r i n a n d h e p e r a n su l f a t e p r o t e o g l yc a n s. T h i s a sso ci a t i o n p r e v e n t s t h e g r o w t h f a ct o r f r o m b e i n g d e g r a d e d a n d i n cr e a se s t h e a f f i n i t y f o r 1 o f 4 ce l l su r f a c e r e ce p t o r s ( F G F R 1 4 ) f o r F G F 2 U n l i ke I G F I a n d F G F 2 P D G F i s a d i m e r co m p o se d o f t w o p o l yp e p t i d e ch a i n s, A a n d B w h i ch c a n f o r m t h r e e d i f f e r e n t i so f o r m s ( P D G F A A P D G F A B a n d P D G F B B ) T h e A a n d B p o l yp e p t i d e ch a i n s a r e a p p r o xi m a t e l y 1 0 0 a m i n o

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9 a ci d r e si d u e s l o n g a n d h a ve a 6 0 % a m i n o a ci d h o m o l o g y [ 1 9 ] T h e s e p r o t e i n s a r e cl e a ve d i n t r a c e l l u l a r l y a n d a r e se cr e t e d i n t h e i r a ct i ve f o r m s [ 1 9 ] E a ch o f t h e se i so f o r m s ca n b i n d t o t h e a l p h a r e ce p t o r b u t P D G F B B i s t h e o n l y i so f o r m t h a t ca n b i n d t o t h e b e t a r e c e p t o r T h e r e a r e t h r e e h o m o d i m e r i c m a m m a l i a n i so f o r m s o f T G F b e t a [ 2 0 ] t h a t a r e 6 0 8 0 % h o m o l o g o u s. T h e m o st c h a r a ct e r i ze d m e m b e r o f t h e f a m i l y o f T G F b e t a p r o t e i n s i s T G F b e t a 1 T G F b e t a i s syn t h e si ze d a s a p r e cu r so r p r o t e i n t h a t r e q u i r e s a ct i va t i o n i n t o a m a t u r e f o r m f o r r e ce p t o r b i n d i n g a n d su b se q u e n t a ct i va t i o n o f si g n a l t r a n sd u ct i o n p a t h w a ys. T h e T G F b e t a f a m i l y ca n b i n d t o t h r e e m e m b r a n e r e ce p t o r s: R I R I I a n d R I I I I G F I F G F 2 a n d P D G F a ct t h r o u g h r e ce p t o r t yr o si n e ki n a s e s b y b i n d i n g s i m u l t a n e o u sl y t o t w o r e ce p t o r ch a i n s. A f t e r b i n d i n g t h e r e ce p t o r s a n d so m e t i m e s t h e l i g a n d s t h e m se l ve s a r e p h o s p h o r yl a t e d o n t yr o si n e s, t h u s m a y i n i t i a t e m u l t i p l e i n t r a ce l l u l a r si g n a l i n g p a t h w a y s. T h e m a j o r p a t h w a y a ss o ci a t e d w i t h t h e se g r o w t h f a c t o r s i s m i t o g e n a ct i va t e d p r o t e i n ki n a se ( M A P K i n a se ) T G F b e t a i s sl i g h t l y d i f f e r e n t b e c a u se i t a ct s t h r o u g h r e ce p t o r se r i n e / t h r e o n i n e ki n a se s b y a ct i va t i n g a t yp e I I r e ce p t o r t h a t r e cr u i t s, p h o s p h o r yl a t e s, a n d a ct i va t e t yp e I r e ce p t o r ; t h u s i n i t i a t i n g t h e S m a d d e p e n d e n t si g n a l i n g p a t h w a y. W o u n d H e a l i n g O v e r v i e w T h e r e a r e t h r e e m a j o r p h a se s o f t h e w o u n d h e a l i n g p r o c e ss: i n f l a m m a t o r y p h a s e t h e p r o l i f e r a t i ve p h a se a n d t h e r e m o d e l i n g p h a s e [ 2 1 2 2 ] T h e i n f l a m m a t o r y p h a s e b e g i n s i m m e d i a t e l y a f t e r w o u n d i n g b y t h e i n va si o n o f

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1 0 l ym p h o cyt e s a n d m a c r o p h a g e s a n d i s ch a r a ct e r i ze d b y t h e cl o t t i n g ca sca d e T h e ce l l s t h a t m a k e u p t h e cl o t a n d t h e i n v a d i n g ce l l s r e l e a s e g r o w t h f a ct o r s a n d cyt o ki n e s su ch a s P D G F a n d T G F [ 2 1 2 3 ] S u b se q u e n t l y, t h e p r o l i f e r a t i ve p h a se b e g i n s a s i n va d i n g f i b r o b l a st s p r o l i f e r a t e a n d syn t h e si ze a n e w E C M [ 2 1 ] D u r i n g t h e f i n a l r e m o d e l i n g p h a se t h e r e i s a n i n cr e a se i n E C M p r o d u c t i o n a n d b r e a kd o w n T h e r e ce n t l y f o r m e d E C M b e co m e s m o r e o r g a n i ze d a n d cr o ss l i n ke d e ve n t u a l l y p r o vi d i n g a p p r o xi m a t e l y 8 0 % o f t h e st r e n g t h o f t h e u n i n j u r e d t i ssu e [ 2 2 ] C o r n e a l W o u n d H e a l i n g T h e co r n e a s a b i l i t y t o r e m a i n t r a n sp a r e n t c a n b e co m p r o m i se d w h e n t h e co r n e a e n co u n t e r s t r a u m a i n f e ct i o n u l ce r a t i o n a n d o t h e r p a t h o l o g i e s. T h e w o u n d r e p a i r p r o ce ss o f t h e co r n e a i s si m i l a r t o ski n t e n d o n a n d o t h e r t i ssu e t yp e s; h o w e ve r t h e d i st i n ct a va sc u l a r n a t u r e a n d t h e u n i q u e l y o r g a n i ze d E C M o f t h e co r n e a ca u se d i f f e r e n ce s i n t h e m e c h a n i s m [ 2 4 2 5 ] I n a h e a l t h y co r n e a t h e r e a r e ve r y f e w r e si d e n t i n f l a m m a t o r y c e l l s p r e se n t [ 2 6 2 7 ] b u t t h e y h a ve b e e n sh o w n t o i n f i l t r a t e t h e co r n e a l st r o m a i m m e d i a t e l y a f t e r w o u n d i n g [ 2 8 2 9 ] T h e se ce l l s a l o n g w i t h t h e l a cr i m a l g l a n d t h e e p i t h e l i u m a n d t h e n a t i ve st r o m a l ce l l s ( ke r a t o cyt e s) p r o d u ce t h e g r o w t h f a c t o r s t h a t a r e su p p l i e d t o t h e si t e o f i n j u r y [ 3 0 ] U p o n w o u n d i n g T G F b e t a a n d I L 1 a r e r e l e a se d f r o m t h e d i sr u p t e d e p i t h e l i u m i n t o t h e st r o m a I L 1 h a s b e e n sh o w n t o p r o m o t e a p o p t o si s o f d a m a g e d ke r a t o cyt e s a n d ke r a t o cyt e s f l a n ki n g t h e w o u n d [ 3 1 ] I n a d d i t i o n I L 1 i n c r e a se s t h e p r o d u ct i o n o f P D G F a n d o t h e r g r o w t h

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1 1 f a ct o r s, a n d a ct i va t e s n e u t r o p h i l s, w h i c h a r e c e l l s t h a t cl e a r t h e w o u n d si t e o f i n va d i n g b a ct e r i a a n d ce l l u l a r d e b r i s [ 3 2 ] M e t a l l o p r o t e i n a se s a r e a l so r e l e a se d t o f u r t h e r cl e a r t h e w o u n d si t e b y d e g r a d i n g c o l l a g e n p r o t e o g l yc a n s, a n d o t h e r E C M p r o t e i n s [ 3 3 3 4 ] T h e i n i t i a l st r o m a l a p o p t o si s a n d E C M d e g r a d a t i o n i n t h e co r n e a i s f o l l o w e d b y t h e a ct i va t i o n p r o l i f e r a t i o n a n d m i g r a t i o n o f t h e r e m a i n i n g vi a b l e ke r a t o cyt e s i n t o t h e d e p l e t e d st r o m a t o b e g i n t o r e p l e n i sh t h e st r o m a S o m e o f t h e a ct i va t e d ke r a t o cyt e s a r e i n i t i a t e d b y g r o w t h f a ct o r s t o t r a n si t i o n i n t o d i ve r g e n t p h e n o t yp e s. F G F 2 h a s b e e n f o u n d t o ca u se ke r a t o cyt e s t o b e co m e m o r e sp i n d l e sh a p e d [ 3 5 ] i n cr e a se t h e i r p r o l i f e r a t i o n a n d m i g r a t i o n [ 2 0 ] a n d p r o m o t e ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n syn t h e si s [ 3 5 ] T G F b e t a ca u se s ke r a t o cyt e s t o b e co m e m y o f i b r o b l a st s, w h i ch a r e a sso ci a t e d w i t h a h i g h l y f i b r o t i c w o u n d p h e n o t yp e T h e s e ce l l s a r e ch a r a ct e r i ze d b y d e c r e a se d t r a n s p a r e n cy w h i ch i s a sso ci a t e d w i t h t h e r e d u ct i o n o f co r n e a l cr yst a l l i n s a n d t h e e xp r e ssi o n o f t h e cyt o p l a s m i c p r o t e i n a l p h a sm o o t h m u scl e a ct i n [ 3 6 ] S t u d i e s h a ve sh o w n t h a t T G F b e t a a l so st i m u l a t e s t h e p r o d u ct i o n o f a d d i t i o n a l g r o w t h f a ct o r s, co l l a g e n a n d o t h e r p r o t e i n s a sso ci a t e d w i t h t h e r e m o d e l i n g o f t h e E C M [ 3 7 ] I G F I I h a s b e e n sh o w n t o b e a n o r m a l co m p o n e n t o f t h e st r o m a l E C M a n d t o b e m a d e b y k e r a t o cyt e s d u r i n g co r n e a l d e v e l o p m e n t [ 3 8 3 9 ] T h e r e m o d e l i n g o f t h e co r n e a l st r o m a ca n e n d i n co r n e a l f i b r o si s o r r e st o r a t i o n o f c o r n e a l t r a n s p a r e n cy I t h a s b e e n p r o p o se d t h a t a n a l t e r e d r a t i o o f co l l a g e n t yp e s I a n d V a n a l t e r e d e xp r e ssi o n o f p r o t e o g l yca n s i n t h e w o u n d e d co r n e a l st r o m a a n d a d e cr e a se i n co r n e a l c r y st a l l i n p r o d u c t i o n b y ke r a t o cyt e s

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1 2 m a y b e r e sp o n si b l e f o r t h e o p a ci t y. T h e r e a s o n t h a t i n j u r e d ke r a t o cyt e s f a i l t o r e g e n e r a t e a w e l l o r g a n i ze d E C M r e m a i n s u n kn o w n I t i s p r o b a b l e t h a t g r o w t h f a ct o r s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n r e g u l a t i n g t h e e xp r e ssi o n o f t h e g e n e s n e e d e d f o r b o t h w o u n d h e a l i n g a n d r e st o r a t i o n o f t r a n sp a r e n cy. C a u s e s o f B l i n d n e s s I n 2 0 0 4 a p p r o xi m a t e l y 3 6 m i l l i o n A m e r i ca n s su f f e r e d f r o m b l i n d n e ss a n d vi si o n i m p a i r m e n t [ 4 0 ] D i se a se s o f t h e co r n e a r e p r e se n t a si g n i f i ca n t c a u se o f b l i n d n e ss a n d vi si o n i m p a i r m e n t a n d h a ve b e e n sh o w n t o b e t h e se co n d l e a d i n g ca u se o f b l i n d n e ss i n ch i l d r e n [ 4 1 4 2 ] I n t h e U n i t e d S t a t e s, co r n e a l d i s e a se a cco u n t s f o r 0 7 % o f t o t a l n u m b e r o f n e w i n ci d e n ce o f b l i n d n e ss, h o w e ve r o p h t h a l m i c t r e a t m e n t o f d i se a se s a f f e ct i n g t h e co r n e a a cco u n t s f o r 2 5 % [ 4 1 ] K e r a t o co n u s i s a n o n i n f l a m m a t o r y e ye d i se a se w h e r e t h e co r n e a d e ve l o p s a co n i ca l sh a p e K e r a t o co n u s i s c h a r a ct e r i z e d b y t h e t h i n n i n g o f t h e co r n e a l st r o m a a n d i s t yp i c a l l y m a n i f e st e d d u r i n g p u b e r t y. I n t h e g e n e r a l p o p u l a t i o n r e p o r t e d i n ci d e n ce a r e a p p r o xi m a t e l y 1 p e r 2 0 0 0 [ 4 3 ] I n ke r a t o co n u s co r n e a s, t h e t h i ckn e ss o f l a m e l l a e i s u n a l t e r e d b u t t h e n u m b e r o f l a m e l l a e i s l e ss i n n o r m a l t i ssu e [ 4 4 ] A d d i t i o n a l l y, p r o t e o g l yca n s a n d ke r a t o cyt e d e n si t y a r e r e d u c e d i n ke r a t o co n u s co r n e a s w h e n co m p a r e d w i t h n o r m a l co r n e a s. T h e b i o ch e m i c a l a n a l ysi s o f t h e st r o m a l m a t r i x o f t h e ke r a t o co n u s co r n e a r e m a i n s i n co n cl u si ve I n d e ve l o p e d co u n t r i e s, l e ss t h a n 2 % o f b l i n d n e ss i s ca u se d b y co r n e a l d i se a se i n ch i l d r e n w h i l e i n t h e p o o r a r e a s o f A si a a n d A f r i ca 2 5 5 0 % a t t r i b u t e d

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1 3 t o co r n e a l sca r r i n g [ 4 5 ] E ye i n j u r i e s a r e a n o t h e r ca u se o f b l i n d n e ss l e a vi n g 1 6 m i l l i o n p e o p l e b l i n d 2 3 m i l l i o n p e o p l e w i t h b i l a t e r a l vi si o n i m p a i r m e n t a n d 1 9 m i l l i o n w i t h u n i l a t e r a l b l i n d n e ss o r vi si o n i m p a i r m e n t [ 4 6 ] A p p r o xi m a t e l y, 7 5 0 0 0 0 o f t h e s e e ye i n j u r y ca se s w i l l r e q u i r e h o sp i t a l i za t i o n e a ch ye a r [ 4 6 ] O ve r a l l b l i n d n e ss a n d vi si o n i m p a i r m e n t i s a g r o w i n g e co n o m i ca l co n ce r n w i t h t h e p r o j e c t e d i n c r e a se o f a b o u t 7 0 % b y 2 0 2 0 [ 1 ] O u t l i n e C o r n e a l w o u n d h e a l i n g i s a co m p l e x p r o ce ss o f e ve n t s t h a t o ccu r s a s a r e su l t o f t h e syn t h e si s o f n e w E C M p r o t e i n s. T h e E C M co m p o n e n t s p r o d u ce d d u r i n g co r n e a l w o u n d h e a l i n g ca n a i d i n r e g e n e r a t i o n o r i n d u c e sca r f o r m a t i o n w h i ch i s ch a r a ct e r i ze d b y a d i so r g a n i ze d co r n e a l st r o m a E C M [ 4 7 ] T h e r e a s o n t h a t i n j u r e d co r n e a s f a i l t o r e g e n e r a t e a n o r m a l st r o m a r e m a i n s u n kn o w n I t h a s b e e n p r o p o se d t h a t ke r a t o cyt e s p r o d u ce a n a l t e r e d r a t i o o f c o l l a g e n t y p e s [ 4 8 4 9 ] a n d h a ve a n a l t e r e d e xp r e ssi o n o f p r o t e o g l yca n t yp e s [ 4 9 5 0 ] H o w e ve r t h e se ch a n g e s a l o n e ca n n o t f u l l y e xp l a i n co r n e a l w o u n d h e a l i n g a n d t h e su b se q u e n t sca r f o r m a t i o n I t i s p r o b a b l e t h a t t h e a b se n ce o r p r e s e n ce o f o t h e r E C M co m p o n e n t s, m a y c o n t r i b u t e t o t h e d i so r g a n i ze d a n d o p a q u e co r n e a l st r o m a T h e r e a r e f o u r p h a se s o f co r n e a l w o u n d h e a l i n g : i n f l a m m a t i o n p h a se p r o l i f e r a t i o n p h a s e h yp e r ce l l u l a r p h a se a n d m a t r i x r e m o d e l i n g p h a s e G r o w t h f a ct o r s a r e p r o d u ce d p r i m a r i l y d u r i n g t h e i n f l a m m a t i o n p h a se b y l ym p h o cyt e s a n d m a c r o p h a g e s t h a t i n va d e t h e w o u n d W e h yp o t h e si ze t h a t t h e su b se q u e n t

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1 4 p h a se s o f c o r n e a l w o u n d h e a l i n g a r e st i m u l a t e d b y sp e ci f i c g r o w t h f a ct o r s t h a t st i m u l a t e ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e a n d p r o d u ce a sp e ci f i c E C M W e a l so p r o p o se t h a t t h e se d i f f e r e n t p h a se s o f co r n e a l w o u n d h e a l i n g ca n b e r e p l i ca t e d i n vi t r o b y cu l t u r e i n s e r u m f r e e m e d i a co n t a i n i n g g r o w t h f a ct o r s. S t u d i e s h a ve sh o w n t h a t T G F F G F 2 a n d P D G F ca n b e f o u n d i n t e a r f l u i d w h e r e t h e y co u l d a ct o n k e r a t o cyt e s e xp o se d b y w o u n d s a n d c a n b e m a d e b y t h e i n va d i n g l ym p h o cyt e s a n d m a c r o p h a g e s [ 5 1 5 2 ] T G F a n d F G F 2 h a ve a l so b e e n f o u n d i n co r n e a l w o u n d s [ 5 3 ] I G F I I a n d I G F I h a ve b e e n sh o w n t o b e p r e se n t i n t h e n o r m a l c o r n e a l st r o m a [ 3 9 ] T h e r e f o r e w e w i l l u se se r u m f r e e m e d i a co n t a i n i n g I G F I T G F F G F 2 a n d P D G F t o a ct i va t e ke r a t o cyt e s i n vi t r o T h e n w e w i l l ch a r a c t e r i ze t h e l e ve l o f p r o l i f e r a t i o n a n d E C M syn t h e si s p r o d u c e d b y t h e a ct i o n o f t h e se g r o w t h f a ct o r s o n ke r a t o cyt e s a n d co m p a r e t h i s t o t h e l e ve l s o f p r o l i f e r a t i o n a n d E C M syn t h e si s se e n i n vi vo d u r i n g t h e h yp e r ce l l u l a r a n d E C M m a t r i x r e st o r a t i o n p h a se s o f co r n e a l st r o m a w o u n d h e a l i n g A s a r e su l t o f t h i s a p p r o a ch w e e x p e ct t o b e a b l e t o i d e n t i f y t h e g r o w t h f a ct o r s t h a t st i m u l a t e t h e d i f f e r e n t p h a se s o f co r n e a l w o u n d h e a l i n g a n d r e p l a ce t h e q u e st i o n m a r k s sh o w n i n [ F i g 4 ] w i t h s p e ci f i c g r o w t h f a ct o r s.

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1 5 S p e c i f i c A i m s T h e r e m a i n d e r o f t h i s d i sse r t a t i o n w i l l p r e se n t t h e f i n d i n g s o f m y r e se a r ch p r o j e ct o f u n d e r st a n d i n g t h e e f f e ct o f I G F I T G F F G F 2 a n d P D G F o n co r n e a l st r o m a E C M p r o d u c t i o n b y ke r a t o cyt e s. M y f i r st sp e ci f i c a i m w a s t o d e t e r m i n e i f i n su l i n a n d I G F I h a ve t h e sa m e e f f e ct o n ke r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n a n d o n E C M syn t h e si s T h i s d a t a i s d i scu sse d i n t h e A p p e n d i x. M y se co n d sp e ci f i c a i m w a s e va l u a t e t h e e f f e ct o f I G F I T G F F G F 2 a n d P D G F t o st i m u l a t e ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e a n d p r o d u ce d i f f e r e n t E C M c o m p o n e n t s. T h e se f i n d i n g s a r e su m m a r i z e d i n C h a p t e r T w o M y t h i r d s p e ci f i c a i m w a s t o e v a l u a t e c o l l a g e n f i b r i l s p r o d u ce d b y k e r a t o cy t e cu l t u r e s i n g r o w t h f a ct o r s b y u si n g a n o ve l a g a r o s e o ve r l a y ce l l cu l t u r e syst e m T h e se f i n d i n g s a r e su m m a r i ze d i n C h a p t e r T h r e e F i g u r e 4 P h a se s o f co r n e a l st r o m a l w o u n d h e a l i n g

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1 6 M y f o u r t h sp e ci f i c a i m w a s t o d e ve l o p a d e f i n e d cu l t u r e m e d i u m t h a t c a n b e u se d t o e xp a n d a n d su b cu l t u r e ke r a t o cyt e s t h a t e xp r e ss ke r a t o cyt e sp e ci f i c m a r k e r s. T h e se f i n d i n g s a r e su m m a r i ze d i n C h a p t e r F o u r A b r i e f d i scu ssi o n o f t h e m a j o r f i n d i n g s o f m y d i sse r t a t i o n r e se a r c h i s f o u n d i n C h a p t e r F i ve

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1 7 C h a p t e r T w o T h e e f f e c t o f g r o w t h f a c t o r s i g n a l i n g o n k e r a t o c y t e s i n v i t r o a n d i t s r e l a t i o n s h i p t o t h e p h a s e s o f s t r o m a l w o u n d r e p a i r L a T i a E t h e r e d g e 1 B r a d l e y P K a n e 2 Jo h n R H a sse l l 1 2 D e p a r t m e n t s o f P a t h o l o g y a n d C e l l B i o l o g y 1 a n d M o l e cu l a r M e d i ci n e 2 C o l l e g e o f M e d i ci n e U n i ve r si t y o f S o u t h F l o r i d a T a m p a F L P u b l i sh e d i n I n ve st i g a t i ve O p h t h a l o m l o g y & V i su a l S ci e n ce 2 0 0 9 Ju l y; 5 0 ( 7 ) : 3 1 2 8 3 1 3 6

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1 8 A b s t r a c t P u r p o s e : T o d e t e r m i n e t h e r e l a t i o n sh i p b e t w e e n si g n a l i n g b y d i f f e r e n t g r o w t h f a ct o r s a n d t h e p h a se s o f co r n e a l st r o m a l w o u n d r e p a i r W e h yp o t h e si ze t h a t t h e p r o ce ss i n vo l ve s se q u e n t i a l si g n a l i n g r e su l t i n g f i r st i n p r o l i f e r a t i o n f o l l o w e d b y e xt r a ce l l u l a r m a t r i x ( E C M ) syn t h e si s. M e t h o d s : T h e e f f e ct o f I G F I T G F 1 F G F 2 a n d P D G F o n p r o l i f e r a t i o n a n d E C M p r o d u ct i o n b y p r i m a r y c u l t u r e d b o vi n e k e r a t o cyt e s w a s e va l u a t e d D N A syn t h e si s w a s d e t e r m i n e d b y 3 H t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n a n d m a xi m a l ce l l d e n si t y w a s d e t e r m i n e d b y m e a su r i n g t h e D N A co n t e n t R e l a t i ve l e ve l s o f E C M co m p o n e n t s syn t h e si z e d b y ke r a t o cyt e s a n d s e cr e t e d i n t o t h e m e d i a w a s e va l u a t e d b y 3 H g l yci n e i n co r p o r a t i o n i n t o t o t a l E C M p r o t e i n a n d co l l a g e n b y 3 H g l u co sa m i n e i n co r p o r a t i o n i n t o ch o n d r o i t i n su l f a t e ke r a t a n su l f a t e a n d h ya l u r o n a n a n d b y w e st e r n b l o t s w i t h a n t i b o d i e s sp e ci f i c t o p r o co l l a g e n t yp e s a n d " R e s u l t s : F G F 2 st i m u l a t e d t h e h i g h e st l e ve l o f p r o l i f e r a t i o n t h e l o w e st l e ve l o f g l yco sa m i n o g l yca n syn t h e si s, a n d i n h i b i t e d t h e syn t h e si s o f c o l l a g e n c o l l a g e n t yp e s a n d " I G F I i n co n t r a st st i m u l a t e d t h e l o w e st l e ve l o f p r o l i f e r a t i o n a n d t h e h i g h e st l e ve l s o f co l l a g e n syn t h e si s. P D G F a n d T G F 1 h a d i n t e r m e d i a t e e f f e ct s o n p r o l i f e r a t i o n a n d co l l a g e n syn t h e si s. A l t h o u g h F G F 2 i n h i b i t e d co l l a g e n p r o d u ct i o n i t co u l d b e r e s t o r e d b y su b se q u e n t t r e a t m e n t w i t h I G F I T G F 1 a n d P D G F C o n c l u s i o n s : T h e r e su l t s o f t h i s st u d y sh o w e d t h a t t h e l e ve l s o f p r o l i f e r a t i o n i n d u ce d b y t h e g r o w t h f a ct o r s w e r e i n ve r s e l y r e l a t e d t o t h e l e ve l o f co l l a g e n

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1 9 p r o d u ct i o n W e su g g e st t h a t F G F 2 i n i t i a t e s t h e h yp e r ce l l u l a r p h a se o f co r n e a l w o u n d h e a l i n g w h i l e I G F I a n d P D G F a r e i n v o l ve d i n t h e r e st o r a t i o n o f a n o r m a l E C M I n t r o d u c t i o n T h e m a t u r e c o r n e a l st r o m a co n si st s o f a d i st i n ct i ve l y o r g a n i ze d a n d t r a n sp a r e n t e x t r a ce l l u l a r m a t r i x ( E C M ) w h i ch i s co m p r i se d o f m a i n l y f i b r i l l a r co l l a g e n t yp e s a n d V a n d t h r e e o f sm a l l l e u ci n e r i ch p r o t e o g l yca n s; o n e w i t h ch o n d r o i t i n su l f a t e c h a i n s ( d e co r i n ) a n d t w o w i t h ke r a t a n su l f a t e c h a i n s ( l u m i ca n a n d ke r a t o ca n ) C o l l a g e n i s p r e s e n t i n t h e co r n e a l st r o m a a s f i b r i l s t h a t a r e se p a r a t e d b y sm a l l sp a ce s co n t a i n i n g p r o t e o g l yca n s a n d a r e a r r a n g e d i n p l yw o o d l i ke l a ye r s. C o l l a g e n s p l a y a f u n d a m e n t a l r o l e i n t h e st r u ct u r e a n d f u n ct i o n o f t h e co r n e a T h e o r g a n i za t i o n o f f i b r i l s a n d l a m e l l a e a s w e l l a s t h e cr o ssl i n ki n g o f t h e co l l a g e n p r o vi d e t h e co r n e a w i t h i t s t e n si l e st r e n g t h w h i l e t h e u n i f o r m d i a m e t e r a n d sp a ci n g o f t h e co l l a g e n f i b r i l s p r o vi d e t h e co r n e a w i t h i t s a b i l i t y t o t r a n sm i t l i g h t o n t o t h e r e t i n a [ f o r r e vi e w s se e [ 2 5 4 5 5 ] C o l l a g e n t y p e V i n i t i a t e s f i b r i l f o r m a t i o n a n d a c t s i n co n j u n ct i o n w i t h l u m i ca n a n d ke r a t o ca n a n d d e co r i n t o r e g u l a t e f i b r i l d i a m e t e r g r o w t h [ 3 6 5 6 5 9 ] T yp e " co l l a g e n a l so h a s b e e n r e p o r t e d t o b e n o r m a l l y p r e se n t i n b o vi n e a n d r a b b i t co r n e a s [ 6 0 6 1 ] M o r e r e ce n t st u d i e s i n m i c e su g g e s t co l l a g e n t yp e " m a y b e d e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e d a n d e xp r e sse d p r i m a r i l y i n n e o n a t a l co r n e a s [ 6 2 ] E m b e d d e d i n t h i s u n i q u e E C M a r e ke r a t o cyt e s, n e u r a l c r e st d e r i ve d ce l l s t h a t p r o d u ce t h e p r o t e o g l yca n s a n d c o l l a g e n s [ 6 3 ] K e r a t o c yt e s a r e

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2 0 ch a r a ct e r i ze d b y a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y a n d f o r m a t h r e e d i m e n si o n a l n e t w o r k i n co n t a ct w i t h o n e a n o t h e r b y t h e i r e xt e n si ve p r o ce sse s [ 6 3 6 4 ] K e r a t o cyt e s p r o l i f e r a t e a n d a r e b i o syn t h e t i c a l l y a ct i ve d u r i n g co r n e a l d e ve l o p m e n t I n a d u l t co r n e a s, t h e y a r e co n si d e r e d q u i e sce n t b e ca u se t h e y a r e l o cke d i n G 0 o f t h e ce l l cycl e [ 6 5 ] a n d t h e y h a ve a l o w l e v e l o f p r o l i f e r a t i o n a n d m a t r i x syn t h e si s [ 5 4 6 3 6 6 ] K e r a t o cyt e s a l so a r e ch a r a ct e r i z e d b y h i g h l e ve l s o f c r yst a l l i n s ( a l d e h yd e d e h yd r o g e n a se a n d t r a n sk e t o l a se ) i n t h e i r cyt o p l a sm w h i ch a r e p r o t e i n s t h a t a r e t h o u g h t t o p r o vi d e ce l l u l a r t r a n sp a r e n cy [ 6 7 ] T h e co r n e a s a b i l i t y t o r e m a i n t r a n sp a r e n t c a n b e co m p r o m i se d w h e n t h e co r n e a e n co u n t e r s t r a u m a i n f e ct i o n u l ce r a t i o n o r ch r o n i c co r n e a l i n f l a m m a t i o n U p o n i n j u r y, d a m a g e d ke r a t o cyt e s a n d ke r a t o cyt e s f l a n ki n g t h e w o u n d u n d e r g o a p o p t o si s [ 6 6 6 8 ] S o m e o f t h e r e m a i n i n g ke r a t o cyt e s a r e st i m u l a t e d t o l o se t h e i r q u i e sc e n ce a n d t r a n si t i o n i n t o d i ve r g e n t o r a ct i va t e d p h e n o t y p e s, w h i ch p r o l i f e r a t e r e s u l t i n g i n r e g i o n s o f h yp e r ce l l u l a r i t y t h a t t h e n g o o n t o p r o d u ce t h e n e w m a t r i x n e e d e d t o r e p a i r t h e w o u n d [ 4 6 6 6 9 7 0 ] T h e s e d i ve r g e n t p h e n o t yp e s ca n e i t h e r a i d i n r e g e n e r a t i o n o f a n o r m a l s t r o m a l m a t r i x o r b e co m e a sca r b y r e m a i n i n g h yp e r ce l l u l a r o r p r o d u ci n g a d i so r g a n i ze d m a t r i x [ 4 7 7 1 ] I t h a s b e e n p r o p o se d t h a t a n a l t e r e d r a t i o o f co l l a g e n t yp e s a n d p r o t e o g l yca n s i n t h e E C M a n d / o r t h e l o ss o f t h e c r yst a l l i n s f r o m t h e ke r a t o cyt e s ca u se t h e o p a ci t y [ 4 8 4 9 6 7 7 2 ] P e p t i d e g r o w t h f a ct o r s, e xt r a ce l l u l a r si g n a l p r o t e i n s ( l i g a n d s) w h i ch p r o m o t e t h e g r o w t h p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f ce l l s i n a n i m a l t i ssu e s b y i n t e r a ct i n g w i t h ce l l su r f a ce r e ce p t o r s a r e p a r t i a l l y cr e d i t e d f o r t h e r e g u l a t i o n o f

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2 1 co l l a g e n a n d p r o t e o g l yca n s e xp r e ssi o n d u r i n g co r n e a l w o u n d h e a l i n g [ 7 3 ] G r o w t h f a ct o r s a r e a b l e t o r e a ch t h e w o u n d si t e t h r o u g h t e a r f i l m a q u e o u s f l u i d a n d t h e e p i t h e l i a l l a ye r o f t h e co r n e a [ 7 3 ] [ 7 4 7 5 ] I n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r I I ( I G F I I ) h a s b e e n s h o w n t o b e p r e se n t i n t h e a q u e o u s h u m o r a n d i n t h e co r n e a [ 3 8 7 6 ] B o t h i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r I ( I G F I ) a n d I G F I I w h i ch a ct o n t h e sa m e r e c e p t o r s h a ve b e e n sh o w n t o ca u se k e r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e a n d m a i n t a i n t h e i r d e n d r i t i c m o r p h o l o g y i n vi t r o [ 3 8 7 5 ] T r a n sf o r m i n g g r o w t h f a ct o r b e t a ( T G F ) f i b r o b l a st g r o w t h f a ct o r 2 ( F G F 2 ) a n d p l a t e l e t d e r i ve d g r o w t h f a ct o r ( P D G F ) h a v e a l l b e e n f o u n d i n t e a r f l u i d [ 5 1 5 2 ] T h e s e g r o w t h f a ct o r s ca n a ct i va t e ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e d i f f e r e n t i a t e i n t o f i b r o b l a st s o r m yo f i b r o b l a st s, a n d m i g r a t e si m i l a r t o t h a t o f i n vi vo ke r a t o cyt e r e sp o n s e t o i n j u r y [ 6 9 7 5 7 7 7 8 ] A l t h o u g h a n u m b e r o f st u d i e s h a ve r e p o r t e d t h e e f f e ct o f g r o w t h f a ct o r s o n ke r a t o cyt e m o r p h o l o g y, c r yst a l l i n c o n t e n t a l p h a sm o o t h m u scl e a ct i n e xp r e ssi o n a n d p r o t e o g l yca n syn t h e si s [ 3 5 3 6 3 8 7 5 7 7 7 9 8 1 ] ; co m p a r a t i ve l y, l i t t l e a t t e n t i o n h a s b e e n g i ve n t o t h e i r e f f e ct o n co l l a g e n syn t h e si s [ 3 7 8 2 ] w h i ch i s t h e si n g l e m o st i m p o r t a n t st r u ct u r a l e l e m e n t o f t h e co r n e a C o n se q u e n t l y, i n t h i s st u d y, w e a n a l yze d t h e e f f e ct s o f d i f f e r e n t g r o w t h f a ct o r s ( I G F I T G F 1 F G F 2 a n d P D G F ) o n ke r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n a n d m a t r i x syn t h e si s t o t e st o u r h yp o t h e si s t h a t st r o m a l w o u n d h e a l i n g i n vo l ve s se q u e n t i a l si g n a l i n g l e a d i n g t o ke r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n f o l l o w e d b y e xt r a ce l l u l a r m a t r i x syn t h e si s a n d d e p o si t i o n

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2 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s C h e m i ca l s, g r o w t h f a ct o r s, p a p a i n a n d h ya l u r o n a t e l ya se w e r e p u r ch a se d f r o m S i g m a A l d r i ch ( S t L o u i s, M O ) u n l e ss o t h e r w i se st a t e d I so t o p e s w e r e p u r ch a se d f r o m P e r ki n E l m e r ( B o st o n M A ) C yQ u a n t ki t g e l s, r e a g e n t s, a n d e q u i p m e n t t h a t w e r e u s e d f o r p r o t e i n se p a r a t i o n a n d t r a n sf e r w e r e p u r c h a se d f r o m I n vi t r o g e n ( C a r l s b a d C A ) E n d o b e t a g a l a ct o si d a se a n d ch o n d r o i t i n a s e A B C w e r e p u r ch a se d f r o m A sso ci a t e s o f C a p e C o d ( E a st F a l m o u t h M A ) C o l l a g e n a se F o r m I I I f o r m e a su r i n g 3 H g l yci n e i n co r p o r a t i o n i n t o co l l a g e n w a s p u r ch a se d f r o m A d va n ce d B i o f a ct u r e s C o r p ( L yn b r o o k, N Y ) K e r a t o c y t e i s o l a t i o n a n d c u l t u r e B o vi n e ke r a t o cyt e s w e r e c o l l a g e n a s e i so l a t e d a s p r e vi o u sl y d e scr i b e d [ 3 5 5 0 ] I n b r i e f f r e sh l y h a r ve st e d co r n e a s w e r e o b t a i n e d f r o m 1 2 m o n t h o l d ca l ve s a n d se q u e n t i a l l y d i g e st e d I n i t i a l l y, t h e t i ssu e w a s su b j e ct e d t o a 4 5 m i n u t e co l l a g e n a se d i g e st i o n t o r e m o ve t h e e n d o t h e l i u m a n d e p i t h e l i u m a n d t h e n ke r a t o cyt e s w e r e r e l e a se d f r o m t h e st r o m a b y a se co n d 1 5 0 m i n u t e d i g e st i o n K e r a t o cyt e s w e r e p l a t e d i n se r u m f r e e D M E M / F 1 2 c o n t a i n i n g a n t i b i o t i cs a n d 1 m M 2 p h o sp h o a sco r b i c a ci d a t 2 0 0 0 0 ce l l s/ cm 2 t o a l l o w a t t a ch m e n t ( d a y 0 ) a n d i n cu b a t e d a t 3 7 C w i t h 5 % C O 2 M e d i u m w a s ch a n g e d t h e n e xt d a y ( d a y 1 ) a n d e ve r y t h i r d d a y t h e r e a f t e r w i t h D M E M / F 1 2 o r D M E M / F 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h : 1 0 n g / m l I G F I 2 n g / m l T G F 1 1 0 n g / m l F G F 2 o r 1 0 n g / m l P D G F B B C u l t u r e s w e r e h a r v e st e d o n d a ys 1 7 1 0 a n d 1 3

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2 3 D N A c o n t e n t D N A w a s e xt r a ct e d f r o m t h e ce l l l a ye r s o f e a c h w e l l o f h a r v e st e d cu l t u r e s u si n g cyq u a n t b u f f e r D N A i n t h e e xt r a ct w a s m e a su r e d u si n g a C yq u a n t A ssa y K i t co n si st e n t w i t h t h e m a n u f a ct u r e r s i n st r u ct i o n s a n d e x p r e sse d a s n g D N A / w e l l C a l f t h ym u s D N A w a s u se d a s a st a n d a r d R a d i o l a b e l i n g o f k e r a t o c y t e s K e r a t o cyt e s w e r e i n cu b a t e d w i t h 1 0 C i / m l 3 H t h ym i d i n e f o r D N A syn t h e si s o r 2 5 C i / m l 3 H g l yci n e f o r p r o t e i n / c o l l a g e n syn t h e si s, b e g i n n i n g o n d a ys 4 7 a n d 1 0 t h e n h a r ve st e d 3 d a ys l a t e r K e r a t o cyt e s w e r e a l so i n cu b a t e d w i t h 2 5 C i / m l 3 H g l u co s a m i n e f o r g l yco s a m i n o g l yca n syn t h e si s b e g i n n i n g o n d a y 7 a n d h a r ve s t e d o n d a y 1 0 D N A syn t h e si s. I n co r p o r a t i o n o f 3 H t h y m i d i n e i n t o D N A w a s d e t e r m i n e d a s p r e vi o u sl y d e sc r i b e d [ 3 5 ] I n su m m a r y, a l i q u o t s o f cyq u a n t b u f f e r e xt r a ct o f t h e ce l l l a ye r w a s a d j u st e d t o co n t a i n 1 0 % t r i ch l o r i ca ce t i c a ci d ( T C A ) ca r r i e r p r o t e i n b o vi n e se r u m a l b u m i n ( B S A ) w a s a d d e d a n d t h e m i xt u r e h e l d a t 4 C o ve r n i g h t t o p r e ci p i t a t e D N A T h e p r e ci p i t a t e w a s co l l e ct e d o n t o g l a ss f i l t e r s a n d t h e u n i n co r p o r a t e d i so t o p e w a s r e m o ve d b y w a sh i n g w i t h i ce co l d 5 % T C A I n co r p o r a t i o n w a s m e a su r e d b y l i q u i d sci n t i l l a t i o n co u n t i n g a n d e x p r e sse d a s co u n t s p e r m i n u t e / n g D N A P r o t e i n / co l l a g e n syn t h e si s. I n co r p o r a t i o n o f 3 H g l yci n e i n t o co l l a g e n a n d t o t a l p r o t e i n se c r e t e d i n t o t h e m e d i a w a s m e a su r e d a s p r e vi o u sl y d e scr i b e d [ 1 2 ] B r i e f l y, u n i n co r p o r a t e d r a d i o a ct i vi t y w a s r e m o ve d b y ch r o m a t o g r a p h y o n P D 1 0

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2 4 co l u m n s i n 4 M g u a n i d i n e H C l T h e g u a n i d i n e w a s r e m o ve d b y d i a l ysi s a g a i n st w a t e r A l i q u o t s o f 4 0 0 l w e r e i n cu b a t e d w i t h 1 m g o f p a p a i n i n p a p a i n d i g e st i o n so l u t i o n ( P B S co n t a i n i n g 1 0 m M cyst e i n e a n d 1 0 m M E D T A ) t h e n d i g e st e d f o r 3 h o u r s a t 5 5 C p r e ci p i t a t e d w i t h 1 0 % T C A a n d t h e su p e r n a t a n t co u n t e d t o d e t e r m i n e i n co r p o r a t i o n o f 3 H g l yci n e i n t o t o t a l p r o t e i n A d d i t i o n a l 4 0 0 l a l i q u o t s w e r e d i g e st e d w i t h co l l a g e n a se a t 3 7 C f o r 3 h o u r s i n co l l a g e n a se d i g e st i o n so l u t i o n ( 3 m M N e t h l y m a l e i m i d e 5 0 m M T r i s 1 5 0 m M N a C l a n d 5 m M C a C l 2 ) a n d p r o c e sse d a s d e scr i b e d f o r p a p a i n d i g e st s, t o d e t e r m i n e i n co r p o r a t i o n i n t o co l l a g e n T h e i n co r p o r a t e d r a d i o l a b e l e d r a d i o a ct i vi t y i n co l l a g e n a n d i n t o t a l p r o t e i n w e r e e xp r e sse d c o u n t s p e r m i n u t e / n g D N A G l yco sa m i n o g l yca n syn t h e si s. I n co r p o r a t e d 3 H g l u co sa m i n e se cr e t e d i n t h e m e d i u m w a s i s o l a t e d b y ch r o m a t o g r a p h y o n P D 1 0 co l u m n s i n 4 M g u a n i d i n e a n d d i a l yze d a g a i n st d i st i l l e d w a t e r o ve r n i g h t A l i q u o t s w e r e d i g e s t e d w i t h : H 2 O ( b l a n k) c h o n d r o i t i n a se A B C ( 0 5 U / l ) e n d o b e t a g a l a ct o si d a se ( 5 m U / l ) a n d h ya l u r o n a t e l ya se ( a m p u l e d i sso l ve d i n 2 5 0 l o f H 2 O u se d 5 l / s a m p l e ) f o r 3 h o u r s a t 3 7 C U n d i g e st e d G A G s w e r e p r e ci p i t a t e d o u t b y t h e a d d i t i o n o f 2 % d e xt r a n s u l f a t e a n d 1 % K A c i n 9 5 % E T O H a t 4 C T h e p r e ci p i t a t e w a s r e m o ve d b y ce n t r i f u g a t i o n a n d t h e r a d i o a ct i vi t y o f t h e s u p e r n a t a n t w a s m e a su r e d b y l i q u i d sci n t i l l a t i o n sp e ct r o p h o t o m e t r y. C h o n d r o i t i n a s e A B C d i g e st s b o t h C S a n d H A t h e r e f o r e t h e a m o u n t o f H A w a s su b t r a c t e d f r o m t h e a m o u n t o f C S t o d e t e r m i n e C S co n t e n t T h e i n co r p o r a t e d r a d i o a ct i vi t y i n C S K S a n d H A w a s e xp r e sse d p e r g D N A

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2 5 S D S / P A G E / S i m p l y b l u e s t a i n M e d i u m w a s c o l l e ct e d f r o m e a ch co n d i t i o n a n d co n ce n t r a t e d 1 0 f o l d u si n g 1 0 0 0 0 M W C O A m i co n U l t r a s p i n co n c e n t r a t o r s ( M i l l i p o r e C o r p M i l l f o r d M A ) S a m p l e s w e r e l o a d e d b a se d o n D N A co n t e n t a n d e l e ct r o p h o r e se d u n d e r r e d u ci n g c o n d i t i o n s o n 3 8 % t r i s a ce t a t e a c r yl a m i d e g e l s. G e l s w e r e st a i n e d w i t h S i m p l y B l u e S a f e S t a i n a cco r d i n g t o t h e m a n u f a ct u r e r s i n st r u ct i o n s. P e p s i n d i g e s t i o n E i g h t m i l l i t e r s o f m e d i u m p o o l e d f r o m 4 w e l l s w a s a d j u st e d t o 0 5 M a ce t i c a ci d b y t h e a d d i t i o n o f 2 3 0 l o f g l a ci a l a ce t i c a ci d T w o m i l l i l i t e r s o f 0 5 M a c e t i c a ci d w a s a d d e d t o e a ch o f t h e 4 w e l l s. A p e p s i n st o ck so l u t i o n ( 4 m g / m l o f 0 5 N a ce t i c a ci d ) w a s p r e p a r e d a n d a f t e r t h e sa m p l e s h a d ch i l l e d t o 4 C 1 0 0 l o f t h e st o ck w a s a d d e d t o t h e m e d i u m a n d 2 5 l o f t h e st o ck w a s a d d e d t o e a ch w e l l T h e sa m p l e s w e r e d i g e st e d o ve r n i g h t a t 4 C T h e ce l l l a ye r sa m p l e s w e r e co m b i n e d a n d 5 0 l o f p e p si n st o ck w a s a d d e d t o t h e c e l l l a ye r sa m p l e s a n d d i g e st e d f o r a n e xt r a 5 h o u r s a t 4 C T h e sa m p l e s w e r e a d j u st e d t o n e u t r a l i t y w i t h N a O H t o i n a ct i va t e p e p si n S a m p l e s w e r e d i a l yze d a g a i n st w a t e r l yo p h i l i ze d a n d r e co n s t i t u t e d i n 1 X L D S sa m p l e b u f f e r S a m p l e s w e r e l o a d e d b a se d o n D N A co n t e n t d e t e r m i n e d o n p a r a l l e l cu l t u r e s, t o 3 8 % t r i s a ce t a t e g e l s a n d e l e ct r o p h o r e se d a s d e scr i b e d a b o ve

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2 6 W e s t e r n b l o t t i n g P r o t e o g l yca n l e v e l s, f i b r o n e ct i n l e ve l s a n d p r o co l l a g e n l e ve l s i n t h e m e d i a w e r e d e t e r m i n e d b y w e st e r n b l o t a s d e sc r i b e d p r e vi o u sl y [ 3 5 ] M e d i u m w a s d i g e st e d w i t h e n d o b e t a g a l a ct o si d a se t o d e t e ct ke r a t o ca n a n d l u m i ca n c o r e p r o t e i n s, o r w i t h ch o n d r o i t i n a se A B C t o d e t e ct d e co r i n a n d b i g l yca n co r e p r o t e i n s. A l l sa m p l e s w e r e l o a d e d b a se d o n D N A co n t e n t a n d e l e ct r o p h o r e s e d a s d e scr i b e d a b o ve P r o t e i n s w e r e t r a n sf e r r e d t o a n i t r o ce l l u l o se m e m b r a n e a n d t h e n b l o cke d w i t h I B l o ck so l u t i o n T h e p r i m a r y a n t i b o d i e s w e r e a d d e d a t 4 C o ve r n i g h t : ke r a t o ca n [ 5 0 ] l u m i ca n [ 5 0 ] d e co r i n ( D S 1 H yb r i d o m a B a n k, U o f I o w a ) b i g l yca n ( g i f t f r o m D r L a r r y W F i sh e r ) e xt r a d o m a i n A ( E D A ) f i b r o n e ct i n ( A ccu r a t e C h e m i ca l & S ci e n t i f i c C o r p W e st b u r y, N Y ) f i b r o n e ct i n ( C h e m i co n I n t e r n a t i o n a l T e m e cu l a C A ) p r o c o l l a g e n t yp e ( S P 1 D 8 H yb r i d o m a B a n k, U o f I o w a ) o r p r o co l l a g e n t yp e " ( U S B i o l o g i ca l S w a m p sco t t M A ) T h e co r r e sp o n d i n g se c o n d a r y w a s a d d e d w h i ch i s h o r se r a d i sh p e r o xi d a se t a g g e d a n d t h e n d e t e ct e d u si n g t h e E C L d e t e ct i o n ki t co n si st e n t w i t h m a n u f a c t u r e s i n st r u ct i o n s. S t a t i s t i c s A l l D N A va l u e s w e r e t h e m e a n o f 3 o r 4 d e t e r m i n a t i o n s. 3 H t h y m i d i n e i n co r p o r a t i o n va l u e s w e r e t h e m e a n o f 4 d e t e r m i n a t i o n s. 3 H g l u co s a m i n e i n co r p o r a t i o n va l u e s w e r e t h e m e a n o f 3 d e t e r m i n a t i o n s. A l l o t h e r va l u e s sh o w n w e r e b a se d o n a si n g l e d e t e r m i n a t i o n b u t a l l e xp e r i m e n t s w e r e c o n d u ct e d 2 o r m o r e t i m e s u si n g d i f f e r e n t b a t c h e s o f p r i m a r y ce l l s a n d t h e r e su l t s o f a

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2 7 r e p r e se n t a t i ve e x p e r i m e n t i s sh o w n S t a t vi e w V e r si o n 5 ( S A S I n st i t u t e C a r y, N C ) w a s u se d f o r st a t i st i ca l c o m p a r i so n s. S a m p l e s w e r e a n a l yze d u si n g a p a i r e d t t e st S t a n d a r d e r r o r u se d n > 3 a n d st a n d a r d d e vi a t i o n w a s u se d w h e n n = 3 R e s u l t s E a ch g r o w t h f a ct o r st i m u l a t e d a d i f f e r e n t r a t e o f ke r a t o cy t e p r o l i f e r a t i o n C e l l s w e r e i n cu b a t e d w i t h m e d i a co n t a i n i n g 3 H t h ym i d i n e f o r t h r e e d a ys, b e g i n n i n g o n d a ys 4 7 a n d 1 0 a n d i n co r p o r a t i o n p e r n g D N A w a s d e t e r m i n e d o n d a ys 7 1 0 a n d 1 3 ( F i g 5 A ) A l l o f t h e g r o w t h f a ct o r s si g n i f i ca n t l y st i m u l a t e d h i g h e r l e ve l s o f i n co r p o r a t i o n r e l a t i ve t o t h e co n t r o l f o r a l l t h r e e t i m e p o i n t s e xce p t f o r I G F I o n d a y 1 0 A t d a y 7 F G F 2 s t i m u l a t e d i n c o r p o r a t i o n t h e m o s t a n d I G F I t h e l e a st w i t h T G F 1 a n d P D G F s t i m u l a t i n g i n t e r m e d i a t e l e ve l s o f i n co r p o r a t i o n I n co r p o r a t i o n i n t h e F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s d e cr e a se d f r o m d a y 7 t o 1 0 t o b e l e ve l s l o w e r t h a n t h a t o f T G F 1 a n d P D G F b u t st i l l h i g h e r t h a n t h a t o f I G F I E a ch o f t h e g r o w t h f a c t o r s st i m u l a t e d t h e h i g h e s t l e ve l s o f i n co r p o r a t i o n o n d a y 7 e xce p t T G F 1 w h i ch st i m u l a t e s t h e g r e a t e st i n co r p o r a t i o n o n d a y 1 0 G r o w t h f a ct o r s d i f f e r e n t i a l l y i n cr e a se d ke r a t o c yt e cu l t u r e d e n si t y. T h e D N A co n t e n t o f t h e ke r a t o cyt e cu l t u r e s w e r e m e a su r e d o n d a ys 1 7 1 0 a n d 1 3 t o d e t e r m i n e i f c u l t u r e s t r e a t e d w i t h e a c h o f t h e g r o w t h f a ct o r s i n cr e a se d t h e c e l l n u m b e r ( F i g 5 B ) T h e D N A co n t e n t o f t h e co n t r o l o n d a y 1 w a s n o t si g n i f i ca n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e co n t r o l o n d a y 7 ( d a t a f o r d a y 1 co n t r o l n o t sh o w n o n f i g u r e ) T h e D N A co n t e n t o f t h e co n t r o l a n d g r o w t h f a ct o r t r e a t e d cu l t u r e s w e r e

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2 8 si g n i f i ca n t l y d i f f e r e n t o n d a y 7 : F G F 2 w a s 3 2 f o l d h i g h e r t h a n co n t r o l P D G F w a s 2 0 f o l d h i g h e r T G F 1 w a s 1 8 f o l d h i g h e r a n d I G F I w a s 1 6 f o l d h i g h e r T h e D N A co n t e n t f o r t h e co n t r o l a n d g r o w t h f a ct o r t r e a t e d cu l t u r e s o n d a ys 1 0 a n d 1 3 f o l l o w e d t h e sa m e p a t t e r n a s d a y 7 D e r m a l f i b r o b l a st s a n d ke r a t o cyt e s i n st a n d a r d m o n o l a ye r cu l t u r e d o n o t r e a d i l y r e m o ve t h e N a n d C t e r m i n a l g l o b u l a r d o m a i n s o n t h e p r o co l l a g e n t h e y syn t h e si ze P r o c o l l a g e n ca n n o t f o r m c o l l a g e n f i b r i l s t h a t w o u l d a sso ci a t e w i t h t h e ce l l s a n d a s a r e su l t t h e p r o c o l l a g e n i s se cr e t e d i n t o t h e m e d i a [ 8 3 8 4 ] I n t h e a b se n c e o f co l l a g e n f i b r i l s, t h e p r o t e o g l yc a n s a n d o t h e r c o m p o n e n t s o f t h e E C M t h a t a sso ci a t e w i t h co l l a g e n f i b r i l s a r e a l so se cr e t e d i n t o t h e m e d i a T h e r e f o r e t h e m e d i a w a s a n a l yze d f o r t h e co m p o n e n t s o f t h e E C M E a ch g r o w t h f a ct o r st i m u l a t e d a d i f f e r e n t l e ve l o f t o t a l E C M p r o t e i n a n d co l l a g e n syn t h e si s. K e r a t o c yt e s w e r e cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g 3 H g l yci n e f o r 3 d a ys b e g i n n i n g o n d a ys 4 7 a n d 1 0 T h e s e n si t i vi t y o f t h e i n co r p o r a t e d r a d i o l a b e l se cr e t e d i n t o t h e m e d i a t o p a p a i n a n d t o co l l a g e n a se w a s u se d t o d e t e r m i n e t h e a m o u n t o f t o t a l E C M p r o t e i n syn t h e si s a n d co l l a g e n syn t h e si s, r e sp e ct i ve l y T h e r e su l t s sh o w t h a t co m p a r e d t o co n t r o l s, I G F I T G F 1 a n d P D G F st i m u l a t e d i n c o r p o r a t i o n i n t o t o t a l E C M p r o t e i n f r o m a s l i t t l e a s 4 0 f o l d f o r T G F 1 o n d a y 7 t o a s m u c h a s 1 5 f o l d f o r I G F I o n d a y 1 3 K e r a t o cyt e s c u l t u r e d i n I G F I syn t h e si ze d t h e h i g h e st l e ve l s o f t o t a l E C M p r o t e i n ; F G F 2 t h e l o w e st ; w h i l e P D G F a n d T G F 1 h a d i n t e r m e d i a t e l e v e l s o f t o t a l E C M p r o t e i n sy n t h e si s, f o r a l l t h r e e t i m e p o i n t s ( F i g 6 A ) T h e l e ve l s o f t o t a l E C M p r o t e i n syn t h e si ze d b y t h e ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n I G F I T G F 1 a n d P D G F i n cr e a se d f r o m d a y 7 t o 1 0

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2 9 a n d f r o m d a y 1 0 t o 1 3 a n d i n c r e a se d t h e m o st i n t h e T G F 1 t r e a t e d cu l t u r e s. T h e l e ve l s o f co l l a g e n syn t h e si s f o l l o w e d t h e sa m e p a t t e r n a s t h e t o t a l E C M p r o t e i n syn t h e si s, b u t w a s ~ 2 0 4 0 % l o w e r ( F i g 6 B ) T h e p r o t e i n s t h a t w e r e se cr e t e d i n t o t h e m e d i u m b y ke r a t o cyt e s a l so w e r e e va l u a t e d b y S D S / P A G E / si m p l y b l u e st a i n i n g A n a l ysi s o f D N A n o r m a l i ze d a l i q u o t s f r o m d a y 1 0 cu l t u r e s sh o w e d t h a t e a c h o f t h e t e st e d g r o w t h f a ct o r s ca u se d ke r a t o cyt e s t o se cr e t e p r o t e i n s i n t h e m e d i u m t h a t p r o d u ce d a si m i l a r b a n d i n g p a t t e r n b u t t h e b a n d i n t e n si t y w a s g r o w t h f a ct o r d e p e n d e n t ( F i g 7 ) I G F I a n d T G F 1 t r e a t e d cu l t u r e s se cr e t e d t h e m o st p r o t e i n s, F G F 2 t h e l e a st a n d P D G F se cr e t e d i n t e r m e d i a t e l e v e l s o f p r o t e i n s. C o m p a r e d t o d a y 1 0 cu l t u r e s, t h e b a n d i n t e n si t y o f p r o t e i n s i n t h e m e d i u m w a s l e ss i n sa m p l e s f r o m d a y 7 cu l t u r e s a n d g r e a t e r i n s a m p l e s f r o m d a y 1 3 cu l t u r e s, b u t t h e b a n d i n g p a t t e r n f o r e a ch o f t h e g r o w t h f a ct o r s w a s c o m p a r a b l e a t a l l t h r e e t i m e p o i n t s ( d a t a n o t sh o w n ) T h e se r e su l t s su g g e st t h a t I G F I T G F 1 P D G F a n d F G F 2 st i m u l a t e t h e ce l l s t o se c r e t e e sse n t i a l l y t h e s a m e m a t r i x p r o t e i n s i n t o t h e m e d i a ; h o w e ve r t h e e xp r e ssi o n l e ve l s o f t h e p r o t e i n s a r e g r o w t h f a ct o r sp e ci f i c. T h e m a j o r p r o t e i n s s e cr e t e d i n t o t h e m e d i a w e r e i d e n t i f i e d u si n g w e st e r n b l o t t i n g W e a n a l yze d D N A n o r m a l i ze d a l i q u o t s o f m e d i a h a r ve s t e d a t d a y 1 0 f o r E D A f i b r o n e ct i n a n i so f o r m o f f i b r o n e ct i n f o u n d a f t e r w o u n d i n g [ 8 5 ] a n d f i b r o n e ct i n A n t i se r a t o E D A f i b r o n e ct i n r e a ct e d w i t h a si n g l e b a n d o f 2 1 0 kD p r e se n t i n t h e m e d i a ( F i g 8 A ) T h i s p r o t e i n w a s m o st a b u n d a n t i n t h e m e d i a o f T G F 1 t r e a t e d cu l t u r e s w i t h l e sse r a m o u n t s i n t h e m e d i a o f cu l t u r e s t r e a t e d w i t h t h e o t h e r g r o w t h f a ct o r s a n d o n l y t r a ce a m o u n t s i n m e d i a f r o m c o n t r o l s. A

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3 0 w e st e r n b l o t u si n g a n a n t i b o d y t h a t r e co g n i ze s a l l f o r m s o f f i b r o n e ct i n i n cl u d i n g E D A f i b r o n e ct i n i n d i ca t e d t h a t t h e l e ve l s o f f i b r o n e ct i n p r o d u c e d b y t h e co n t r o l w e r e si m i l a r t o t h a t o f t h e F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s ( F i g 8 B ) T h e b l u e st a i n i n g b a n d a t 2 1 0 kD i n F i g u r e 3 i s l i ke l y t o b e f i b r o n e ct i n a n d i s i d e n t i f i e d a s F N W e st e r n b l o t a n a l ysi s u si n g a n a n t i b o d y sp e ci f i c f o r t yp e p r o co l l a g e n o n D N A n o r m a l i ze d a l i q u o t s o f m e d i u m f r o m d a y 1 0 o f cu l t u r e d e m o n st r a t e d t h a t t yp e p r o co l l a g e n w a s r e a d i l y d e t e c t e d i n t h e m e d i u m o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n I G F I T G F 1 a n d P D G F ( F i g 9 A ) W h e n c o m p a r e d t o co n t r o l I G F I T G F 1 a n d P D G F st i m u l a t e d t h e p r o d u ct i o n o f t yp e I p r o co l l a g e n w h i l e F G F 2 i n h i b i t e d t h e p r o d u ct i o n o f t yp e I p r o co l l a g e n T h e p r o d u ct i o n o f t y p e " p r o co l l a g e n b y g r o w t h f a ct o r t r e a t e d cu l t u r e s a l so w a s e v a l u a t e d b y w e st e r n b l o t u si n g a n a n t i b o d y sp e ci f i c f o r t y p e " p r o co l l a g e n C o m p a r e d t o co n t r o l t yp e " p r o co l l a g e n w a s st i m u l a t e d t o t h e g r e a t e st e xt e n t i n cu l t u r e s t r e a t e d w i t h I G F I a n d T G F 1 a n d w a s i n h i b i t e d i n cu l t u r e s t r e a t e d w i t h F G F 2 ( F i g 9 B ) T h e m a j o r b l u e st a i n i n g b a n d s t h a t r e a ct w i t h t h e s e a n t i b o d i e s a r e i d e n t i f i e d i n F i g u r e 3 a s p r o 1 ( ) ( " ) a n d p N ( ) ( " ) F i b r i l f o r m i n g c o l l a g e n ( t yp e s a n d " ) co n t e n t i n t h e m e d i a a n d ce l l l a ye r f r o m d a y 1 0 cu l t u r e s w a s d e t e r m i n e d b y p e p si n d i g e st i o n a n d S D S / P A G E / si m p l y b l u e st a i n i n g ( F i g 1 0 ) P e p si n r e a d i l y d e g r a d e s g l o b u l a r p r o t e i n s u n d e r a ci d i c co n d i t i o n s, b u t t h o se r e g i o n s o f co l l a g e n m o l e cu l e s t h a t f o r m a st a b l e t r i p l e h e l i x a r e r e si st a n t t o t h i s p r o t e a se K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n I G F I h a d t h e h i g h e st l e ve l s o f f i b r i l l a r co l l a g e n i n t h e m e d i a T G F 1 a n d P D G F i n d u ce d p r o d u ct i o n o f i n t e r m e d i a t e a m o u n t s o f co l l a g e n d e p o si t e d i n t o t h e m e d i u m M e d i u m f r o m F G F

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3 1 2 t r e a t e d cu l t u r e s h a d l e ve l s o f f i b r i l l a r co l l a g e n si m i l a r t o t h a t o f t h e co n t r o l F i b r i l l a r co l l a g e n a ss o ci a t e d w i t h t h e ce l l l a ye r w a s se e n o n l y i n t h e T G F 1 t r e a t e d c u l t u r e s G l yco sa m i n o g l yca n syn t h e si s b y cu l t u r e d ke r a t o cyt e s i n r e sp o n se t o t h e d i f f e r e n t g r o w t h f a ct o r s a l so w a s e v a l u a t e d C e l l s w e r e r a d i o l a b e l e d w i t h 3 H g l u co sa m i n e f r o m d a ys 7 t o 1 0 a n d t h e g l yco s a m i n o g l yca n s s e cr e t e d i n t o t h e m e d i a w e r e d i g e st e d w i t h ch o n d r o i t i n a se A B C e n d o b e t a g a l a ct o si d a se o r h ya l u r o n a t e l ya se t o d e t e r m i n e t h e r e l a t i ve l e v e l s o f ch o n d r o i t i n su l f a t e ke r a t a n su l f a t e a n d h ya l u r o n a n sy n t h e si s, r e sp e ct i ve l y. T h e r e su l t s sh o w t h a t w h e n co m p a r e d t o co n t r o l c u l t u r e s t r e a t e d w i t h T G F 1 a n d P D G F syn t h e si ze d t h e h i g h e st l e ve l s o f ch o n d r o i t i n su l f a t e a n d F G F 2 t h e l e a st ( F i g 1 1 A ) F u r t h e r m o r e cu l t u r e s t r e a t e d w i t h P D G F a n d I G F I p r o d u c e d t h e h i g h e st l e ve l s o f ke r a t a n su l f a t e syn t h e si s w h i l e F G F 2 d i d n o t st i m u l a t e k e r a t a n su l f a t e syn t h e si s ( F i g 1 1 B ) H ya l u r o n a n syn t h e si s w a s 2 0 f o l d h i g h e r t h a n t h e co n t r o l i n ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g T G F 1 ( F i g 1 1 C ) T h e se d a t a i n d i ca t e t h a t t h e l e ve l s o f g l yco sa m i n o g l yca n syn t h e si s st i m u l a t e d b y e a ch o f t h e g r o w t h f a ct o r s g e n e r a l l y f o l l o w s t h e p a t t e r n o f t o t a l E C M p r o t e i n syn t h e si s. W e st e r n b l o t a n a l yse s w i t h a n t i b o d i e s t o t h e c o r e p r o t e i n s o f d e co r i n a n d b i g l yca n o r k e r a t o c a n a n d l u m i ca n r e sp e ct i v e l y w e r e p e r f o r m e d A l i q u o t s o f m e d i a h a r ve st e d o n d a y 1 0 f r o m ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e a ch o f t h e g r o w t h f a ct o r s w e r e n o r m a l i ze d f o r D N A co n t e n t d i g e st e d w i t h e i t h e r ch o n d r o i t i n a se A B C o r e n d o b e t a g a l a ct o si d a se a n d a n a l yze d ( F i g 1 2 ) D e co r i n a n d ke r a t o ca n p r o d u ct i o n w a s st i m u l a t e d b y a l l o f t h e g r o w t h f a ct o r s. L u m i ca n p r o d u ct i o n w a s

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3 2 o n l y st i m u l a t e d b y I G F I B i g l yca n w a s o n l y d e t e ct e d i n m e d i a f r o m k e r a t o cy t e s cu l t u r e d i n T G F 1 F G F 2 i n d u ce d p r o l i f e r a t i o n t h e m o st a h a l l m a r k o f t h e i n i t i a l p h a s e o f w o u n d h e a l i n g b u t i n h i b i t e d t h e syn t h e si s o f p r o co l l a g e n w h i ch i s e sse n t i a l f o r a co r n e a l r e co n s t r u ct i o n T h e r e f o r e w e d e t e r m i n e d i f k e r a t o cy t e s t h a t h a ve b e e n cu l t u r e d i n F G F 2 co u l d st i l l r e sp o n d t o o t h e r g r o w t h f a ct o r s t h a t st i m u l a t e co l l a g e n syn t h e si s a n d u p r e g u l a t e p r o co l l a g e n t yp e sy n t h e si s. K e r a t o cyt e s w e r e t r e a t e d w i t h F G F 2 f o r 7 d a ys, f o l l o w e d b y 6 d a ys o f t r e a t m e n t w i t h D M E M F / 1 2 I G F I T G F 1 F G F 2 o r P D G F D N A co n t e n t o f t h e ce l l l a y e r a n d t yp e p r o co l l a g e n i n t h e m e d i u m w e r e d e t e r m i n e d ( F i g 1 3 ) T h e D N A co n t e n t o f cu l t u r e s co n t i n u a l l y t r e a t e d w i t h F G F 2 si g n i f i c a n t l y i n cr e a s e d f r o m d a y 1 ( C 1 ) t o d a y 7 ( F 7 ) a n d t h e n d e cl i n e d a sm a l l a m o u n t f r o m d a y 7 ( F 7 ) t o d a y 1 3 ( F F ) C o m p a r e d t o co n t i n u o u s c u l t u r e i n F G F 2 ( F F ) cu l t u r e s sw i t ch e d t o P D G F ( F P ) a n d t h e I G F I ( F I ) h a d si g n i f i ca n t l y h i g h e r D N A co n t e n t ( F i g 1 3 A ) A l i q u o t s o f m e d i u m n o r m a l i ze d f o r D N A co n t e n t w e r e a n a l yze d u si n g w e st e r n b l o t s w i t h t h e a n t i b o d y t o t yp e p r o co l l a g e n ( F i g 1 3 B ) T yp e p r o co l l a g e n l e v e l s i n t h e m e d i a o f ke r a t o cy t e s t r e a t e d w i t h F G F 2 f o r 7 d a ys ( F 7 ) a n d 1 3 d a ys ( F F ) w e r e l e ss t h a n t h e c o n t r o l s ( C 7 a n d C 1 3 ) b u t cu l t u r e s s w i t ch e d t o I G F I ( F I ) T G F 1 ( F T ) a n d P D G F ( F P ) sh o w e d i n cr e a se d t y p e p r o co l l a g e n l e ve l s. D i s c u s s i o n W h e n t h e co r n e a st r o m a i s w o u n d e d i n j u r e d ke r a t o cyt e s a n d ke r a t o cyt e s su r r o u n d i n g t h e w o u n d u n d e r g o a p o p t o si s [ 6 6 8 6 ] P r o l i f e r a t i o n b y so m e o r a l l

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3 3 o f t h e r e m a i n i n g ce l l s w o u l d b e e sse n t i a l t o r e p l a ce t h e ce l l s l o s t d u e t o a p o p t o si s. T h e r e su l t s o f t h i s st u d y sh o w I G F I T G F 1 F G F 2 a n d P D G F st i m u l a t e d i f f e r e n t r a t e s o f D N A syn t h e si s a n d d i f f e r e n t l e ve l s o f m a xi m a l ce l l d e n si t y. F G F 2 t r e a t e d ke r a t o cyt e s syn t h e si z e d D N A a t t h e h i g h e st r a t e a t t h e d a y se ve n t i m e p o i n t a n d r e a ch e d t h e h i g h e st l e ve l o f m a xi m a l ce l l d e n si t y. P D G F t r e a t e d ke r a t o cyt e s syn t h e si ze d D N A a t a l o w e r r a t e a t t h e d a y 7 t i m e p o i n t b u t t h e n e xc e e d e d F G F 2 a t t h e d a ys 1 0 a n d 1 3 t i m e p o i n t s a n d e ve n t u a l l y a ch i e ve d n e a r l y t h e sa m e c e l l d e n si t y a s c e l l s t r e a t e d w i t h F G F 2 K e r a t o cyt e s t r e a t e d w i t h T G F 1 syn t h e si ze d D N A a t a r a t e si m i l a r t o P D G F a n d a ch i e ve d t h e t h i r d h i g h e st l e v e l o f m a xi m a l ce l l d e n si t y. I G F I t r e a t e d ke r a t o cyt e s h a d t h e l o w e st r a t e o f D N A syn t h e si s a n d l o w e st l e ve l o f m a xi m a l c e l l d e n si t y. T h e se r e su l t s i n d i ca t e t h a t f o r t h e se g r o w t h f a c t o r s t h e l e ve l o f m a xi m a l ce l l d e n si t y a ch i e ve d i s r e l a t e d t o t h e r a t e o f D N A syn t h e s i s i n d u ce d b y t h a t g r o w t h f a ct o r A l l o f t h e se g r o w t h f a ct o r s, h o w e ve r w o u l d b e p o t e n t i a l ca n d i d a t e s f o r r e g u l a t o r y r o l e s i n co n t r o l l i n g p r o l i f e r a t i o n i n vo l ve d i n t h e h yp e r ce l l u l a r p h a s e o f co r n e a l st r o m a l w o u n d h e a l i n g T h e syn t h e si s o f a n E C M co n t a i n i n g co l l a g e n i s e sse n t i a l su b se q u e n t t o p r o l i f e r a t i o n i n r e st o r i n g t h e i n t e g r i t y o f t h e c o r n e a l st r o m a a f t e r w o u n d i n g T h e r e su l t s o f t h i s st u d y sh o w t h a t I G F I T G F 1 a n d P D G F st i m u l a t e si g n i f i ca n t l y d i f f e r e n t l e ve l s o f co l l a g e n syn t h e si s; I G F I st i m u l a t e d h i g h e r l e v e l s o f co l l a g e n syn t h e si s t h a n d i d T G F 1 a n d P D G F F G F 2 d i d n o t st i m u l a t e co l l a g e n syn t h e si s. T h i s sa m e p a t t e r n w a s o b se r ve d i n : 3 H g l yci n e l a b e l i n g f o r t o t a l E C M p r o t e i n s a n d co l l a g e n o u s p r o t e i n s, si m p l y b l u e st a i n i n g o f m a t r i x p r o t e i n s,

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3 4 w e st e r n b l o t s w i t h a n t i b o d i e s t o t yp e s a n d " p r o co l l a g e n a n d l e ve l s o f co l l a g e n o u s p r o t e i n s r e ve a l e d b y p e p si n d i g e st i o n o f t h e m e d i u m T h e l e ve l o f co l l a g e n syn t h e si s i n d u ce d b y e a ch o f t h e g r o w t h f a ct o r s i s, t h e n i n ve r se l y r e l a t e d t o t h e l e v e l o f co n f l u e n ce a c h i e ve d b y ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n t h a t g r o w t h f a ct o r I n a d d i t i o n t o t h e c o l l a g e n s, t h e p r o t e o g l yca n s a n d g l yco p r o t e i n s p l a y a m a j o r r o l e d u r i n g w o u n d h e a l i n g K e r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n s a r e n o r m a l l y p r e se n t i n t h e co r n e a l st r o m a a t h i g h l e ve l s a n d f u n ct i o n t o d i r e ct co l l a g e n a sse m b l y. I n co n t r a st h ya l u r o n a n i s o n l y p r e se n t i n m a t u r e c o r n e a s d u r i n g w o u n d h e a l i n g a n d m a y r e d u ce t r a n sp a r e n cy b y d i sr u p t i n g t h e sp a ci n g o f co l l a g e n f i b r i l s [ 4 8 7 ] W e f o u n d t h a t w h i l e a l l o f t h e g r o w t h f a ct o r s st i m u l a t e d ch o n d r o i t i n su l f a t e sy n t h e si s, F G F 2 st i m u l a t e d i t s syn t h e si s t h e l e a st F G F 2 w a s a l so t h e o n l y g r o w t h f a ct o r t h a t d i d n o t s t i m u l a t e ke r a t a n s u l f a t e syn t h e si s. T G F 1 t r e a t m e n t h o w e ve r a l so st i m u l a t e d t h e syn t h e si s o f b i g l yca n a n d h ya l u r o n a n kn o w n m a r k e r s o f E C M sc a r r i n g [ 4 8 8 8 9 ] I n a d d i t i o n T G F 1 st i m u l a t e d t h e h i g h e st l e v e l s o f E D A f i b r o n e ct i n a n d t h e g r e a t e st a m o u n t o f co l l a g e n a sso ci a t e d w i t h t h e ce l l s. F i b r o n e ct i n i s kn o w n t o a ssi st i n t h e f o r m a t i o n o f E C M b y e n h a n ci n g t h e co n ve r si o n o f p r o c o l l a g e n t o co l l a g e n [ 1 1 ] T h e se r e su l t s su g g e st t h a t i n a d d i t i o n t o st i m u l a t i n g t h e syn t h e si s o f co l l a g e n s, I G F I a n d P D G F a l so st i m u l a t e d t h e syn t h e si s o f t h e c o l l a g e n s, p r o t e o g l yc a n s, a n d g l yco p r o t e i n s t h a t m o r e cl o se l y r e se m b l e n o r m a l co r n e a l st r o m a l co m p o si t i o n T h e r e f o r e r e g e n e r a t i o n o f n o r m a l st r o m a a f t e r i n j u r y i s

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3 5 l i ke l y t o i n vo l ve t h e s e g r o w t h f a ct o r s w h i l e p r o d u ct i o n o f a sca r t yp e E C M w o u l d i n vo l ve T G F 1 A l t h o u g h F G F 2 s t i m u l a t e d ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e a t h i g h l e ve l s a n d a l so st i m u l a t e d t h e p r o d u c t i o n o f d e co r i n a n d ch o n d r o i t i n su l f a t e i t d i d n o t st i m u l a t e t h e syn t h e si s o f co l l a g e n o u s p r o t e i n s. W e st e r n b l o t s, h o w e v e r i n d i ca t e d t h a t F G F 2 a ct u a l l y i n h i b i t e d t h e syn t h e si s o f t yp e s a n d " p r o co l l a g e n T h e E C M p r o d u ce d b y F G F 2 a ct i o n o n ke r a t o cyt e s w o u l d co n si st o f e sse n t i a l l y p r o t e o g l yca n s a n d f i b r o n e ct i n a n d w i t h o u t co l l a g e n i t w o u l d l a ck t e n si l e st r e n g t h W e a l so sh o w e d t h a t t h e F G F 2 m e d i a t e d i n h i b i t i o n o f t yp e p r o co l l a g e n syn t h e si s c o u l d b e r e ve r se d b y s u b se q u e n t cu l t u r e i n m e d i a co n t a i n i n g t h e g r o w t h f a ct o r s t h a t st i m u l a t e co l l a g e n syn t h e si s, I G F I a n d P D G F g r o w t h f a ct o r s t h a t a l so st i m u l a t e t h e syn t h e si s o f t h e n o r m a l p r o t e o g l yca n s. T h i s i n d i ca t e s t h a t t h e i n h i b i t i o n o f t y p e p r o co l l a g e n syn t h e si s b y F G F 2 w a s n o t a p e r m a n e n t p h e n o t yp i c c h a n g e I n co n cl u si o n w e su g g e s t t h a t st r o m a l w o u n d h e a l i n g o ccu r s a s a r e su l t o f t h e se q u e n t i a l a ct i o n o f g r o w t h f a ct o r s o n ke r a t o cyt e s ( F i g 1 4 ) Q u i e sce n t ke r a t o cyt e s a r e a ct i va t e d t o p r o l i f e r a t e u p o n w o u n d i n g t o cr e a t e r e g i o n s o f h yp e r ce l l u l a r i t y t h a t c o n si st o f d e n se l y p a ck e d ce l l s w i t h a sp a r s e o r p r o vi si o n a l m a t r i x t h a t co n t a i n s ke r a t o ca n [ 3 0 7 0 7 1 ] W e f o u n d t h a t w h i l e F G F 2 st i m u l a t e d p r o l i f e r a t i o n a n d ch o n d r o i t i n s u l f a t e syn t h e si s, i t d i d n o t st i m u l a t e ke r a t a n s u l f a t e syn t h e si s a n d i t i n h i b i t e d p r o c o l l a g e n t yp e s a n d " syn t h e si s T h i s l o w l e ve l o f t o t a l E C M syn t h e si s b y F G F 2 a ct i va t e d k e r a t o cyt e s w o u l d r e su l t i n a s p a r se m a t r i x.

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3 6 T h u s, w e sp e cu l a t e t h a t t h e r e g i o n s o f h y p e r c e l l u l a r i t y t h a t a r e se e n d u r i n g t h e i n i t i a l p h a se s o f w o u n d h e a l i n g a r e ke r a t o cyt e s t h a t h a ve b e e n a ct i va t e d b y F G F 2 I n vi vo t h e p r o vi si o n a l m a t r i x i n r e g i o n s o f h yp e r c e l l u l a r i t y ca n b e r e p l a ce d b y a f i b r i l l a r m a t r i x. W e a l so o b se r ve d t h a t co l l a g e n syn t h e si s ca n b e r e st o r e d t o F G F 2 a ct i va t e d ke r a t o cyt e s b y su b se q u e n t cu l t u r e i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I T G F 1 a n d P D G F T h u s, w e f u r t h e r sp e cu l a t e t h a t I G F I o r P D G F co u l d b e a ct i n g o n t h e h y p e r ce l l u l a r ke r a t o cyt e s t o m a ke t h e m b e co m e co l l a g e n o u s ke r a t o cyt e s. T h e se co l l a g e n o u s ke r a t o cyt e s r e p l a ce t h e p r o vi si o n a l m a t r i x w i t h a n o r m a l f i b r i l l a r m a t r i x t h a t r e st o r e s st r o m a l i n t e g r i t y a n d t h e n t h e ke r a t o cyt e s l a t e r b e co m e q u i e sce n t a g a i n T G F 1 a l so r e st o r e d co l l a g e n syn t h e si s t o F G F 2 a ct i va t e d ke r a t o cyt e s b u t t h i s g r o w t h f a ct o r a l so st i m u l a t e d t h e syn t h e si s o f b i g l yca n a n d h y a l u r o n a n m a r ke r s o f f i b r o si s. W e p r o p o se ; t h e r e f o r e t h a t T G F 1 w o u l d ca u se t h e h yp e r ce l l u l a r ke r a t o cyt e s t o b e co m e f i b r o b r o co l l a g e n o u s ke r a t o cyt e s a n d p r o d u ce a sca r t yp e f i b r i l l a r m a t r i x. T G F 1 h a s a l so b e e n sh o w n t o ca u se ke r a t o cyt e s t o b e co m e m yo f i b r o b l a st s, b a se d o n t h e a p p e a r a n ce o f # sm o o t h m u scl e a ct i n [ 3 6 ] K e r a t o cyt e s m a d e m y o f i b r o b l a st i c b y T G F 1 w o u l d b e syn o n ym o u s w i t h f i b r o co l l a g e n o u s ke r a t o cyt e s. T h e a b se n c e o f a n y su b se q u e n t g r o w t h f a ct o r w o u l d r e su l t i n a h yp e r ce l l u l a r sca r T h e t a r g e t e d m o d u l a t i o n o f t h e se si g n a l i n g m o l e cu l e s h a s co n si d e r a b l e cl i n i ca l r e l e va n ce

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3 7 F i g u r e 5 K e r a t o cyt e D N A S yn t h e si s a n d ce l l d e n si t y. K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n D M E M / F 1 2 ( C o n t r o l ) o r D M E M F / 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h I G F I T G F 1 F G F 2 o r P D G F A : K e r a t o cyt e D N A S yn t h e si s. C u l t u r e s w e r e r a d i o l a b e l e d w i t h 3 H t h ym i d i n e o n d a ys 4 7 7 1 0 a n d 1 0 1 3 t h e i n co r p o r a t i o n d e t e r m i n e d a n d e xp r e sse d p e r n g D N A C o m p a r e d t o co n t r o l I G F I T G F 1 F G F 2 a n d P D G F si g n i f i ca n t l y ( p < 0 0 1 1 ) i n c r e a se d 3 H t h ym i d i n e i n co r p o r a t i o n a t a l l t h r e e t i m e p o i n t s, e xc e p t f o r I G F I o n d a y 1 0 B : K e r a t o cy t e D e n si t y. D N A co n t e n t o f ke r a t o cyt e c u l t u r e s m e a su r e d o n d a ys 7 1 0 a n d 1 3 K e r a t o cyt e s cu l t u r e d w i t h I G F I T G F 1 F G F 2 a n d P D G F co n t a i n e d si g n i f i ca n t l y ( p < 0 0 4 4 ) m o r e D N A t h a n t h e co n t r o l f o r a l l t h r e e t i m e p o i n t s.

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3 8 F i g u r e 6 P r o t e i n a n d c o l l a g e n syn t h e si s b y ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d w i t h D M E M / F 1 2 ( C o n t r o l ) o r D M E M F / 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h I G F I T G F 1 F G F 2 o r P D G F a n d r a d i o l a b e l e d w i t h 3 H g l yci n e o n d a ys 4 7 7 1 0 a n d 1 0 1 3 T h e s e n si t i vi t y o f t h e i n co r p o r a t e d r a d i o l a b e l se cr e t e d i n t h e m e d i a t o p a p a i n ( A : T o t a l P r o t e i n ) a n d t o c o l l a g e n a s e ( B : C o l l a g e n o u s p r o t e i n ) w a s d e t e r m i n e d a n d e xp r e sse d p e r n g D N A

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3 9 F i g u r e 7 S i m p l y b l u e st a i n a b l e p r o t e i n s se c r e t e d i n t o t h e m e d i u m b y k e r a t o cyt e s i n cu l t u r e K e r a t o cyt e s w e r e c u l t u r e d w i t h D M E M / F 1 2 ( C o n t r o l ) o r D M E M F / 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h I G F I T G F 1 F G F 2 o r P D G F T h e m e d i u m f r o m t h e 7 1 0 d a y t i m e p e r i o d w a s h a r ve s t e d a n d a n a l yze d b y S D S / P a g e T h e b a n d s l a t e r i d e n t i f i e d b y w e st e r n b l o t i n F i g s 4 a n d 5 a r e l a b e l e d : f i b r o n e ct i n [ F N ] p r o co l l a g e n I [ p r o # 1 ( ) a n d p N # 1 ( ) ] a n d p r o co l l a g e n " [ p r o # 1 ( " ) a n d p N # 1 ( " ) ]

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4 0 F i g u r e 8 W e st e r n b l o t s o f m e d i a f r o m d a y 1 0 ke r a t o cyt e cu l t u r e s u si n g a n t i b o d i e s t o E D A f i b r o n e ct i n f o r E D A f i b r o n e ct i n ( A ) a n d t o f i b r o n e ct i n f o r t o t a l f i b r o n e ct i n ( B ) K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d w i t h D M E M / F 1 2 ( C o n t r o l ) o r D M E M F / 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h I G F I T G F 1 F G F 2 o r P D G F T h e b a n d s d e t e ct e d b y t h e se a n t i b o d i e s co r r e sp o n d t o t h e b a n d s m a r ke d F N o n f i g u r e 3

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4 1 F i g u r e 9 W e st e r n b l o t s o f m e d i a f r o m d a y 1 0 ke r a t o cyt e cu l t u r e s u si n g a n t i b o d i e s t o p r o co l l a g e n t yp e ( A ) a n d p r o co l l a g e n t yp e " ( B ) K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d w i t h D M E M / F 1 2 ( C o n t r o l ) o r D M E M F / 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h I G F I T G F 1 F G F 2 o r P D G F T h e b a n d s m a r ke d p r o # 1 ( ) p r o # 1 ( " ) p N # 1 ( ) a n d p N # 1 ( " ) co r r e sp o n d s t o t h e m i g r a t i o n p o si t i o n o f t h e b a n d m a r ke d p r o # 1 ( ) ( " ) a n d p N # 1 ( ) ( " ) o n f i g u r e 3 T h e m i g r a t i o n p o si t i o n o f p e p si n d i g e st e d co l l a g e n t yp e s a n d " a r e m a r ke d a s # 1 ( ) # 2 ( ) a n d # 1 ( " ) r e sp e ct i ve l y.

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4 2 F i g u r e 1 0 F i b r i l l a r c o l l a g e n p r e se n t i n t h e m e d i u m a n d ce l l l a ye r o f d a y 1 0 ke r a t o cyt e c u l t u r e s K e r a t o cy t e s w e r e cu l t u r e d w i t h D M E M / F 1 2 ( C o n t r o l ) o r D M E M F / 1 2 s u p p l e m e n t e d w i t h I G F I T G F 1 F G F 2 o r P D G F C u l t u r e s w e r e h a r ve st e d o n d a y 1 0 a n d sa m p l e s w e r e d i g e st e d w i t h p e p si n p r i o r t o e l e ct r o p h o r e si s. A p e p si n a l o n e co n t r o l w a s a d d e d ( P e p si n ) T h e m i g r a t i o n p o si t i o n o f t h e # 1 ( ) # 2 ( ) a n d # 1 ( " ) ch a i n s o f co l l a g e n a r e m a r ke d

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4 3 F i g u r e 1 1 G l yco sa m i n o g l yca n syn t h e si s b y ke r a t o cyt e c u l t u r e s K e r a t o cy t e s w e r e cu l t u r e d w i t h D M E M / F 1 2 ( C o n t r o l ) o r D M E M F / 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h I G F I T G F 1 F G F 2 o r P D G F a n d r a d i o l a b e l e d w i t h 3 H g l u co sa m i n e o n d a ys 7 1 0 T h e i n co r p o r a t e d r a d i o l a b e l s e cr e t e d i n t h e m e d i a w a s t h e n ch a r a ct e r i ze d b y i t s se n si t i vi t y t o ch o n d r o i t i n a s e A B C f o r ch o n d r o i t i n su l f a t e ( A ) t o e n d o b e t a g a l a ct o si d a se f o r ke r a t a n su l f a t e ( B ) a n d h ya l u r o n a n l y a se f o r h ya l u r o n a n ( C ) W h e n co m p a r e d t o co n t r o l t h e sy n t h e si s o f c h o n d r o i t i n su l f a t e ( A ) w a s si g n i f i ca n t l y ( p < 0 0 0 8 ) h i g h e r i n c u l t u r e s t r e a t e d w i t h e a ch o f t h e g r o w t h f a ct o r s; ke r a t a n s u l f a t e ( B ) w a s si g n i f i ca n t l y ( p < 0 0 1 2 ) h i g h e r i n T G F 1 F G F 2 a n d P D G F t r e a t e d cu l t u r e s; a n d h ya l u r o n a n ( C ) w a s si g n i f i ca n t l y ( p < 0 0 5 ) h i g h e r i n cu l t u r e s t r e a t e d w i t h T G F 1 F G F 2 a n d P D G F

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4 4 F i g u r e 1 2 W e st e r n b l o t s o f m e d i u m f r o m d a y 1 0 ke r a t o cyt e cu l t u r e s u si n g a n t i b o d i e s t o d e co r i n b i g l yca n ke r a t o c a n a n d l u m i ca n K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d w i t h D M E M / F 1 2 ( C o n t r o l ) o r D M E M F / 1 2 su p p l e m e n t e d w i t h I G F I T G F 1 F G F 2 o r P D G F M e d i a w a s d i g e st e d w i t h ch o n d r o i t i n a se A B C f o r d e co r i n a n d b i g l y ca n o r e n d o b e t a g a l a ct o si d a se f o r ke r a t o c a n a n d l u m i ca n p r i o r t o e l e ct r o p h o r e si s.

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4 5 F i g u r e 1 3 D N A co n t e n t a n d p r o co l l a g e n t yp e p r o d u ct i o n o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d f i r st w i t h F G F 2 a n d t h e n ch a n g e d t o e a ch o f t h e g r o w t h f a ct o r s. K e r a t o cyt e w e r e cu l t u r e d w i t h F G F 2 f o r 7 d a y s ( F 7 ) t h e n m e d i u m w a s ch a n g e d t o D M E M F / 1 2 ( F C ) o r D M E M F / 1 2 s u p p l e m e n t e d w i t h I G F I ( F I ) T G F 1 ( F T ) F G F 2 ( F F ) o r P D G F ( F P ) a n d t h e k e r a t o cy t e s cu l t u r e d f o r 6 a d d i t i o n a l d a ys. K e r a t o cyt e s cu l t u r e d w i t h D M E M / F 1 2 o n d a ys 1 ( C 1 ) 7 ( C 7 ) a n d 1 3 ( C 1 3 ) w e r e u se d a s co n t r o l s. A : K e r a t o cyt e d e n si t y. D N A co n t e n t o f k e r a t o cyt e s cu l t u r e d w i t h F G F 2 f o r 7 d a ys w a s si g n i f i ca n t l y ( p < 0 0 0 0 1 ) h i g h e r t h a n t h e d a y 7 c o n t r o l K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n F G F 2 f o r 7 d a ys a n d t h e n sw i t ch e d t o P D G F ( F P ) o r t o I G F I ( F I ) h a d si g n i f i ca n t l y ( p < 0 0 2 5 ) h i g h e r D N A co n t e n t t h a n ke r a t o cyt e s co n t i n u o u sl y cu l t u r e d i n F G F 2 B : P r o co l l a g e n t yp e W e st e r n b l o t u si n g a n a n t i b o d y t o p r o co l l a g e n t yp e o f m e d i a h a r ve st e d o n d a ys 7 a n d 1 3 o f cu l t u r e

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4 6 F i g u r e 1 4 S ch e m a t i c r e p r e se n t a t i o n o f p o ssi b l e g r o w t h f a ct o r m e d i a t e d w o u n d h e a l i n g o f t h e co r n e a l st r o m a U p o n w o u n d i n g q u i e sce n t ke r a t o cyt e s a r e a ct i va t e d b y F G F 2 t o b e co m e h yp e r ce l l u l a r : ke r a t o cyt e s t h a t p r o l i f e r a t e a n d syn t h e si ze a p r o vi si o n a l m a t r i x, a m a t r i x t h a t l a cks co l l a g e n b u t co n t a i n s p r o t e o g l yc a n s a n d f i b r o n e ct i n T h e h y p e r ce l l u l a r ke r a t o cyt e s ca n b e st i m u l a t e d b y I G F I o r P D G F t o b e co m e co l l a g e n o u s k e r a t o cyt e s a n d syn t h e si ze a n o r m a l co l l a g e n o u s m a t r i x a b u n d a n t i n co l l a g e n t yp e a n d ke r a t o ca n I n t h i s ca se co l l a g e n o u s ke r a t o cyt e s e ve n t u a l l y b e co m e q u i e sce n t H yp e r ce l l u l a r k e r a t o cyt e s ca n a l so b e s t i m u l a t e d b y T G F 1 t o b e co m e f i b r o co l l a g e n o u s ke r a t o cyt e s a n d p r o d u ce a n E C M sca r r i ch i n E D A f i b r o n e ct i n b i g l yca n a n d h ya l u r o n a n I n a d d i t i o n w i t h o u t su b se q u e n t a ct i va t i o n b y o t h e r g r o w t h f a ct o r s, h yp e r ce l l u l a r ke r a t o cyt e s c a n r e m a i n h y p e r ce l l u l a r w h i ch g i ve r i se t o a h yp e r c e l l u l a r sca r

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4 7 C h a p t e r T h r e e C o l l a g e n p r o c e s s i n g b y k e r a t o c y t e s c u l t u r e d u n d e r a g a r o s e a n d i n m e d i a c o n t a i n i n g I G F I T G F F G F 2 a n d P D G F L a T i a E t h e r e d g e 1 B r a d l e y P K a n e 2 N i ko l a V a l d o v 1 S h e i l a A d a m s 1 D a vi d E B i r k 1 Jo h n R H a sse l l 1 2 D e p a r t m e n t s o f P a t h o l o g y a n d C e l l B i o l o g y 1 a n d M o l e cu l a r M e d i ci n e 2 C o l l e g e o f M e d i ci n e U n i ve r si t y o f S o u t h F l o r i d a T a m p a F L

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4 8 A b s t r a c t T h e t r a n sp a r e n cy o f t h e co r n e a l st r o m a e xt r a c e l l u l a r m a t r i x ( E C M ) i s a t t r i b u t e d t o t h e u n i q u e a r r a n g e m e n t a n d si ze o f t h e co l l a g e n f i b r i l s. P r e vi o u s st u d i e s h a ve s h o w n t h a t t h e p r o ce ssi n g o f p r o co l l a g e n t o c o l l a g e n f i b r i l s b y ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n i n su l i n i s e n h a n ce d b y a n a g a r o se o ve r l a y. W e co m p a r e d co l l a g e n p r o ce ssi n g b y ke r a t o cyt e s t r e a t e d w i t h I G F I T G F F G F 2 a n d P D G F i n cu l t u r e s w i t h o r w i t h o u t a n a g a r o s e o ve r l a y. C o l l a g e n a se i s o l a t e d b o vi n e ke r a t o cyt e s f r o m b o vi n e co r n e a s w e r e p l a t e d a t 4 0 0 0 0 ce l l s/ cm 2 a n d t h e n cu l t u r e d w i t h D M E M / F 1 2 a l o n e o r D M E M / F 1 2 su p p l e m e n t e d o n d a y 4 w i t h e i t h e r 1 0 n g I G F I 2 n g T G F 1 0 n g F G F 2 o r 1 0 n g P D G F / m l C u l t u r e s w e r e m a i n t a i n e d a s st a n d a r d cu l t u r e s o r o ve r l a y e d w i t h ~ 1 m m o f 3 % a g a r o se o n d a y 6 a n d h a r ve s t e d f o r a n a l ysi s o n d a ys 2 0 P e p si n d i g e st i o n a n d w a s u se d t o d e t e r m i n e p r o co l l a g e n d e p o si t e d i n t o t h e m e d i a a n d co l l a g e n co n t e n t o f c e l l l a ye r D i st r i b u t i o n o f c o l l a g e n t yp e I a n d f i b r o n e ct i n i n t h e E C M o f t h e a g a r o se c u l t u r e s w a s d e t e r m i n e d b y i m m u n o f l u o r e sc e n ce C o l l a g e n f i b r i l si ze a n d o r i e n t a t i o n w a s e v a l u a t e d b y e l e ct r o n m i c r o sco p y. O n l y 6 % o f t h e co l l a g e n w a s p r o ce sse d i n st a n d a r d cu l t u r e s f o r ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I a n d P D G F a n d t h e a g a r o se o ve r l a y i n cr e a se d p r o ce ssi n g 6 f o l d t o 3 1 % C o l l a g e n p r o ce ssi n g f o r F G F 2 w a s a t ~ 1 0 % w i t h o r w i t h o u t a g a r o se T G F t r e a t e d ke r a t o cyt e s p r o ce sse d 1 9 % o f t h e co l l a g e n i n st a n d a r d cu l t u r e a n d a g a r o se i n cr e a se d p r o ce ssi n g t o 3 1 % b u t i t w a s n o t a si g n i f i c a n t i n cr e a se I m m u n o f l o u r e sce n ce st a i n i n g f o r co l l a g e n t yp e I a n d f i b r o n e ct i n i n t h e E C M w e r e i n d i f f e r e n t p a t t e r n s f o r a l l g r o w t h f a ct o r s w h i c h

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4 9 su g g e st s t h e y d o n o t co d i st r i b u t e d E l e ct r o n m i cr o sco p y sh o w e d t h a t t h e F G F 2 a g a r o se c u l t u r e s h a d l i t t l e c o l l a g e n f i b r i l s a n d t h e ke r a t o cyt e s w e r e i n cl o se c e l l co n t a ct w h i l e I G F I T G F a n d P D G F a g a r o s e cu l t u r e s h a d a n e xt e n si ve E C M w i t h a b u n d a n t co l l a g e n f i b r i l s. T h e r e su l t s o f t h i s st u d y i n d i ca t e t h a t t h e syn t h e si s o f p r o co l l a g e n a n d t h e p r o ce ssi n g o f p r o co l l a g e n t o co l l a g e n a r e i n d e p e n d e n t l y r e g u l a t e d a n d g r o w t h f a c t o r sp e ci f i c. I n t r o d u c t i o n T h e a va sc u l a r co r n e a f u n ct i o n s a s a m a j o r r e f r a ct i ve e l e m e n t o f t h e e ye T h e st r o m a i s 9 0 % o f t h e t h i c kn e ss o f t h e co r n e a a n d i t co n si st s o f a u n i q u e l y t r a n sp a r e n t e x t r a ce l l l u l a r m a t r i x ( E C M ) a n d ke r a t o cyt e s. T h e st r o m a l E C M i s co m p r i se d p r i m a r i l y o f co l l a g e n t yp e s I a n d V t h a t a r r a n g e d i n u n i f o r m l y si ze d a n d sp a ce d f i b r i l s w i t h ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n s ( ke r a t o ca n a n d l u m i c a n ) o r ch o n d r o i t i n su l f a t e p r o t e o g l yca n s ( d e co r i n ) b e t w e e n t h e f i b r i l s [ 5 4 9 0 9 2 ] T h e h i g h l y o r g a n i ze d E C M i s syn t h e si ze d a n d se cr e t e d b y ke r a t o cyt e s w h i ch a r e d e n d r i t i c i n m o r p h o l o g y a n d a r e sp a r se l y sca t t e r e d a m o n g t h e st r o m a [ 9 3 9 4 ] T h e t r a n sp a r e n cy o f t h e co r n e a i s d u e t o t h e p r e ci se a r r a n g e m e n t o f t h e c o l l a g e n f i b r i l s i n t h e E C M [ 5 5 ] T h i s a r r a n g e m e n t c a n b e d i sr u p t e d a n d t r a n sp a r e n cy ca n b e co m p r o m i se d u p o n w o u n d i n g [ 4 5 7 2 ] A l t h o u g h t h e k e r a t o cy t e s r e a d i l y p r o l i f e r a t e a n d a r e b i o sy n t h e t i ca l l y a c t i ve d u r i n g co r n e a l d e ve l o p m e n t t h e y e xh i b i t a r e l a t i ve l y l o w l e ve l a ct i vi t y i n t h e a d u l t co r n e a a n d a r e co n si d e r e d q u i e sce n t [ 7 8 6 6 ] H o w e ve r t h e ke r a t o cyt e s b e co m e a c t i ve a g a i n w h e n a w o u n d o cc u r s t o t h e co r n e a st r o m a T h e

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5 0 ke r a t o cyt e s d a m a g e d d u r i n g w o u n d i n g u n d e r g o a p o p t o si s [ 6 6 6 8 ] S o m e o f t h e vi a b l e r e m a i n i n g ke r a t o cyt e s a r e a ct i va t e d t o p r o l i f e r a t e a n d m i g r a t e t o t h e w o u n d si t e [ 6 6 6 9 9 5 ] t o f o r m r e g i o n s o f h y p e r ce l l u l a r i t y [ 7 0 9 6 9 7 ] ; d e n se l y p a cke d ce l l s w i t h o n l y a sp a r se o r p r o vi si o n a l E C M T h e ke r a t o cyt e s ca n r e m a i n h y p e r ce l l u l a r r e su l t i n g i n a h yp e r ce l l u l a r sca r o r ca n g o o n t o st r a t i f y b y p r o d u ci n g a n e xt e n si ve co l l a g e n o u s E C M t h a t i s e i t h e r a n o r m a l E C M w h i ch r e st o r e s t r a n s p a r e n cy o r a n a b n o r m a l f i b r o t i c E C M w h i ch i s o p a q u e [ 4 7 2 9 8 9 9 ] T h u s, ke r a t o cyt e s f i r st g o t h r o u g h a p r o l i f e r a t i ve E C M d e f i ci e n t h yp e r ce l l u l a r p h a se t h a t i s t h e n f o l l o w e d b y e i t h e r a co l l a g e n o u s p h a se o r a f i b r o co l l a g e n o u s p h a se t h a t p r o d u ce s ke r a t o c yt e st r a t i f ca t i o n W e f o u n d t h a t t h e p h a se s o f E C M syn t h e si s s e e n d u r i n g w o u n d h e a l i n g i n vi vo co u l d b e r e p l i ca t e d b y t h e a ct i o n o f F G F 2 I G F I T G F a n d P D G F o n ke r a t o cyt e s i n vi t r o [ 1 0 0 ] F G F 2 st i m u l a t e d t h e h i g h e st l e v e l o f p r o l i f e r a t i o n a n d m a i n t a i n e d p r o t e o g l yca n sy n t h e si s b u t d i d n o t st i m u l a t e co l l a g e n syn t h e si s. I G F I T G F a n d P D G F i n co n t r a st st i m u l a t e d h i g h l e ve l s o f co l l a g e n a n d p r o t e o g l yc a n syn t h e si s. T G F a l so st i m u l a t e d h ya l u r o n a n b i g l yca n a n d f i b r o n e ct i n sy n t h e si s, co m p o n e n t s o f t h e f i b r o t i c E C M T h e r e f o r e w e p r o p o se d [ 1 0 0 ] t h a t i n w o u n d h e a l i n g ; 1 ) F G F 2 w o u l d i n d u ce t h e h yp e r c e l l u l a r p h a se p r o d u ci n g t h e sp a r se c o l l a g e n d e f i ci e n t p r o vi si o n a l m a t r i x, 2 ) t h e a ct i o n o f I G F I a n d P D G F w o u l d t h e n i n d u ce t h e co l l a g e n o u s p h a se p r o d u ci n g t h e n o r m a l st r o m a l E C M t h a t r e s t o r e s t r a n sp a r e n cy o r 3 ) t h e a ct i o n o f T G F b e t a w o u l d i n d u ce t h e f i b r o co l l a g e n o u s p h a se p r o d u ci n g t h e o p a q u e E C M t h a t ca u se s b l i n d n e ss.

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5 1 C o l l a g e n i s f i r st m a d e a s p r o c o l l a g e n : t h r e e p o l yp e p t i d e s co n t a i n i n g N a n d C t e r m i n a l g l o b u l a r d o m a i n s w i t h g l yci n e r i ch ce n t r a l r e g i o n t h a t f o r m s a t r i p l e h e l i x [ 1 1 ] I n vi vo t h e g l o b u l a r d o m a i n s a r e r a p i d l y r e m o ve d a l l o w i n g t h e h e l i ca l r e g i o n s t o a sso ci a t e a n d f o r m co l l a g e n f i b r i l s. F i b r o b l a st s i n st a n d a r d ce l l cu l t u r e d o n o t r e a d i l y p r o ce ss p r o co l l a g e n t o c o l l a g e n [ 8 3 ] A s a r e s u l t t h e p r o co l l a g e n a ccu m u l a t e s i n t h e cu l t u r e m e d i u m a n d ve r y l i t t l e co l l a g e n i s a sse m b l e d i n t o a n E C M a sso ci a t e d w i t h t h e c e l l s. W e h a ve f o u n d h o w e ve r t h a t a 3 % a g a r o s e o ve r l a y o n ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n i n su l i n i n cr e a se d co l l a g e n p r o ce ssi n g a n d t h e f o r m a t i o n o f a n E C M a ss o ci a t e d w i t h t h e ke r a t o cyt e s [ 8 4 ] I n t h e cu r r e n t st u d y, w e u se t h i s a g a r o se o ve r l a y ce l l cu l t u r e syst e m t o c o m p a r e co l l a g e n p r o ce ssi n g a n d E C M a sse m b l y b y k e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n e a ch o f t h e o f g r o w t h f a ct o r s t h a t i n d u c e t h e d i f f e r e n t p h a s e s o f co r n e a st r o m a l w o u n d r e p a i r M a t e r i a l s a n d M e t h o d s A l l ch e m i ca l s a n d g r o w t h f a c t o r s w e r e p u r ch a se d f r o m S i g m a A l d r i ch ( S t L o u i s, M O ) u n l e ss o t h e r w i se st a t e d C yQ u a n t ki t D M E M F / 1 2 p o l ya c r yl a m i d e g e l s, a s w e l l a s p r e ca s t p o l ya cr yl a m i d e g e l s a n d r e a g e n t s t h a t w e r e u se d f o r p r o t e i n se p a r a t i o n a n d t r a n s f e r w e r e p u r ch a se d f r o m I n vi t r o g e n ( C a r l sb a d C A ) a n d E C L W e st e r n b l o t a n a l ysi s syst e m w a s p u r ch a se d f r o m G E H e a l t h ca r e ( P i sca t a w a y, N J) C o s t a r ce l l cu l t u r e p l a t e s, n u n c 9 6 w e l l p l a t e a n d c h a m b e r sl i d e s w e r e p u r ch a se d f r o m F i sh e r S ci e n t i f i c ( S u w a n e e G A ) R a b b i t p o l ycl o n a l a n t i b o d i e s t o co l l a g e n t yp e I w e r e o b t a i n e d f r o m C o sm o B i o C o ( T o ky o Ja p a n ) a n d t o f i b r o n e ct i n f r o m C h e m i co n I n t e r n a t i o n a l ( T e m e cu l a C A ) F I T C

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5 2 co n j u g a t e d a n t i r a b b i t a n t i b o d i e s w e r e o b t a i n e d f r o m N o vu s B i o l o g i ca l s ( L i t t l e t o n C O ) A m o u se m o n o cl o n a l a n t i b o d y t o f i b r o n e ct i n a n d a n a l ka l i n e p h o sp h o t a se co n j u g a t e d g o a t a n t i m o u se se co n d a n t i b o d y w a s p u r ch a s e d f r o m S a n t a C r u z B i o t e ch n o l o g y ( S a n t a C r u z, C A ) f o r u se i n e n z ym e l i n ke d i m m u n o so r b e n t a ssa y. K e r a t o c y t e s i s o l a t i o n a n d c u l t u r e B o vi n e e ye s h a r v e st e d f r o m 1 2 m o n t h ca l v e s w e r e p u r ch a se d f r o m P e l F r e e ze ( R o g e r s, A R ) a n d ke r a t o cyt e s w e r e i s o l a t e d a s p r e vi o u sl y d e scr i b e d [ 5 0 ] B r i e f l y, co r n e a s w e r e r e m o v e d a n d ke r a t o cyt e s i so l a t e d b y u si n g t w o se q u e n t i a l co l l a g e n a se d i g e st i o n s. T h e c u l t u r e m e d i u m u se d t h r o u g h o u t w a s se r u m f r e e D M E M / F 1 2 co n t a i n i n g a n t i b i o t i cs a n d 1 m M 2 p h o sp h o a sco r b i c a ci d ( D M E M ) C e l l s w e r e p l a t e d a t ~ 4 0 0 0 0 0 ce l l s/ w e l l i n si x w e l l p l a t e s; ~ 2 0 0 0 0 0 ce l l s/ w e l l i n g e l a t i n co a t e d 2 w e l l sl i d e s; a n d ~ 1 0 0 0 0 0 0 ce l l s/ 6 0 m m d i sh o n d a y 0 T h e m e d i u m w a s c h a n g e d o n d a y 4 w i t h D M E M o r t o D M E M su p p l e m e n t e d w i t h 1 0 n g I G F I 2 n g T G F 1 0 n g F G F 2 o r 1 0 n g P D G F / m l K e r a t o cyt e cu l t u r e s w e r e o ve r l a ye d w i t h 3 % a g a r o se i n D M E M o n d a y 0 a s p r e vi o u sl y d e scr i b e d [ 8 4 ] I n b r i e f 3 g r a m s o f a g a r o se i n 5 0 m l s o f d i st i l l e d w a t e r w a s a u t o cl a ve d c o o l e d t o 3 7 C a n d m i xe d w i t h a n e q u a l vo l u m e o f 3 7 C 2 x D M E M T h e m e d i u m w a s r e m o v e d f r o m c u l t u r e s a n d t h e c e l l s w e r e o ve r l a ye d w i t h a vo l u m e o f 3 % a g a r o se s u f f i ci e n t t o p r o d u ce a l a ye r ~ 1 m m t h i ck o n t o p o f t h e ce l l s. T h e a g a r o se w a s a l l o w e d t o so l i d i f y a t r o o m t e m p e r a t u r e D M E M su p p l e m e n t e d w i t h 1 0 n g I G F I 2 n g T G F 1 0 n g F G F 2 o r 1 0 n g

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5 3 P D G F / m l w a s t h e n a d d e d t o t h e r e sp e ct i ve w e l l s. C u l t u r e s w e r e h a r ve st e d o n d a y 2 0 w i t h o u t i n t e r v e n i n g m e d i a ch a n g e s. D N A m e a s u r e m e n t D N A w a s e xt r a ct e d f r o m t h e ce l l l a ye r s o f e a c h w e l l o f h a r v e st e d cu l t u r e s u si n g t h e b u f f e r s u p p l i e d i n a C yq u a n t A ssa y K i t a n d t h e D N A m e a s u r e d u si n g m e t h o d s p r o vi d e d w i t h t h e ki t C a l f t h y m u s w a s u se d a s a st a n d a r d C o l l a g e n m e a s u r e m e n t M e d i u m a n d ce l l l a ye r o f cu l t u r e s w e r e p e p si n d i g e st e d a s p r e vi o u sl y d e scr i b e d [ 8 4 1 0 0 ] t o i so l a t e co l l a g e n B r i e f l y e i g h t m i l l i l i t e r s o f cu l t u r e m e d i u m f r o m a si n g l e w e l l o f a si x w e l l p l a t e w a s a d j u s t e d t o 0 5 M a ce t i c a ci d E i g h t m i l l i l i t e r s o f 0 5 M a ce t i c a ci d w a s a d d e d t o t h e co r r e s p o n d i n g w e l l A f t e r sa m p l e s w e r e ch i l l e d t o 4 C 1 0 0 l o f 4 m g / m l p e p si n st o ck w a s a d d e d t o t h e m e d i u m a n d t o e a ch w e l l T h e sa m p l e s w e r e d i g e st e d o ve r n i g h t a t 4 C n e u t r a l i ze d t o i n a ct i va t e t h e p e p si n d i a l yze d a g a i n st d i st i l l e d w a t e r l yo p h i l i ze d a n d r e co n st i t u t e d i n 1 0 0 l o f 1 X L D S sa m p l e b u f f e r ( I n vi t r o g e n ) S a m p l e s o f 1 0 l w e r e r e d u ce d a n d e l e c t r o p h o r e se d o n 3 8 % t r i s a ce t a t e g e l s. G e l s w e r e so a ke d i n S i m p l y b l u e sa f e st a i n a cco r d i n g t o t h e m a n u f a ct u r e r s i n st r u ct i o n s ( I n vi t r o g e n ) t o st a i n t h e co l l a g e n T h e l a n e s w e r e sca n n e d a n d t h e o p t i ca l d e n si t y o f t h e # a n d ch a i n s o f co l l a g e n w a s m e a su r e d u si n g Q u a n t i t y O n e C o l l a g e n f o r u se a s st a n d a r d i n S D S / P A G E a n a l ysi s, w a s a l so i so l a t e d f r o m co r n e a s b y p e p si n d i g e st i o n a n d sp e ci f i ca l l y p r e ci p i t a t e d b y d i a l ysi s a g a i n st

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5 4 co l d d i st i l l e d w a t e r T h e p r e ci p i t a t e d co l l a g e n w a s so l u b i l i ze d i n 0 0 1 N H C l a n d q u a n t i f i e d b y m e a s u r i n g i t s a b so r b a n ce a t 2 2 8 n N F i b r o n e c t i n m e a s u r e m e n t F i b r o n e c t i n l e ve l s i n t h e m e d i a w e r e d e t e r m i n e d b y e n zym e l i n ke d i m m u n o so r b e n t a ssa y u si n g 9 6 w e l l n u n c p l a t e s. M e d i a f r o m ce l l cu l t u r e s a n d f i b r o n e ct i n u se d a s s t a n d a r d w e r e co a t e d o n t h e w e l l s i n b i ca r b o n a t e b u f f e r T h e w e l l s w e r e b l o cke d w i t h p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) co n t a i n i n g 1 % b o vi n e se r u m a l b u m i n T h e p r i m a r y a n d a l ka l i n e p h o sp h o t a se co n j u g a t e d se co n d a n t i b o d y w a s d i l u t e d i n P B S w i t h 0 5 % t w e e n 2 0 P n i t o p h e n yl p h o sp h a t e i n d i e t h a n o l a m i n e w a s u s e d a s a su b st r a t e f o r c o l o r d e ve l o p m e n t a n d o p t i ca l d e n si t y w a s m e a su r e d a t 4 0 5 n m i n a 9 6 w e l l p l a t e r e a d e r F i x a t i o n a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y C e l l s o n g l a s s sl i d e s w e r e f i xe d i n 4 % p a r a f o r m a l d e h yd e i n P B S f o r 1 h r a n d r i n se d w i t h 1 % g l yci n e T h e a g a r o se l a ye r w a s r e m o ve d a n d n o n sp e ci f i c a n t i g e n s w e r e b l o cke d w i t h 2 5 % B S A i n P B S a t r o o m t e m p e r a t u r e S l i d e s w e r e t h e n i n cu b a t e d w i t h a r a b b i t a n t i b o vi n e co l l a g e n t yp e I a n t i b o d y a t 1 : 5 0 0 o r r a b b i t a n t i b o vi n e f i b r o n e ct i n a t 1 : 1 0 0 0 i n d i l u t i o n b u f f e r ( 1 % B S A 1 % T w e e n 2 0 i n 1 x P B S ) f o r 2 h r s. U n b o u n d a n t i b o d y w a s w a sh e d o f f w i t h t w o 5 m i n u t e w a sh e s i n P B S / T w e e n 2 0 T h e p r i m a r y a n t i b o d i e s w e r e d e t e ct e d b y F I T C co n j u g a t e d a n t i r a b b i t a n t i b o d y a t 1 : 5 0 0 i n d i l u t i o n b u f f e r i n c u b a t e d f o r 1 h o u r i n t h e d a r k. A f t e r w a r d sl i d e s w e r e g i ve n t w o 5 m i n u t e w a s h e s w i t h P B S i n t h e d a r k. S l i d e s

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5 5 w e r e a l l o w e d t o d r y. C o ve r sl i p s w e r e m o u n t e d w i t h D A P I m o u n t i n g m e d i u m w h i ch st a i n t h e n u cl e i o f a l l ce l l s. S l i d e s st a i n e d w i t h t h e s e co n d a r y a n t i b o d y o n l y w e r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e l e ve l s o f b a c kg r o u n d f l u o r e sc e n ce f o r r e c o r d i n g d i g i t a l i m a g e s o n sl i d e s st a i n e d w i t h b o t h p r i m a r y a n d s e co n d a r y a n t i b o d i e s. P o si t i ve co n t r o l s w e r e se ct i o n s o f f r e sh b o vi n e co r n e a l t i ssu e F i x a t i o n a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y T r a n s m i ssi o n e l e ct r o n m i c r o sco p y w a s u se d t o e va l u a t e t h e o r g a n i za t i o n o f E C M d e p o si t e d b y ke r a t o cyt e s c u l t u r e d u n d e r a g a r o se K e r a t o cyt e s c u l t u r e d i n 6 0 m m p l a t e s w e r e f i xe d i n 2 5 % g l u t a r a l d e h yd e 4 % p a r a f o r m a l d e h yd e 0 1 M so d i u m ca co d yl a t e a n d 8 0 m M ca l ci u m ch l o r i d e T h e a g a r o se o v e r l a y w a s r e m o ve d a n d cu l t u r e s w e r e p o s t f i xe d w i t h 1 % o sm i u m t e t r o xi d e T h e sa m p l e s w e r e d e h y d r a t e d w i t h a g r a d e d se r i e s o f e t h a n o l / w a t e r so l u t i o n s. C e l l s w e r e scr a p p e d o f f t h e d i sh w i t h a ce l l scr a p e r t r a n s f e r r e d t o a 1 5 m l t u b e f u r t h e r d e h yd r a t e d w i t h p u r e p r o p yl e n e o xi d e a n d t h e n i n f i l t r a t e d a n d e m b e d d e d i n a m i xt u r e o f E m b e d 8 1 2 n a d i c m e t h yl a n h yd r i d e d o d e ce n yl su cci n i c a n h y d r i d e a n d D M P 3 0 ( E l e ct r o n M i cr o sco p y S ci e n ce s, P A ) S e ct i o n s o f 9 0 n m t h i ckn e ss w e r e e xa m i n e d u si n g a JE O L 1 4 0 0 t r a n sm i ssi o n e l e ct r o n m i c r o sco p e a n d p h o t o g r a p h e d w i t h a G a t a n O r i u s ca m e r a S t a t i s t i c s A l l D N A a n d co l l a g e n va l u e s w e r e t h e m e a n o f 3 d e t e r m i n a t i o n s. S t a t vi e w V e r si o n 5 ( S A S I n st i t u t e C a r y, N C ) w a s u se d f o r st a t i st i ca l co m p a r i so n s.

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5 6 S a m p l e s w e r e a n a l yze d u si n g a p a i r e d t t e st a n d st a n d a r d d e vi a t i o n w a s u s e d w h e n n = 3 R e s u l t s K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d f o r d a ys 4 t o 2 0 i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I T G F F G F 2 o r P D G F i n st a n d a r d cu l t u r e a n d w i t h a n a g a r o se o ve r l a y. T h e cu l t u r e s w e r e h a r ve st e d o n d a y 2 0 a n d t h e f i b r i l l a r co l l a g e n d e p o si t e d w i t h t h e ce l l l a ye r w a s so l u b i l i ze d b y p e p si n d i g e st i o n T h e co l l a g e n i n t h e p e p si n d i g e st i o n w a s m e a su r e d b y S D S / P A G E a n d t h e a m o u n t o f co l l a g e n w a s e xp r e sse d p e r D N A I G F I a n d P D G F a g a r o s e cu l t u r e s a ccu m u l a t e d si g n i f i ca n t l y m o r e co l l a g e n w i t h t h e ce l l l a ye r i n a g a r o se c u l t u r e s t h a n i n st a n d a r d cu l t u r e b y 2 8 f o l d ( F i g 1 5 ) I n c o n t r a st st a n d a r d a n d a g a r o se ke r a t o cyt e cu l t u r e s t r e a t e d w i t h T G F a n d F G F 2 h a d si m i l a r l e ve l s o f co l l a g e n a sso ci a t e d w i t h t h e ce l l l a ye r a l t h o u g h T G F cu l t u r e s a cc u m u l a t e d si g n i f i ca n t l y m o r e co l l a g e n t h a n F G F 2 b y 6 f o l d T h e se r e su l t s i n d i ca t e t h a t t h e a g a r o se o ve r l a y si g n i f i ca n t l y e n h a n ce d c o l l a g e n d e p o si t i o n w i t h t h e c e l l l a y e r i n ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I a n d P D G F I n vi vo p r o c o l l a g e n a p r e cu r so r o f co l l a g e n i s r e a d i l y p r o ce sse d a n d su b se q u e n t l y a sse m b l e d i n t o m a t u r e co l l a g e n f i b r i l s [ 1 1 ] H o w e ve r i n st a n d a r d ce l l cu l t u r e p r o co l l a g e n i s n o t e f f i ci e n t l y p r o ce sse d a n d i t a ccu m u l a t e s i n t h e m e d i a a s p r o co l l a g e n [ 8 3 8 4 ] W e u se d p e p s i n d i g e st i o n t o co n ve r t t h e p r o co l l a g e n i n t h e m e d i a t o co l l a g e n t o m a ke i t co m p a t i b l e w i t h m e a s u r e m e n t o f co l l a g e n l e ve l s i n t h e ce l l l a ye r C u l t u r e s t r e a t e d w i t h I G F I T G F a n d P D G F

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5 7 a n d o ve r l a ye d w i t h a g a r o s e h a d si g n i f i ca n t l y l o w e r ( 4 5 5 5 % l o w e r ) l e ve l s o f co l l a g e n i n t h e m e d i a t h a n t h e st a n d a r d cu l t u r e s ( F i g 1 6 ) T h i s i n d i ca t e s t h a t p r o co l l a g e n se cr e t i o n i n t o t h e m e d i a w a s si g n i f i ca n t l y r e d u c e d b y t h e a g a r o se o ve r l a y f o r ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n a l l g r o w t h f a ct o r s e xce p t F G F 2 T h e a m o u n t s o f co l l a g e n i n t h e m e d i a a n d ce l l l a ye r s w e r e t h e n c o m b i n e d t o d e t e r m i n e t o t a l co l l a g e n p r o d u ce d i n st a n d a r d a n d a g a r o se cu l t u r e s t r e a t e d w i t h g r o w t h f a ct o r s ( F i g 1 7 ) K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I T G F a n d P D G F p r o d u ce d si g n i f i ca n t l y l e ss ( 3 7 3 9 % l e ss ) t o t a l c o l l a g e n w h e n o ve r l a ye r e d w i t h a g a r o se T h i s i n d i ca t e s t h a t t h e a g a r o se o ve r l a y si g n i f i ca n t l y i n h i b i t s co l l a g e n sy n t h e si s i n ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n a l l g r o w t h f a ct o r s e xc e p t F G F 2 W e n e xt ca l cu l a t e d t h e a m o u n t o f co l l a g e n i n t h e ce l l l a ye r a s a p e r ce n t o f t h e t o t a l co l l a g e n ( c e l l l a ye r a n d m e d i a ) p r o d u ce d ( F i g 1 8 ) T h e r e su l t s sh o w t h a t ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n I G F I a n d P D G F i n st a n d a r d cu l t u r e co n v e r t e d ~ 6 % o f t h e t o t a l co l l a g e n p r o d u ce d t o f i b r i l l a r c o l l a g e n a n d t h i s w a s i n cr e a se d t o 3 1 % ( 5 f o l d ) b y a g a r o se K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n T G F i n st a n d a r d cu l t u r e h o w e ve r co n ve r t e d si g n i f i ca n t l y m o r e ( 1 9 % ) t h a n I G F I a n d P D G F i n st a n d a r d cu l t u r e a n d a l t h o u g h t h e a g a r o se i n c r e a se d c o n ve r si o n t o 3 1 % f o r T G F i t w a s n o t si g n i f i ca n t l y m o r e T h u s, f o r ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n T G F t h e a g a r o s e o ve r l a y d i d n o t si g n i f i ca n t l y e n h a n ce p r o co l l a g e n co n ve r si o n t o co l l a g e n o v e r t h a t a ch i e ve d i n st a n d a r d cu l t u r e s b e ca u se o f t h e a l r e a d y h i g h l e ve l s o f c o n ve r si o n i n st a n d a r d cu l t u r e C o l l a g e n co n ve r si o n w a s a t ~ 1 0 % f o r F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s, w i t h o r w i t h o u t a g a r o se T h e se r e su l t s i n d i ca t e t h e syn t h e si s o f p r o co l l a g e n a n d

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5 8 t h e p r o c e ssi n g o f p r o co l l a g e n a r e i n d e p e n d e n t l y r e g u l a t e d a n d g r o w t h f a ct o r sp e ci f i c. F i b r o n e c t i n i s a co m p o n e n t o f t h e E C M t h a t h a s a m o l e cu l a r w e i g h t si m i l a r t o p r o co l l a g e n t yp e I T h e r e f o r e w e a l so m e a su r e d t h e l e ve l s o f f i b r o n e ct i n i n t h e m e d i a o f ke r a t o cyt e s t r e a t e d w i t h g r o w t h f a ct o r s a n d cu l t u r e d w i t h a n d w i t h o u t a g a r o se o v e r l a y ( F i g 1 9 ) T h e l e ve l s o f f i b r o n e ct i n i n t h e m e d i a o f ke r a t o cyt e s i n st a n d a r d cu l t u r e co n t a i n i n g P D G F a n d T G F w a s 5 f o l d a n d 3 8 f o l d h i g h e r r e s p e ct i ve l y, t h a n t h a t f o r I G F I o r F G F 2 i n st a n d a r d c u l t u r e H o w e ve r i n co n t r a st t o t h a t se e n w i t h t h e a g a r o se m e d i a t e d r e d u c t i o n o f p r o co l l a g e n i n t h e m e d i a a g a r o se d i d n o t r e d u ce t h e l e ve l s o f f i b r o n e ct i n d e p o si t e d i n t o t h e m e d i a T h e d i st r i b u t i o n o f co l l a g e n a n d f i b r o n e c t i n w i t h i n t h e ce l l l a ye r o f t h e a g a r o se c u l t u r e s w a s d e t e r m i n e d b y i m m u n o h i st o ch e m i st r y u si n g r a b b i t a n t i b o d i e s t o co l l a g e n t yp e I a n d t o f i b r o n e ct i n f o l l o w e d b y a F I T C l a b e l e d s e co n d g o a t a n t i r a b b i t a n t i b o d y ( F i g 2 0 ) N u cl e i w e r e st a i n e d w i t h D A P I T h e l o ca t i o n o f t h e n u cl e i sh o w e d t h a t ke r a t o cyt e s t e n d e d t o cl u st e r i n a g g r e g a t e s w h e n cu l t u r e d i n I G F I b u t w e r e m o r e u n i f o r m l y d i st r i b u t e d w h e n cu l t u r e d i n t h e o t h e r g r o w t h f a ct o r s. T h e a n t i b o d y t o co l l a g e n t yp e I sh o w e d t h a t co l l a g e n i n I G F I t r e a t e d c u l t u r e s w e r e d e p o si t e d i n l i n e a r l y co n n e ct e d cl u m p s t h a t c o r r e sp o n d e d w i t h t h e ce l l a g g r e g a t e s. T h e co l l a g e n d e p o si t e d i n t h e T G F t r e a t e d cu l t u r e s w e r e d i st r i b u t e d m o r e u n i f o r m l y i n l a r g e h o m o g e n o u s p a t ch e s. S t a i n i n g f o r co l l a g e n i n F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s w a s a l m o st n o n e xi st e n t T h e co l l a g e n i n t h e P D G F t r e a t e d cu l t u r e s w a s d e p o si t e d i n b o t h i n t e n se l y st a i n i n g cl u m p s a n d i n

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5 9 f a i n t l y st a i n i n g p a t ch e s. T h e a n t i b o d y t o f i b r o n e ct i n r e ve a l e d f i b r o n e ct i n w a s d i st r i b u t e d i n b o t h t h i ck a n d t h i n l i n e a r t r a cks: t h i ck l i n e a r t r a cks i n t h e I G F I a n d P D G F t r e a t e d cu l t u r e s, m u c h t h i n n e r a n d m o r e h o m o g e n e o u sl y d i st r i b u t e d l i n e a r t r a cks i n t h e T G F t r e a t e d cu l t u r e s a n d b o t h t h i ck a n d t h i n l i n e a r t r a cks i n t h e F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s. S t a i n i n g f o r f i b r o n e ct i n w a s cl e a r l y m o r e e xt e n si ve t h a n t h e st a i n i n g f o r co l l a g e n i n t h e F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s. T h e si ze a n d o r g a n i za t i o n o f t h e co l l a g e n f i b r i l s i n t h e E C M o f t h e ce l l l a ye r o f a g a r o se cu l t u r e s w a s d e t e r m i n e d b y t r a n sm i ssi o n e l e ct r o n m i cr o sc o p y. T h e r e w a s e xt e n si ve E C M sp a ce b e t w e e n c e l l s i n t h e I G F I T G F a n d P D G F t r e a t e d c u l t u r e s t h a t w a s f i l l e d w i t h co l l a g e n f i b r i l s ( F i g 2 1 ) T h e d i a m e t e r o f f i b r i l s i n t h e T G F t r e a t e d cu l t u r e w e r e a p p r o xi m a t e l y o n e h a l f t h e d i a m e t e r a n d w e r e m o r e u n i f o r m l y o r i e n t e d t h a n t h a t se e n i n I G F I t r e a t e d cu l t u r e s. T h e f i b r i l s i n t h e P D G F t r e a t e d cu l t u r e s sh o w e d t h e ch a r a ct e r i st i cs se e n i n b o t h t h e T G F a n d I G F I cu l t u r e s. T h e r e w a s o n l y l i m i t e d E C M sp a ce i n t h e F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s. T h e ke r a t o cyt e s w e r e d e n se l y p a ck e d t o g e t h e r a n d t h e c o l l a g e n f i b r i l s i n t h e sp a ce b e t w e e n t h e ce l l s w e r e sp a r se T h e ce l l su r f a ce s i n F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s sh o w e d e xt e n si ve r e g i o n s o f ce l l ce l l co n t a ct D i s c u s s i o n T h e r e su l t s o f t h e se st u d i e s sh o w s t h a t co m p a r e d t o s t a n d a r d cu l t u r e s, t h e a g a r o se o ve r l a y e n h a n ce d c o l l a g e n a ccu m u l a t i o n a ss o ci a t e d w i t h t h e ce l l l a ye r o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I a n d P D G F b u t n o t i n ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n T G F T G F I G F I a n d P D G F a l l st i m u l a t e d c o l l a g e n

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6 0 syn t h e si s i n st a n d a r d c u l t u r e s [ 1 0 0 ] T h e r e su l t s o f t h e cu r r e n t st u d y, h o w e ve r sh o w T G F t r e a t e d ke r a t o cyt e s t o b e m o r e e f f i ci e n t a t p r o ce ssi n g p r o co l l a g e n t o co l l a g e n i n st a n d a r d cu l t u r e t h a n I G F I o r P D G F a n d t h i s m a y a cco u n t f o r t h e l a ck o f a n e n h a n ci n g e f f e ct o f t h e a g a r o se o ve r l a y o n T G F t r e a t e d ke r a t o cyt e s. T h e a ccu m u l a t i o n o f co l l a g e n a sso ci a t e d w i t h t h e ce l l l a ye r w a s a l so n o t e n h a n ce d b y t h e a g a r o se o ve r l a y o f t h e F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s. F G F 2 h o w e ve r d o e s n o t st i m u l a t e co l l a g e n sy n t h e si s i n st a n d a r d cu l t u r e [ 1 0 0 ] T h i s su g g e st s t h a t t h e a g a r o se o ve r l a y o n l y ca n e n h a n ce co l l a g e n p r o ce ssi n g w h e n co l l a g e n syn t h e si s i s st i m u l a t e d b y so m e g r o w t h f a ct o r s. T G F h a s p r e vi o u sl y b e e n s h o w n t o e n h a n c e t h e p r o l i f e r a t i o n a n d c e l l st r a t i f i ca t i o n o f h u m a n f i b r o b l a st i n s t a n d a r d c u l t u r e a n d i n m e d i a co n t a i n i n g f e t a l b o vi n e se r u m [ 1 0 1 ] a n d t h e se a n t i b o d i e s t o f i b r o n e ct i n co u l d i n h i b i t b o t h t h e b a sa l l e ve l s a n d T G F st i m u l a t e d l e ve l s o f p r o l i f e r a t i o n a n d st r a t i f i ca t i o n W e f o u n d T G F st i m u l a t e d f i b r o n e c t i n syn t h e si s 5 a n d 2 0 f o l d g r e a t e r t h a n t h a t o f P D G F a n d I G F I r e sp e ct i ve l y a n d t h a t t h e d i s t r i b u t i o n o f f i b r o n e ct i n i n t h e E C M o f t h e T G F t r e a t e d cu l t u r e s, a s d e t e r m i n e d b y i m m u n o f l o u r e sc e n t st a i n i n g w a s d i st i n ct i ve l y d i f f e r e n t t h a n t h a t o f t h e I G F I a n d P D G F t r e a t e d cu l t u r e s. F i b r o n e c t i n h a s b e e n sh o w n t o p l a y a n e ss e n t i a l r o l e i n t h e a sse m b l y o f co l l a g e n t yp e s I a n d I I I f i b r i l s [ 1 0 2 1 0 3 ] T h e h i g h l e ve l s o f f i b r o n e ct i n p r o d u ct i o n se e n i n T G F t r e a t e d cu l t u r e s a n d i t s u n i q u e d i st r i b u t i o n m a y b e r e sp o n si b l e f o r t h e h i g h l e ve l s o f p r o c o l l a g e n t o co l l a g e n co n ve r si o n s e e n i n t h e T G F t r e a t e d ke r a t o cyt e s i n st a n d a r d cu l t u r e

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6 1 T h e a g a r o se o ve r l a y r e d u ce d t h e l e v e l s o f p r o co l l a g e n b u t n o t t h e l e ve l s o f f i b r o n e ct i n i n t h e m e d i a o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I T G F a n d P D G F W e p r e vi o u sl y p r o p o se d [ 8 4 ] t h a t t h e a g a r o se o ve r l a y m a y b e a c t i n g a s a se m i p e r m e a b l e b a r r i e r o r m o l e cu l a r si e ve t o r e t a r d t h e d i f f u si o n o f p r o co l l a g e n i n t o t h e m e d i a a n d i n cr e a se i t s co n ce n t r a t i o n a t t h e ce l l su r f a ce w h e r e t h e e n zym e s a r e t h a t r e m o ve t h e N a n d C t e r m i n a l g l o b u l a r d o m a i n s f r o m t h e p r o c o l l a g e n F i b r o n e ct i n a n d p r o co l l a g e n h a ve si m i l a r m o l e cu l a r w e i g h t s a n d t h e d i f f e r e n t i a l e f f e ct t h a t t h e a g a r o s e h a s o n t h e i r d i f f u si o n i n t o t h e m e d i a w o u l d su g g e st t h a t t h e a g a r o s e i s n o t a ct i n g a s a m o l e cu l a r si e ve T h e i m m u n o st a i n i n g f o r co l l a g e n a n d f i b r o n e c t i n sh o w e d t h e y w e r e d e p o si t e d w i t h t h e ce l l l a ye r i n d i st i n c t l y d i f f e r e n t p a t t e r n s f o r e a ch o f t h e g r o w t h f a ct o r s. T h e ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n I G F I f o r m e d a g g r e g a t e s a n d c o l l a g e n w a s d e p o si t e d i n cl u m p s w h i l e t h e f i b r o n e ct i n w a s i n t h i ck t r a cks a sso ci a t e d w i t h t h e se ce l l a g g r e g a t e s. I n co n t r a st t h e co l l a g e n w a s d e p o si t e d i n l a r g e p a t c h e s a n d t h e f i b r o n e c t i n i n t h i n t r a cks a n d b o t h w e r e m o r e u n i f o r m l y d i st r i b u t e d i n c e l l l a ye r o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n T G F T h e p a t t e r n o f co l l a g e n d i st r i b u t i o n i n t h e P D G F t r e a t e d cu l t u r e s w a s i n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h a t s e e n i n t h e I G F I a n d T G F t r e a t e d cu l t u r e s S i m i l a r l y, t h e p a t t e r n o f d i st r i b u t i o n o f f i b r o n e ct i n d e p o si t e d i n t h e P D G F t r e a t e d cu l t u r e s a l so h a d ch a r a c t e r i st i cs o f b o t h t h e I G F I a n d T G F cu l t u r e s: i t w a s d i st r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e c u l t u r e b u t i t w a s i n t h i ck b a n d s, l i ke t h e I G F cu l t u r e s. F i b r o n e ct i n d i st r i b u t i o n i s t h e F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s w a s co n si d e r a b l y m o r e e xt e n si ve t h a n t h a t o f c o l l a g e n T h e s e

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6 2 o b se r va t i o n s su g g e s t t h a t t h e co l l a g e n a n d f i b r o n e ct i n d e p o si t e d i n t h e E C M o f t h e se cu l t u r e s d o n o co d i st r i b u t e E l e ct r o n m i cr o s co p y r e ve a l e d d i f f e r e n ce s i n t h e co l l a g e n f i b r i l s t h a t w e r e d e p o si t e d i n t h e E C M b y k e r a t o cy t e s cu l t u r e d i n t h e d i f f e r e n t g r o w t h f a ct o r s. T h e f i b r i l s i n t h e I G F I t r e a t e d cu l t u r e s w e r e o r g a n i ze d i n l a m e l l a e w h i l e t h e f i b r i l s i n t h e T G F t r e a t e d cu l t u r e s w e r e t h i n n e r a n d w e r e m o r e u n i f o r m l y o r i e n t e d A l t h o u g h t h e r e w a s a b u n d a n t f i b r i l d e p o si t i o n i n t h e I G F I T G F a n d P D G F t r e a t e d c u l t u r e s t h e r e w a s o n l y a f e w f i b r i l s se e n i n t h e F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s. I n t h e F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s, t h e ke r a t o cyt e s w e r e d e n s e l y p a cke d t o g e t h e r w i t h e xt e n si ve cl o se ce l l c o n t a ct s, l e a vi n g l i t t l e sp a ce f o r a n E C M T h i s i s si m i l a r t o t h a t se e n f o r ke r a t o cyt e s i n t h e h yp e r c e l l u l a r p h a s e o f co r n e a l st r o m a l w o u n d h e a l i n g

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6 3 F i g u r e 1 5 C o l l a g e n l e ve l s a ss o ci a t e d w i t h t h e ce l l l a ye r o f ke r a t o cyt e s i n st a n d a r d a n d i n a g a r o se cu l t u r e K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I T G F F G F 2 o r P D G F a n d h a r ve st e d f o r a n a l ysi s o n d a y 2 0 A g a r o se o ve r l a y si g n i f i ca n t l y e n h a n c e d co l l a g e n a ccu m u l a t i o n i n ke r a t o cyt e s c u l t u r e d i n I G F I a n d P D G F b y 2 8 f o l d T G F a n d F G F 2 a g a r o se c u l t u r e s h a d si m i l a r l e ve l s o f co l l a g e n i n t h e ce l l l a ye r a s t h e st a n d a r d cu l t u r e s.

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6 4 F i g u r e 1 6 C o l l a g e n l e ve l s i n t h e m e d i a o f ke r a t o cyt e s i n st a n d a r d a n d i n a g a r o se c u l t u r e K e r a t o cyt e s w e r e c u l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I T G F F G F 2 o r P D G F a n d h a r ve st e d f o r a n a l ysi s o n d a y 2 0 K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I T G F a n d P D G F a n d u n d e r a g a r o se d e p o si t e d si g n i f i ca n t l y l e ss co l l a g e n i n t o t h e m e d i a t h a n i n p a r a l l e l st a n d a r d cu l t u r e s.

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6 5 F i g u r e 1 7 C o l l a g e n l e ve l s a ss o ci a t e d w i t h t h e ce l l l a ye r a n d m e d i a co m b i n e d o f ke r a t o cy t e s i n st a n d a r d a n d i n a g a r o se cu l t u r e s. K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I T G F F G F 2 o r P D G F a n d h a r ve st e d o n d a y 2 0 I G F I T G F a n d P D G F a g a r o se cu l t u r e s p r o d u ce d si g n i f i ca n t l y l e ss t o t a l co l l a g e n t h a n st a n d a r d cu l t u r e s.

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6 6 F i g u r e 1 8 P r o co l l a g e n t o co l l a g e n c o n ve r si o n r a t e s f o r ke r a t o cyt e s i n st a n d a r d a n d a g a r o se cu l t u r e s. C o l l a g e n a m o u n t s a ss o ci a t e d w i t h t h e ce l l l a ye r ( F i g u r e 1 ) w e r e d i vi d e d b y t h e a m o u n t s i n t h e c e l l l a ye r a n d m e d i a co m b i n e d a n d e xp r e sse d a s a p e r c e n t C o m p a r e d t o st a n d a r d cu l t u r e s, a g a r o se si g n i f i ca n t l y e n h a n ce d p r o co l l a g e n co n ve r si o n t o c o l l a g e n i n c u l t u r e s t r e a t e d w i t h I G F I a n d P D G F b y 6 f o l d T G F t r e a t e d st a n d a r d cu l t u r e s w e r e si g n i f i ca n t l y m o r e e f f i ci e n t a t co n ve r t i n g p r o co l l a g e n t o c o l l a g e n t h e n I G F I a n d P D G F st a n d a r d cu l t u r e s b y ~ 3 f o l d

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6 7 F i g u r e 1 9 F i b r o n e ct i n l e ve l s i n t h e m e d i a o f ke r a t o cyt e s i n st a n d a r d a n d a g a r o se c u l t u r e s K e r a t o cy t e s w e r e cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I T G F F G F 2 o r P D G F a n d h a r ve st e d f o r a n a l ysi s o n d a y 2 0 I n st a n d a r d cu l t u r e s, ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n T G F a cc u m u l a t e d ~ 2 0 f o l d m o r e f i b r o n e ct i n i n t h e m e d i a t h a n I G F I a n d F G F 2 cu l t u r e s a n d 5 f o l d m o r e f i b r o n e ct i n i n t h e m e d i a t h a n P D G F cu l t u r e s. H o w e v e r co m p a r e d t o st a n d a r d c u l t u r e a g a r o se h a d n o e f f e ct o n t h e d e p o si t i o n o f f i b r o n e ct i n i n t o t h e m e d i a

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6 8 F i g u r e 2 0 I m m u n o f l u o r e sc e n t s t a i n i n g o f t h e ce l l l a ye r s o f k e r a t o cy t e s cu l t u r e d u n d e r a g a r o s e K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I ( I ) T G F ( T ) F G F 2 ( F ) o r P D G F ( P ) a n d st a i n e d w i t h a n t i b o d i e s t o e i t h e r co l l a g e n ( c) o r f i b r o n e ct i n ( f ) o n d a y 2 0 N u cl e i w e r e st a i n e d w i t h D A P I C o l l a g e n w a s d i st r i b u t e d i n cl u m p s a n d i n l a r g e p a t ch e s w h i l e f i b r o n e c t i n w a s d i st r i b u t e d i n t h i ck a n d t h i n t r a cks.

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6 9 F i g u r e 2 1 E l e ct r o n m i cr o sco p y o f t h e ce l l l a y e r s o f ke r a t o cyt e s cu l t u r e d u n d e r a g a r o se K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I ( I ) T G F ( T ) F G F 2 ( F ) o r P D G F ( P ) a n d f i xe d f o r e l e ct r o n m i cr o sco p y o n d a y 2 0 C o l l a g e n f i b r i l s w e r e a b u n d a n t i n t h e E C M o f t h e I G F I T G F a n d P D G F t r e a t e d cu l t u r e s w h i l e F G F 2 t r e a t e d c u l t u r e s e xh i b i t e d o n l y l i t t l e E C M w i t h f e w co l l a g e n f i b r i l s. I T F P

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7 0 C h a p t e r F o u r E x p a n s i o n o f P r i m a r y C u l t u r e s o f K e r a t o c y t e w i t h R e t e n t i o n o f N a t i v e P h e n o t y p e

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7 1 I n t r o d u c t i o n T h e st r o m a i s t h e t h i cke st l a ye r o f t h e co r n e a a n d co n si st s o f a t r a n sp a r e n t E C M c o m p r i s e d m a i n l y o f p r o t e o g l yca n s a n d f i b r i l l a r co l l a g e n s [ 2 ] T h e E C M i s syn t h e si ze d a n d se cr e t e d b y k e r a t o cyt e s. I n a m a t u r e co r n e a ke r a t o cyt e s a r e q u i e sce n t a n d d i sp e r se d a m o n g t h e st r o m a p o sse ssi n g a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y a n d e l e va t e d l e ve l s o f t w o ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n s: l u m i ca n a n d ke r a t o ca n T h e se c e l l s a l so e xp r e ss cr yst a l l i n s, h i g h l e ve l s o f a l d e h yd e d e h yd r o g e n a se ( A L D H ) a n d t r a n ske t o l a se w h i ch co n t r i b u t e t o t h e t r a n sp a r e n cy o f t h e co r n e a [ 4 1 0 4 1 0 5 ] T h e e xp r e s si o n o f ke r a t o ca n a n d h i g h l e ve l s o f A L D H a r e u n i q u e t o ke r a t o cyt e s a n d t h e y a r e c o n si d e r e d m a r ke r s o f t h e i r n a t i ve p h e n o t yp e T h e st a n d a r d cu l t u r e m e d i u m f o r ke r a t o cyt e s i n cu l t u r e i s D M E M / F 1 2 co n t a i n i n g 5 1 0 % f e t a l b o vi n e se r u m F e t a l b o vi n e se r u m ca u s e s t h e ke r a t o cyt e s p r o l i f e r a t e a n d t o d i f f e r e n t i a t e i n t o f i b r o b l a st s o r m y o f i b r o b l a st s [ 8 1 1 0 6 1 0 7 ] T h e se ce l l s a r e ch a r a ct e r i ze d b y t h e i r sp i n d l e l i ke m o r p h o l o g y, i n cr e a se d r a t e o f p r o l i f e r a t i o n a n d e xp r e s si o n o f f i b r o n e ct i n h ya l u r o n a n a n d a l p h a sm o o t h m u scl e a ct i n a n d d e cr e a s e d e x p r e ssi o n o f ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yc a n s a n d a l d e h yd e d e h yd r o g e n a se ( A L D H ) [ 8 0 8 8 1 0 6 ] I t h a s b e e n su g g e st e d t h a t t h e co r n e a l f i b r o b l a s t s a n d m y o f i b r o b l a st s a r e n o t t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d a n d ca n r e t u r n t o t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e [ 1 0 8 ] C o n si d e r i n g t h e w i d e sp r e a d u se o f c o r n e a l f i b r o b l a st s i n vi si o n r e se a r ch i t w o u l d b e u s e f u l i f t h e r e w a s a si m p l e w a y t o r e st o r e t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e t o t h e se d i f f e r e n t i a t e d c e l l s. S t u d i e s h a v e sh o w n t h a t h u m a n ke r a t o cyt e s ca n

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7 2 r e t a i n t h e i r n a t i ve m o r p h o l o g y a n d ke r a t o ca n e xp r e ssi o n i n t h e p r e se n ce o f F B S w h e n cu l t u r e d o n a n a m n i o t i c m e m b r a n e [ 1 0 9 ] O t h e r st u d i e s h a ve sh o w n t h a t K S syn t h e si s a n d a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y b u t n o t A L D H co n t e n t c o u l d b e r e st o r e d t o b o vi n e co r n e a l f i b r o b l a st s b y sw i t ch i n g t o s e r u m f r e e m e d i u m [ 1 1 0 ] A d d i t i o n a l l y, ke r a t o cyt e s i so l a t e d f r o m h u m a n co r n e a s, c u l t u r e d i n a sp e ci a l st e m ce l l m e d i u m a n d se l e ct e d f o r a st e m ce l l m a r k e r p r o t e i n b e c o m e f i b r o b l a st i c, b u t ke r a t a n s u l f a t e ke r a t o c a n a n d A L D H e xp r e ss i o n co u l d b e r e st o r e d i n t h e se ce l l s b y su b se q u e n t cu l t u r e i n m e d i u m c o n t a i n i n g F G F 2 a n d I T S ( I n su l i n T r a n sf e r r i n a n d S e l e n i u m ) [ 1 1 1 ] I n t h i s st u d y, w e i n ve st i g a t e d t h e e f f e ct o f m e d i a co n t a i n i n g e i t h e r i n su l i n I T S o r F G F 2 a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n o n t h e p r o l i f e r a t i o n a n d r e st o r a t i o n o f ke r a t o ca n b y b o vi n e a n d h u m a n ke r a t o cyt e s. W e e xp e ct F G F 2 t o si g n i f i ca n t l y st i m u l a t e p r o l i f e r a t i o n a n d I T S a n d i n su l i n t o s t i m u l a t e ke r a t o ca n p r o d u ct i o n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s T h e m a t e r i a l s a n d m e t h o d s u se d a r e t h e sa m e a s i n C h a p t e r 2 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n W e a t t e m p t e d t o g r o w a n d p a ss p r i m a r y b o vi n e ke r a t o cyt e s b y c u l t u r e i n m e d i u m co n t a i n i n g e i t h e r i n s u l i n I T S F G F 2 o r F G F 2 w i t h i n su l i n o r I T S W e f o u n d t h a t k e r a t o cyt e s c u l t u r e d i n i n su l i n a n d I T S co u l d n o t b e r e m o ve d f r o m t h e cu l t u r e p l a t e b y st a n d a r d t r yp si n d i g e st i o n K e r a t o cy t e s cu l t u r e d i n F G F 2 p r o l i f e r a t e d a n d w e r e e f f i ci e n t l y r e m o ve d a n d p a sse d b u t p r o l i f e r a t i o n

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7 3 d i sco n t i n u e d a f t e r t h e f i r st o r se c o n d p a ssa g e F G F 2 t r e a t e d k e r a t o cyt e s p o sse sse d sp i n d l e d sh a p e m o r p h o l o g y. K e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n F G F 2 co m b i n e d w i t h i n su l i n o r I T S h o w e v e r co u l d b e r e p e a t e d l y p a sse d u si n g t r yp si n d i g e st i o n a n d r e p l a t e d T h e se c e l l s co n t i n u e d t o p r o l i f e r a t e a n d r e t a i n e d t h e i r d e n d r i t i c m o r p h o l o g y w h e n cu l t u r e d i n i n su l i n o r I T S T h e r e f o r e w e cu l t u r e d b o vi n e ke r a t o cyt e s i n m e d i a c o n t a i n i n g F G F 2 co m b i n e d w i t h I T S a n d p a sse d t h e m 4 t i m e s a t l o w d e n si t y. K e r a t o cyt e s w e r e t h e n e v a l u a t e d f o r t h e i r a b i l i t y t o p r o l i f e r a t e a n d p r o d u ce ke r a t o ca n b y su b se q u e n t c u l t u r e f o r 6 d a ys i n m e d i a i n su l i n I T S o r F G F 2 a l o n e o r i n co m b i n a t i o n T h e r e su l t s sh o w e d t h a t c o m p a r e d t o c o n t r o l t h e D N A co n t e n t o f t h e ke r a t o cyt e s cu l t u r e d i n F G F 2 a l o n e i n c r e a se d 2 4 % a n d t h e D N A co n t e n t o f t h e cu l t u r e s i n F G F 2 co m b i n e d w i t h e i t h e r i n s u l i n o r I T S i n cr e a se d 1 6 f o l d ( F i g 2 2 A ) M e d i a sa m p l e s w e r e d i g e st e d w i t h e n d o g a l a ct o si d a se t o r e m o ve t h e K S ch a i n s f r o m K S P G s. T h e n d i g e st e d m e d i a w a s D N A n o r m a l i ze d a n d l e ve l s o f ke r a t o c a n co r e p r o t e i n w e r e m e a su r e d b y W e st e r n b l o t u si n g a n a n t i b o d y t o ke r a t o ca n ( F i g 2 2 B ) T h e r e su l t s sh o w e d t h a t b o t h t h e co n t r o l a n d t h e F G F 2 t r e a t e d c u l t u r e s e xp r e ss e d l o w l e ve l s o f ke r a t o ca n w h i l e cu l t u r e s i n F G F 2 p l u s i n su l i n o r p l u s I T S e xp r e sse d h i g h e r l e v e l s b u t cu l t u r e s i n i n s u l i n o r i n I T S a l o n e e xp r e sse d t h e h i g h e st l e ve l s. T h e k e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n i n su l i n o r i n I T S a l so r e a cq u i r e d a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y ( d a t a n o t s h o w n ) T h i s s u g g e st s t h a t ke r a t o cyt e s m a i n t a i n ke r a t o ca n e x p r e ssi o n a f t e r g r o w t h a n d p a ssa g e i n m e d i a co n t a i n i n g F G F 2 p l u s I T S A d d i t i o n a l l y, k e r a t o cyt e s su b se q u e n t l y cu l t u r e d i n

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7 4 i n su l i n o r I T S f u r t h e r e n h a n ce s k e r a t o c a n e xp r e ssi o n a s w e l l a s t h e i r d e n d r i t i c m o r p h o l o g y. W e n e xt d e t e r m i n e d i f ke r a t o ca n c o u l d b e r e st o r e d t o c u l t u r e d b o vi n e ke r a t o cyt e s p a sse d i n f e t a l b o vi n e se r u m b y s u b se q u e n t cu l t u r e i n i n su l i n a n d I T S a l o n e o r i n co m b i n a t i o n w i t h F G F 2 T h e r e f o r e w e g r e w ke r a t o cyt e s i n m e d i a co n t a i n i n g 2 5 % F B S a n d t h e y p o sse ss e d m yo f i b r o b l a st l i ke m o r p h o l o g y. T h e ke r a t o cyt e s w e r e p a sse d 6 t i m e s, a n d p l a t e d t h e m a t l o w d e n si t y. W e t h e n t e st e d t h e i r a b i l i t y t o p r o l i f e r a t e ( F i g 2 3 A ) a n d p r o d u ce ke r a t o ca n ( F i g 2 3 B ) b y su b se q u e n t cu l t u r e i n m e d i a w i t h a n d w i t h o u t g r o w t h f a ct o r s f o r 6 d a ys. C o m p a r e d t o co n t r o l t h e D N A co n t e n t o f t h e cu l t u r e s t r e a t e d w i t h F G F 2 a l o n e i n cr e a se d 2 2 % T h e D N A co n t e n t o f t h e c u l t u r e s t r e a t e d w i t h F G F 2 co m b i n e d w i t h i n su l i n i n cr e a s e d 1 4 f o l d w h i l e t h e D N A co n t e n t o f cu l t u r e s t r e a t e d w i t h F G F 2 co m b i n e d w i t h I T S i n cr e a s e d 5 f o l d L e ve l s o f ke r a t o ca n w e r e e va l u a t e d a s p r e vi o u sl y d e scr i b e d W e f o u n d t h a t t h e c o n t r o l a n d t h e F G F 2 t r e a t e d cu l t u r e s co n t a i n e d u n d e t e c t a b l e l e ve l s o f ke r a t o ca n C u l t u r e s t r e a t e d w i t h i n su l i n a l o n e I T S a l o n e a n d F G F 2 co m b i n e d w i t h I T S co n t a i n e d r e a d i l y d e t e ct a b l e l e ve l s o f ke r a t o ca n T h e k e r a t o cyt e s cu l t u r e d i n i n su l i n a l o n e a n d I T S a l o n e r e a cq u i r e d a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y ( d a t a n o t s h o w n ) T h i s d a t a sh o w e d t h a t ke r a t o ca n syn t h e si s a n d a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y ca n b e r e st o r e d t o k e r a t o cy t e s p a sse d i n F B S b y su b se q u e n t cu l t u r e i n i n su l i n o r I T S W e n e xt i so l a t e d h u m a n ke r a t o cyt e s f r o m h u m a n co r n e a s a n d cu l t u r e d t h e m i n m e d i u m c o n t a i n i n g F G F 2 a n d I T S W h e n t h e h u m a n ke r a t o cy t e s a r e p l a t e d a n d a l l o w e d t o a t t a ch t h e y p o sse ss a d e n d r i t i c m o r p h o l o g y. U n l i ke

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7 5 b o vi n e ke r a t o cyt e s, t h e h u m a n k e r a t o cyt e s b e co m e sp i n d l e d sh a p e d a f t e r b e i n g cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g F G F 2 a n d I T S a n d p a sse d o n l y o n c e T h u s, w h i l e w e w e r e a b l e t o g r o w a n d p a ss t h e se h u m a n ke r a t o cy t e s i n t h i s d e f i n e d cu l t u r e m e d i u m w e w e r e u n a b l e t o d e t e ct ke r a t o ca n b y w e st e r n b l o t a h a l l m a r k o f n a t i ve ke r a t o cyt e s. T o a ssu r e t h a t o u r a n t i b o d i e s t o ke r a t o c a n r e a ct e d w i t h h u m a n ke r a t o ca n i f p r e se n t w e e xt r a ct e d ke r a t o c a n f r o m h u m a n co r n e a s a n d t e st e d t h e a n t i b o d i e s b y w e st e r n b l o t W e f o u n d t h a t b o t h t h e a n t i b o d y t o b o vi n e k e r a t o ca n a n d t h e a n t i b o d y w e p u r ch a se d t o h u m a n ke r a t o ca n r e a ct e d w i t h h u m a n k e r a t o ca n c o r e p r o t e i n T h e r e f o r e t h e f a i l u r e t o d e t e ct ke r a t o ca n i n m e d i a f r o m c u l t u r e d h u m a n ke r a t o cy t e s i s n o t d u e t o f a u l t y a n t i b o d i e s. T h e h u m a n co r n e a s w e r e f r o m 1 6 1 7 a n d 4 2 y e a r o l d d o n o r s, w h i l e t h e b o vi n e co r n e a s w e r e t a ke n f r o m 1 2 ye a r ( s) o l d ca t t l e T h u s, i t m a y b e n e c e ssa r y t o i so l a t e k e r a t o cyt e s f r o m c o r n e a s o f yo u n g e r h u m a n d o n o r s i n o r d e r t o s u cce ssf u l l y cu l t u r e h u m a n ke r a t o cyt e s t h a t m a i n t a i n t h e i r i n vi v o p h e n o t yp e

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7 6 F i g u r e 2 2 C e l l g r o w t h a n d ke r a t o ca n e x p r e ss i o n b y cu l t u r e s d e r i v e d f r o m p a sse d ke r a t o cyt e s. P r i m a r y c u l t u r e s o f b o vi n e ke r a t o cyt e s w e r e g r o w n a n d p a sse d 4 t i m e s i n m e d i a co n t a i n i n g F G F 2 p l u s I T S T h e ke r a t o cyt e s w e r e t h e n p l a t e d a t l o w d e n si t y a n d cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g e i t h e r F G F 2 i n su l i n I T S i n su l i n + F G F 2 o r I T S + F G F 2 f o r 6 d a ys. A : D N A co n t e n t o f ce l l l a ye r B : W e st e r n b l o t o f e n d o g a l a ct o si d a se d i g e st s o f m e d i a u si n g a n a n t i b o d y t o ke r a t o ca n co r e p r o t e i n

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7 7 F i g u r e 2 3 C e l l g r o w t h a n d ke r a t o ca n e xp r e s si o n b y cu l t u r e s d e r i v e d f r o m p a sse d co r n e a l f i b r o b l a st s. P r i m a r y c u l t u r e s o f b o vi n e k e r a t o cyt e s w e r e g r o w n a n d p a sse d 6 t i m e s i n m e d i a co n t a i n i n g 2 5 % F B S T h e co r n e a l f i b r o b l a st s w e r e t h e n p l a t e d a t l o w d e n si t y i n m e d i a co n t a i n i n g e i t h e r F G F 2 i n su l i n i n su l i n + F G F 2 I T S o r I T S + F G F 2 f o r 6 d a ys. A : D N A co n t e n t o f ce l l l a ye r B : W e st e r n b l o t o f e n d o g a l a c t o s i d a se d i g e st s o f m e d i a u si n g a n a n t i b o d y t o ke r a t o ca n co r e p r o t e i n

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7 8 C h a p t e r F i v e C o n c l u s i o n s a n d F u t u r e D i r e c t i o n s

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7 9 W h e n t h e co r n e a l st r o m a i s w o u n d e d t h e k e r a t o cyt e s b e co m e a ct i va t e d b y sp e ci f i c g r o w t h f a ct o r s t o p r o l i f e r a t e f o r m r e g i o n s o f h y p e r ce l l u l a r i t y ( d e n se l y p a cke d ce l l s w i t h l i t t l e e xt r a ce l l u l a r m a t r i x) a n d t h e n g o o n t o st r a t i f y b y p r o d u ci n g a n e xt e n si ve co l l a g e n o u s m a t r i x. T h e se g r o w t h f a ct o r s a r e m a d e b y m a cr o p h a g e s, l ym p h o cyt e s, a n d k e r a t o cyt e s t h e m se l ve s. A d d i t i o n a l l y, g r o w t h f a ct o r s h a v e a l so b e e n f o u n d t o b e p r e se n t i n t e a r f i l m a q u e o u s f l u i d a n d e p i t h e l i u m l a ye r o f t h e co r n e a S t u d i e s h a ve sh o w n t h a t T G F i s t h e ke y g r o w t h f a ct o r t h a t a i d s i n w o u n d h e a l i n g a n d ca u se s t h e f o r m a t i o n o f a sca r W e h a ve f o u n d t h a t o t h e r g r o w t h f a ct o r s su ch a s, I G F I F G F 2 a n d P D G F a r e a l so i m p o r t a n t d u r i n g t h e c o r n e a l w o u n d h e a l i n g p r o ce ss i n vi t r o W e g r e w ke r a t o cyt e s i n st a n d a r d cu l t u r e a n d i n st a n d a r d cu l t u r e w i t h a n a g a r o se o ve r l a y. T h e a g a r o se o ve r l a y e n h a n ce d t h e co n ve r si o n o f p r o co l l a g e n t o co l l a g e n ( F i g 2 4 ) t h e r e b y i n c r e a si n g t h e d e p o si t i o n o f c o l l a g e n f i b r i l s w i t h t h e ce l l l a ye r W e p o st u l a t e d t h a t t h e a g a r o se o v e r l a y w a s a ct i n g a s a m o l e cu l a r si e ve T h e r e i s n o a g a r o se p r e se n t i n vi vo h o w e ve r t h e b a se m e n t m e m b r a n e t h a t i s m a d e b y t h e co r n e a l e p i t h e l i u m i s si m i l a r i n st r u ct u r e a n d i s l i ke l y t o h a ve t h e sa m e f u n ct i o n a s t h e a g a r o se o ve r l a y i n vi t r o

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8 0 K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I T G F F G F 2 a n d P D G F a n d co m p a r e d t h e i r a b i l i t y t o st i m u l a t e ce l l p r o l i f e r a t i o n a n d e xt r a ce l l u l a r m a t r i x ( E C M ) syn t h e si s. D i st r i b u t i o n a n d o r i e n t a t i o n o f s p e ci f i c E C M p r o t e i n s syn t h e si ze d b y k e r a t o cy t e s cu l t u r e d i n m e d i a co n t a i n i n g I G F I T G F F G F 2 a n d P D G F w a s e v a l u a t e d b y o ve r l a yi n g ce l l s w i t h a g a r o s e W e f o u n d t h a t F G F 2 st i m u l a t e d t h e h i g h e st l e ve l o f p r o l i f e r a t i o n b u t d i d n o t s t i m u l a t e c o l l a g e n syn t h e si s. F G F 2 t r e a t e d ke r a t o cyt e s w e r e i n cl o se ce l l co n t a ct T h e r e f o r e w e sp e cu l a t e d t h a t F G F 2 si g n a l i n g i s a sso ci a t e d w i t h t h e h yp e r ce l l u l a r p h a se o f co r n e a l w o u n d h e a l i n g I G F I T G F a n d P D G F a l l st i m u l a t e d p r o l i f e r a t i o n a n d c o l l a g e n syn t h e si s. T G F a l so st i m u l a t e d t h e h i g h e st l e ve l s o f E D A f i b r o n e ct i n co l l a g e n t yp e I I I h y a l u r o n a n a n d b i g l yca n m a r k e r s o f t h e a b n o r m a l f i b r o t i c E C M I G F I a n d P D G F cu l t u r e s m o st l y st i m u l a t e d co l l a g e n t yp e I a n d ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yc a n s. T G F I G F I a n d P D G F a r e l i ke l y t o b e i n vo l ve d i n t h e F i g u r e 2 4 A g a r o se o ve r l a y e n h a n ce s t h e co n ve r si o n o f p r o co l l a g e n t o co l l a g e n

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8 1 r e m o d e l i n g a n d s t r a t i f i ca t i o n p h a s e o f co r n e a l w o u n d h e a l i n g P r e su m a b l y, I G F I a n d P D G F a r e r e s p o n si b l e f o r t h e r e st o r a t i o n o f a n o r m a l co l l a g e n o u s E C M w h e r e a s T G F i s i n vo l ve d i n t h e f o r m a t i o n o f a co l l a g e n o u s sca r r e d E C M T h i s se q u e n t i a l a c t i o n o f g r o w t h f a ct o r s i s d e p i ct e d i n ( F i g 2 5 ) F i g u r e 2 5 P r o p o se d se q u e n t i a l a ct i o n o f g r o w t h f a ct o r s t o p r o d u ce t h e p h a s e s o f w o u n d h e a l i n g T a ke n t o g e t h e r t h e d a t a i n t h i s d i sse r t a t i o n s h o u l d h e l p t o e xp l a i n t h e r o l e o f g r o w t h f a ct o r s i n t h e c o r n e a l w o u n d h e a l i n g p r o ce ss. W e h a ve d i sco v e r e d t h a t I G F I T G F F G F 2 a n d P D G F a r e l i ke l y r e s p o n si b l e f o r st i m u l a t i n g t h e d i f f e r e n t p h a se s o f co r n e a l w o u n d h e a l i n g i n v i vo b a se d o n ke r a t o cyt e

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8 2 m o r p h o l o g y a n d e xt r a c e l l u l a r m a t r i x p r o d u ct i o n T h e r e f o r e w e ca n p o ssi b l y d i r e ct ke r a t o cyt e s t o m a ke a n o r m a l co l l a g e n o u s E C M u p o n w o u n d i n g b y m a n i p u l a t i n g t h e l e ve l s o f g r o w t h f a ct o r s d u r i n g sp e ci f i c p h a s e s o f co r n e a l w o u n d r e p a i r A s a r e su l t w e ca n r e d u ce co r n e a l o p a ci t y ca u se d b y sc a r r i n g A d d i t i o n a l l y, t h e se g r o w t h f a ct o r s c a n b e u se d t o st i m u l a t e ke r a t o cyt e s t o p r o d u ce c o l l a g e n i n co l l a g e n d e p l e t e d co r n e a s o f ke r a t o co n u s p a t i e n t s. T h e r e f o r e t h i s d i sse r t a t i o n i s cl i n i ca l l y r e l e va n t a n d a si g n i f i ca n t a d d i t i o n t o t h e sci e n t i f i c l i t e r a t u r e I t s e r ve s t o i d e n t i f y n o ve l t a r g e t s f o r t r e a t m e n t o f co r n e a l sca r r i n g a n d ke r a t o co n u s. T o f u r t h e r t h i s st u d y, w e p l a n t o e va l u a t e t h e l e ve l s o f t h e s e g r o w t h f a ct o r s i n e a ch p h a s e o f t h e co r n e a l w o u n d h e a l i n g p r o ce ss i n vi vo T h e n i n h i b i t se l e ct g r o w t h f a ct o r s o r u se k n o cko u t a n i m a l s t o d e t e r m i n e t h e e f f e ct o n t h e m o r p h o l o g y o f ke r a t o cyt e s a n d t h e E C M co m p o n e n t s. A d d i t i o n a l l y, w e p l a n t o u se t h e n e w l y e st a b l i sh e d a g a r o se ce l l cu l t u r e syst e m t o f u r t h e r vi su a l i ze t h e co r n e a l st r o m a E C M i n vi t r o M o r e sp e ci f i ca l l y, t h e a g a r o se ce l l c u l t u r e sys t e m w i l l b e u se d t o f u r t h e r st u d y t h e i n t e r a ct i o n s b e t w e e n ke r a t o cyt e s a n d t h e i r su r r o u n d i n g e xt r a ce l l u l a r m a t r i x a s w e l l a s t o d e t e r m i n e t h e e xp r e ssi o n o f g r o w t h f a ct o r r e ce p t o r s d u r i n g e a c h p h a se o f co r n e a l w o u n d h e a l i n g

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8 3 R e f e r e n c e s 1 C o n g d o n N e t a l C a u se s a n d p r e v a l e n ce o f vi su a l i m p a i r m e n t a m o n g a d u l t s i n t h e U n i t e d S t a t e s A r ch O p h t h a l m o l 2 0 0 4 1 2 2 ( 4 ) : p 4 7 7 8 5 2 L i n se n m a ye r T F e t a l D e ve l o p m e n t a n d r o l e s o f co l l a g e n o u s m a t r i ce s i n t h e e m b r yo n i c a vi a n co r n e a P r o g R e t i n E y e R e s, 1 9 9 8 1 7 ( 2 ) : p 2 3 1 6 5 3 B i r k, D E T yp e V co l l a g e n : h e t e r o t yp i c t yp e I / V co l l a g e n i n t e r a ct i o n s i n t h e r e g u l a t i o n o f f i b r i l a sse m b l y. M i c r o n 2 0 0 1 3 2 ( 3 ) : p 2 2 3 3 7 4 H a sse l l J. R e t a l P r o t e o g l yca n ch a n g e s d u r i n g r e st o r a t i o n o f t r a n sp a r e n cy i n c o r n e a l sc a r s. A r ch B i o ch e m B i o p h ys, 1 9 8 3 2 2 2 ( 2 ) : p 3 6 2 9 5 B i r k, D E e t a l C o l l a g e n f i b r i l l o g e n e si s i n vi t r o : i n t e r a ct i o n o f t y p e s I a n d V co l l a g e n r e g u l a t e s f i b r i l d i a m e t e r J C e l l S ci 1 9 9 0 9 5 ( P t 4 ) : p 6 4 9 5 7 6 R a d a J. A P K C o r n u e t a n d J. R H a sse l l R e g u l a t i o n o f co r n e a l co l l a g e n f i b r i l l o g e n e si s i n vi t r o b y c o r n e a l p r o t e o g l yca n ( l u m i ca n a n d d e co r i n ) c o r e p r o t e i n s. E xp E ye R e s, 1 9 9 3 5 6 ( 6 ) : p 6 3 5 4 8 7 Je st e r J. V e t a l C o r n e a l ke r a t o cyt e s : i n si t u a n d i n vi t r o o r g a n i za t i o n o f cyt o ske l e t a l co n t r a ct i l e p r o t e i n s. I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 1 9 9 4 3 5 ( 2 ) : p 7 3 0 4 3 8 M u l l e r L J L P e l s, a n d G F V r e n se n N o ve l a sp e ct s o f t h e u l t r a st r u ct u r a l o r g a n i za t i o n o f h u m a n c o r n e a l k e r a t o cyt e s. I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 1 9 9 5 3 6 ( 1 3 ) : p 2 5 5 7 6 7 9 Ja l b e r t I a n d F S t a p l e t o n T h e co r n e a l st r o m a d u r i n g c o n t a ct l e n s w e a r C o n t L e n s A n t e r i o r E ye 2 0 0 5 2 8 ( 1 ) : p 3 1 2 1 0 R i ca r d B l u m S a n d F R u g g i e r o T h e co l l a g e n su p e r f a m i l y: f r o m t h e e xt r a ce l l u l a r m a t r i x t o t h e ce l l m e m b r a n e P a t h o l B i o l ( P a r i s) 2 0 0 5 5 3 ( 7 ) : p 4 3 0 4 2 1 1 C a n t y, E G a n d K E K a d l e r P r o co l l a g e n t r a f f i cki n g p r o ce ssi n g a n d f i b r i l l o g e n e si s. J C e l l S ci 2 0 0 5 1 1 8 ( P t 7 ) : p 1 3 4 1 5 3 1 2 M u sse l m a n n K e t a l S t i m u l a t i o n o f co l l a g e n syn t h e si s b y i n s u l i n a n d p r o t e o g l yc a n a ccu m u l a t i o n b y a sco r b a t e i n b o vi n e ke r a t o cy t e s i n vi t r o I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 2 0 0 6 4 7 ( 1 2 ) : p 5 2 6 0 6 1 3 M i ch e l a cci Y M C o l l a g e n s a n d p r o t e o g l yca n s o f t h e co r n e a l e x t r a ce l l u l a r m a t r i x. B r a z J M e d B i o l R e s, 2 0 0 3 3 6 ( 8 ) : p 1 0 3 7 4 6 1 4 I o zzo R V a n d A D M u r d o c h P r o t e o g l yca n s o f t h e e xt r a ce l l u l a r e n vi r o n m e n t : cl u e s f r o m t h e g e n e a n d p r o t e i n si d e o f f e r n o ve l p e r sp e ct i ve s i n m o l e cu l a r d i ve r si t y a n d f u n ct i o n F a se b J, 1 9 9 6 1 0 ( 5 ) : p 5 9 8 6 1 4 1 5 S ch a e f e r L a n d R M S ch a e f e r P r o t e o g l yca n s: f r o m st r u ct u r a l co m p o u n d s t o si g n a l i n g m o l e c u l e s. C e l l T i ssu e R e s, 2 0 0 9 1 6 C h a kr a va r t i S e t a l L u m i ca n r e g u l a t e s co l l a g e n f i b r i l a ss e m b l y: ski n f r a g i l i t y a n d c o r n e a l o p a ci t y i n t h e a b se n ce o f l u m i ca n J C e l l B i o l 1 9 9 8 1 4 1 ( 5 ) : p 1 2 7 7 8 6

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8 4 1 7 H su C a n d J. C h a n g C l i n i ca l i m p l i ca t i o n s o f g r o w t h f a ct o r s i n f l e xo r t e n d o n w o u n d h e a l i n g J H a n d S u r g A m 2 0 0 4 2 9 ( 4 ) : p 5 5 1 6 3 1 8 K l e n kl e r B a n d H S h e a r d o w n G r o w t h f a ct o r s i n t h e a n t e r i o r se g m e n t : r o l e i n t i ssu e m a i n t e n a n ce w o u n d h e a l i n g a n d o cu l a r p a t h o l o g y E xp E ye R e s, 2 0 0 4 7 9 ( 5 ) : p 6 7 7 8 8 1 9 A l va r e z, R H H M K a n t a r j i a n a n d J. E C o r t e s, B i o l o g y o f p l a t e l e t d e r i ve d g r o w t h f a ct o r a n d i t s i n vo l ve m e n t i n d i se a se M a yo C l i n P r o c, 2 0 0 6 8 1 ( 9 ) : p 1 2 4 1 5 7 2 0 S o n g Q H e t a l T G F b e t a 1 r e g u l a t e s T G F b e t a 1 a n d F G F 2 m R N A e xp r e ssi o n d u r i n g f i b r o b l a st w o u n d h e a l i n g M o l P a t h o l 2 0 0 2 5 5 ( 3 ) : p 1 6 4 7 6 2 1 C a m p o s, A C A K G r o t h a n d A B B r a n co A sse ssm e n t a n d n u t r i t i o n a l a sp e ct s o f w o u n d h e a l i n g C u r r O p i n C l i n N u t r M e t a b C a r e 2 0 0 8 1 1 ( 3 ) : p 2 8 1 8 2 2 D i e g e l m a n n R F a n d M C E va n s W o u n d h e a l i n g : a n o ve r vi e w o f a cu t e f i b r o t i c a n d d e l a ye d h e a l i n g F r o n t B i o sci 2 0 0 4 9 : p 2 8 3 9 2 3 M o l l o y, T Y W a n g a n d G M u r r e l l T h e r o l e s o f g r o w t h f a ct o r s i n t e n d o n a n d l i g a m e n t h e a l i n g S p o r t s M e d 2 0 0 3 3 3 ( 5 ) : p 3 8 1 9 4 2 4 F i n i M E a n d B M S t r a m e r H o w t h e co r n e a h e a l s: co r n e a sp e ci f i c r e p a i r m e ch a n i sm s a f f e ct i n g s u r g i ca l o u t co m e s. C o r n e a 2 0 0 5 2 4 ( 8 S u p p l ) : p S 2 S 1 1 2 5 C l a r k, R A B a si cs o f cu t a n e o u s w o u n d r e p a i r J D e r m a t o l S u r g O n c o l 1 9 9 3 1 9 ( 8 ) : p 6 9 3 7 0 6 2 6 B r i sse t t e S t o r ku s C S e t a l I d e n t i f i ca t i o n o f a n o ve l m a c r o p h a g e p o p u l a t i o n i n t h e n o r m a l m o u se c o r n e a l st r o m a I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 2 0 0 2 4 3 ( 7 ) : p 2 2 6 4 7 1 2 7 C h i n n e r y, H R e t a l T u r n o ve r o f b o n e m a r r o w d e r i ve d c e l l s i n t h e i r r a d i a t e d m o u s e co r n e a I m m u n o l o g y, 2 0 0 8 1 2 5 ( 4 ) : p 5 4 1 8 2 8 H o n g J. W e t a l P r o i n f l a m m a t o r y ch e m o ki n e i n d u ct i o n i n ke r a t o cyt e s a n d i n f l a m m a t o r y ce l l i n f i l t r a t i o n i n t o t h e co r n e a I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 2 0 0 1 4 2 ( 1 2 ) : p 2 7 9 5 8 0 3 2 9 S t a p l e t o n W M e t a l T o p i ca l i n t e r l e u ki n 1 r e ce p t o r a n t a g o n i st i n h i b i t s i n f l a m m a t o r y ce l l i n f i l t r a t i o n i n t o t h e co r n e a E xp E ye R e s, 2 0 0 8 8 6 ( 5 ) : p 7 5 3 7 3 0 L i m M e t a l G r o w t h f a c t o r cyt o ki n e a n d p r o t e a se i n t e r a ct i o n s d u r i n g co r n e a l w o u n d h e a l i n g O cu l S u r f 2 0 0 3 1 ( 2 ) : p 5 3 6 5 3 1 W i l so n S E M N e t t o a n d R A m b r o si o Jr C o r n e a l ce l l s: ch a t t y i n d e ve l o p m e n t h o m e o st a si s, w o u n d h e a l i n g a n d d i se a se A m J O p h t h a l m o l 2 0 0 3 1 3 6 ( 3 ) : p 5 3 0 6 3 2 N e t t o M V e t a l W o u n d h e a l i n g i n t h e c o r n e a : a r e vi e w o f r e f r a ct i ve su r g e r y c o m p l i ca t i o n s a n d n e w p r o s p e ct s f o r t h e r a p y. C o r n e a 2 0 0 5 2 4 ( 5 ) : p 5 0 9 2 2 3 3 I w a n a m i H e t a l E xp r e ssi o n o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P ) 1 2 b y m yo f i b r o b l a st s d u r i n g a l ka l i b u r n e d co r n e a l w o u n d h e a l i n g C u r r E ye R e s, 2 0 0 9 3 4 ( 3 ) : p 2 0 7 1 4

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8 5 3 4 Jo o C K a n d Y S e o m u n M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a se ( M M P ) a n d T G F b e t a 1 st i m u l a t e d ce l l m i g r a t i o n i n ski n a n d c o r n e a w o u n d h e a l i n g C e l l A d h M i g r 2 0 0 8 2 ( 4 ) : p 2 5 2 3 3 5 M u sse l m a n n K e t a l M a i n t e n a n ce o f t h e ke r a t o cyt e p h e n o t y p e d u r i n g ce l l p r o l i f e r a t i o n st i m u l a t e d b y i n su l i n J B i o l C h e m 2 0 0 5 2 8 0 ( 3 8 ) : p 3 2 6 3 4 9 3 6 Je st e r J. V e t a l I n d u ct i o n o f a l p h a sm o o t h m u scl e a ct i n e x p r e ssi o n a n d m yo f i b r o b l a st t r a n sf o r m a t i o n i n c u l t u r e d co r n e a l ke r a t o cyt e s. C o r n e a 1 9 9 6 1 5 ( 5 ) : p 5 0 5 1 6 3 7 F u n d e r b u r g h J. L M M M a n n a n d M L F u n d e r b u r g h K e r a t o cyt e p h e n o t yp e m e d i a t e s p r o t e o g l yca n st r u ct u r e : a r o l e f o r f i b r o b l a st s i n co r n e a l f i b r o si s. J B i o l C h e m 2 0 0 3 2 7 8 ( 4 6 ) : p 4 5 6 2 9 3 7 3 8 M u sse l m a n n K e t a l I G F I I i s p r e se n t i n b o vi n e co r n e a l st r o m a a n d a ct i va t e s ke r a t o cyt e s t o p r o l i f e r a t e i n vi t r o E xp E ye R e s, 2 0 0 8 8 6 ( 3 ) : p 5 0 6 1 1 3 9 K a n e B P e t a l I G F I I a n d co l l a g e n e xp r e ss i o n b y ke r a t o cyt e s d u r i n g p o st n a t a l d e ve l o p m e n t E xp E ye R e s, 2 0 0 9 8 9 ( 2 ) : p 2 1 8 2 3 4 0 R e i n D B e t a l T h e e c o n o m i c b u r d e n o f m a j o r a d u l t vi su a l d i so r d e r s i n t h e U n i t e d S t a t e s A r ch O p h t h a l m o l 2 0 0 6 1 2 4 ( 1 2 ) : p 1 7 5 4 6 0 4 1 K l i n t w o r t h G K T h e co r n e a st r u c t u r e a n d m a cr o m o l e c u l e s i n h e a l t h a n d d i se a se A r e vi e w A m J P a t h o l 1 9 7 7 8 9 ( 3 ) : p 7 1 8 8 0 8 4 2 K a l u a K e t a l C a u s e s o f b l i n d n e ss a m o n g c h i l d r e n i d e n t i f i e d t h r o u g h vi l l a g e ke y i n f o r m a n t s i n M a l a w i C a n J O p h t h a l m o l 2 0 0 8 4 3 ( 4 ) : p 4 2 5 7 4 3 G r u n a u e r K l o e ve ko r n C a n d G I D u n cke r [ K e r a t o co n u s: e p i d e m i o l o g y, r i sk f a ct o r s a n d d i a g n o si s] K l i n M o n a t sb l A u g e n h e i l kd 2 0 0 6 2 2 3 ( 6 ) : p 4 9 3 5 0 2 4 4 S h e r w i n T a n d N H B r o o ke s, M o r p h o l o g i ca l ch a n g e s i n k e r a t o c o n u s: p a t h o l o g y o r p a t h o g e n e si s. C l i n E xp e r i m e n t O p h t h a l m o l 2 0 0 4 3 2 ( 2 ) : p 2 1 1 7 4 5 G i l b e r t C a n d A F o st e r B l i n d n e ss i n ch i l d r e n : co n t r o l p r i o r i t i e s a n d r e se a r ch o p p o r t u n i t i e s. B r J O p h t h a l m o l 2 0 0 1 8 5 ( 9 ) : p 1 0 2 5 7 4 6 N e g r e l A D a n d B T h yl e f o r s, T h e g l o b a l i m p a ct o f e ye i n j u r i e s. O p h t h a l m i c E p i d e m i o l 1 9 9 8 5 ( 3 ) : p 1 4 3 6 9 4 7 W e st M a ys, J. A a n d D J. D w i ve d i T h e ke r a t o cyt e : co r n e a l st r o m a l ce l l w i t h va r i a b l e r e p a i r p h e n o t yp e s. I n t J B i o ch e m C e l l B i o l 2 0 0 6 3 8 ( 1 0 ) : p 1 6 2 5 3 1 4 8 I sh i za ki M e t a l D yn a m i cs o f t h e e xp r e ssi o n o f cyt o ske l e t o n co m p o n e n t s a n d a d h e r e n s m o l e cu l e s b y f i b r o b l a st i c ce l l s i n a l ka l i b u r n e d a n d l a ce r a t e d co r n e a s. E xp E ye R e s, 1 9 9 4 5 9 ( 5 ) : p 5 3 7 4 9 4 9 C h a kr a va r t i S e t a l C o r n e a l o p a ci t y i n l u m i ca n n u l l m i ce : d e f e ct s i n co l l a g e n f i b r i l st r u ct u r e a n d p a cki n g i n t h e p o s t e r i o r st r o m a I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 2 0 0 0 4 1 ( 1 1 ) : p 3 3 6 5 7 3 5 0 B e r r yh i l l B L M P B e a l e s a n d J. R H a sse l l P r o d u ct i o n o f p r o st a g l a n d i n D syn t h a se a s a ke r a t a n su l f a t e p r o t e o g l yca n b y cu l t u r e d b o vi n e ke r a t o cyt e s. I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 2 0 0 1 4 2 ( 6 ) : p 1 2 0 1 7

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8 6 5 1 T u o m i n e n I S e t a l H u m a n t e a r f l u i d P D G F B B T N F a l p h a a n d T G F b e t a 1 vs co r n e a l h a ze a n d r e g e n e r a t i o n o f c o r n e a l e p i t h e l i u m a n d su b b a sa l n e r ve p l e x u s a f t e r P R K E xp E ye R e s, 2 0 0 1 7 2 ( 6 ) : p 6 3 1 4 1 5 2 Z h o u L e t a l P r o t e o m i c a n a l ysi s o f r a b b i t t e a r f l u i d : D e f e n si n l e ve l s a f t e r a n e xp e r i m e n t a l c o r n e a l w o u n d a r e co r r e l a t e d t o w o u n d cl o s u r e P r o t e o m i cs, 2 0 0 7 7 ( 1 7 ) : p 3 1 9 4 2 0 6 5 3 B r o w n C T e t a l C h a r a ct e r i za t i o n o f p r o t e o g l y ca n s syn t h e si ze d b y cu l t u r e d co r n e a l f i b r o b l a s t s i n r e s p o n se t o t r a n sf o r m i n g g r o w t h f a ct o r b e t a a n d f e t a l c a l f se r u m J B i o l C h e m 1 9 9 9 2 7 4 ( 1 1 ) : p 7 1 1 1 9 5 4 Q u a n t o ck, A J. a n d R D Y o u n g D e ve l o p m e n t o f t h e co r n e a l st r o m a a n d t h e co l l a g e n p r o t e o g l yca n a sso ci a t i o n s t h a t h e l p d e f i n e i t s s t r u ct u r e a n d f u n ct i o n D e v D yn 2 0 0 8 5 5 M a u r i ce D M T h e t r a n sp a r e n cy o f t h e co r n e a l st r o m a V i si o n R e s, 1 9 7 0 1 0 ( 1 ) : p 1 0 7 8 5 6 W e n st r u p R J. e t a l R e d u ce d t yp e I co l l a g e n u t i l i za t i o n : a p a t h o g e n i c m e ch a n i sm i n C O L 5 A 1 h a p l o i n su f f i ci e n t E h l e r s D a n l o s syn d r o m e J C e l l B i o ch e m 2 0 0 4 9 2 ( 1 ) : p 1 1 3 2 4 5 7 W e n st r u p R J. e t a l M u r i n e m o d e l o f t h e E h l e r s D a n l o s sy n d r o m e co l 5 a 1 h a p l o i n su f f i ci e n cy d i s r u p t s c o l l a g e n f i b r i l a sse m b l y a t m u l t i p l e st a g e s. J B i o l C h e m 2 0 0 6 2 8 1 ( 1 8 ) : p 1 2 8 8 8 9 5 5 8 C h a kr a va r t i D E L C a va l i e r i a n d E G R o g a n L i n e a r a m p l i f i ca t i o n m a p p i n g o f p o l ycycl i c a r o m a t i c h y d r o ca r b o n r e a ct i ve se q u e n ce s i n H r a s g e n e D N A C e l l B i o l 1 9 9 8 1 7 ( 6 ) : p 5 2 9 3 9 5 9 L i u C Y e t a l K e r a t o ca n d e f i ci e n t m i ce d i sp l a y a l t e r a t i o n s i n co r n e a l st r u ct u r e J B i o l C h e m 2 0 0 3 2 7 8 ( 2 4 ) : p 2 1 6 7 2 7 6 0 C i n t r o n C e t a l H e t e r o g e n e i t y o f c o l l a g e n s i n r a b b i t c o r n e a : t yp e I I I co l l a g e n I n ve s t O p h t h a l m o l V i s S ci 1 9 8 8 2 9 ( 5 ) : p 7 6 7 7 5 6 1 S ch m u t O T h e i d e n t i f i ca t i o n o f t yp e I I I co l l a g e n i n ca l f a n d b o vi n e co r n e a a n d scl e r a E xp E ye R e s, 1 9 7 7 2 5 ( 5 ) : p 5 0 5 9 6 2 W u F e t a l D i f f e r e n t i a l g e n e e xp r e ssi o n p a t t e r n s o f t h e d e v e l o p i n g a n d a d u l t m o u s e co r n e a co m p a r e d t o t h e l e n s a n d t e n d o n E xp E ye R e s 2 0 0 8 8 7 ( 3 ) : p 2 1 4 2 5 6 3 L i n se n m a ye r T F J. M F i t c h a n d D E B i r k, H e t e r o t yp i c co l l a g e n f i b r i l s a n d st a b i l i zi n g co l l a g e n s. C o n t r o l l i n g e l e m e n t s i n co r n e a l m o r p h o g e n e si s? A n n N Y A ca d S ci 1 9 9 0 5 8 0 : p 1 4 3 6 0 6 4 P o o l e C A N H B r o o ke s, a n d G M C l o ve r C o n f o ca l i m a g i n g o f t h e h u m a n ke r a t o cyt e n e t w o r k u si n g t h e vi t a l d y e 5 ch l o r o m e t h yl f l u o r e sce i n d i a ce t a t e C l i n E xp e r i m e n t O p h t h a l m o l 2 0 0 3 3 1 ( 2 ) : p 1 4 7 5 4 6 5 M u sse l m a n n K B P K a n e a n d J. R H a sse l l I so l a t i o n o f a p u t a t i ve ke r a t o cyt e a ct i va t i n g f a ct o r f r o m t h e co r n e a l st r o m a E xp E ye R e s, 2 0 0 3 7 7 ( 3 ) : p 2 7 3 9 6 6 Z i e ske J. D S R G u i m a r a e s, a n d A E H u t ch e o n K i n e t i cs o f ke r a t o cyt e p r o l i f e r a t i o n i n r e sp o n se t o e p i t h e l i a l d e b r i d e m e n t E xp E ye R e s, 2 0 0 1 7 2 ( 1 ) : p 3 3 9 6 7 Je st e r J. V C o r n e a l c r yst a l l i n s a n d t h e d e ve l o p m e n t o f ce l l u l a r t r a n sp a r e n cy. S e m i n C e l l D e v B i o l 2 0 0 8 1 9 ( 2 ) : p 8 2 9 3

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8 7 6 8 H e l e n a M C e t a l K e r a t o cyt e a p o p t o si s a f t e r co r n e a l su r g e r y. I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 1 9 9 8 3 9 ( 2 ) : p 2 7 6 8 3 6 9 H a n n a K D e t a l C o r n e a l st r o m a l w o u n d h e a l i n g i n r a b b i t s a f t e r 1 9 3 n m e xci m e r l a se r su r f a ce a b l a t i o n A r ch O p h t h a l m o l 1 9 8 9 1 0 7 ( 6 ) : p 8 9 5 9 0 1 7 0 S u n d a r r a j N e t a l P r o t e o g l yc a n d i st r i b u t i o n d u r i n g h e a l i n g o f c o r n e a l st r o m a l w o u n d s i n ch i ck. E xp E ye R e s 1 9 9 8 6 7 ( 4 ) : p 4 3 3 4 2 7 1 D a w so n D G H F E d e l h a u se r a n d H E G r o ssn i kl a u s, L o n g t e r m h i st o p a t h o l o g i c f i n d i n g s i n h u m a n co r n e a l w o u n d s a f t e r r e f r a ct i ve su r g i ca l p r o ce d u r e s. A m J O p h t h a l m o l 2 0 0 5 1 3 9 ( 1 ) : p 1 6 8 7 8 7 2 L j u b i m o v, A V e t a l E xt r a ce l l u l a r m a t r i x ch a n g e s i n h u m a n co r n e a s a f t e r r a d i a l ke r a t o t o m y E xp E ye R e s, 1 9 9 8 6 7 ( 3 ) : p 2 6 5 7 2 7 3 H a b e r M e t a l E f f e ct s o f g r o w t h f a ct o r s ( E G F P D G F B B a n d T G F b e t a 1 ) o n cu l t u r e d e q u i n e e p i t h e l i a l ce l l s a n d ke r a t o cyt e s: i m p l i ca t i o n s f o r w o u n d h e a l i n g V e t O p h t h a l m o l 2 0 0 3 6 ( 3 ) : p 2 1 1 7 7 4 I zu m i K e t a l I n vo l ve m e n t o f i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r I a n d i n su l i n l i ke g r o w t h f a ct o r b i n d i n g p r o t e i n 3 i n co r n e a l f i b r o b l a st s d u r i n g co r n e a l w o u n d h e a l i n g I n ve s t O p h t h a l m o l V i s S ci 2 0 0 6 4 7 ( 2 ) : p 5 9 1 8 7 5 Je st e r J. V a n d J. H o C h a n g M o d u l a t i o n o f c u l t u r e d co r n e a l k e r a t o cy t e p h e n o t yp e b y g r o w t h f a ct o r s/ cyt o ki n e s co n t r o l i n vi t r o co n t r a ct i l i t y a n d e xt r a ce l l u l a r m a t r i x co n t r a ct i o n E xp E ye R e s, 2 0 0 3 7 7 ( 5 ) : p 5 8 1 9 2 7 6 A r n o l d D R e t a l D i st r i b u t i o n o f I G F I a n d I I I G F b i n d i n g p r o t e i n s ( I G F B P s) a n d I G F B P m R N A i n o cu l a r f l u i d s a n d t i ssu e s: p o t e n t i a l si t e s o f syn t h e si s o f I G F B P s i n a q u e o u s a n d vi t r e o u s E xp E ye R e s, 1 9 9 3 5 6 ( 5 ) : p 5 5 5 6 5 7 7 L o n g C J. e t a l F i b r o b l a st g r o w t h f a ct o r 2 p r o m o t e s ke r a t a n s u l f a t e p r o t e o g l yc a n e xp r e ssi o n b y ke r a t o cyt e s i n vi t r o J B i o l C h e m 2 0 0 0 2 7 5 ( 1 8 ) : p 1 3 9 1 8 2 3 7 8 G a r a n a R M e t a l R a d i a l k e r a t o t o m y. I I R o l e o f t h e m yo f i b r o b l a st i n co r n e a l w o u n d co n t r a ct i o n I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 1 9 9 2 3 3 ( 1 2 ) : p 3 2 7 1 8 2 7 9 F u n d e r b u r g h M L M M M a n n a n d J. L F u n d e r b u r g h K e r a t o cyt e p h e n o t yp e i s e n h a n ce d i n t h e a b s e n ce o f a t t a ch m e n t t o t h e su b st r a t u m M o l V i s, 2 0 0 8 1 4 : p 3 0 8 1 7 8 0 S t r a m e r B M a n d M E F i n i U n co u p l i n g k e r a t o cyt e l o ss o f co r n e a l cr yst a l l i n f r o m m a r ke r s o f f i b r o t i c r e p a i r I n ve s t O p h t h a l m o l V i s S ci 2 0 0 4 4 5 ( 1 1 ) : p 4 0 1 0 5 8 1 M a l t se va O e t a l F i b r o b l a st g r o w t h f a ct o r r e ve r sa l o f t h e co r n e a l m yo f i b r o b l a st p h e n o t yp e I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 2 0 0 1 4 2 ( 1 1 ) : p 2 4 9 0 5 8 2 G u e r r i e r o E e t a l L o ss o f a l p h a 3 ( I V ) co l l a g e n e xp r e ssi o n a sso ci a t e d w i t h co r n e a l k e r a t o cy t e a ct i va t i o n I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 2 0 0 7 4 8 ( 2 ) : p 6 2 7 3 5 8 3 G o l d b e r g B E H E p st e i n Jr a n d C J. S h e r r P r e cu r so r s o f co l l a g e n se cr e t e d b y cu l t u r e d h u m a n f i b r o b l a s t s. P r o c N a t l A ca d S ci U S A 1 9 7 2 6 9 ( 1 2 ) : p 3 6 5 5 9

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8 8 8 4 H a sse l l J. R e t a l I n cr e a se d st r o m a l e x t r a ce l l u l a r m a t r i x sy n t h e si s a n d a sse m b l y b y i n su l i n a ct i va t e d b o vi n e k e r a t o cy t e s cu l t u r e d u n d e r a g a r o se E xp E ye R e s, 2 0 0 8 8 7 ( 6 ) : p 6 0 4 1 1 8 5 Ja r n a g i n W R e t a l E xp r e ssi o n o f va r i a n t f i b r o n e ct i n s i n w o u n d h e a l i n g : ce l l u l a r so u r c e a n d b i o l o g i ca l a ct i vi t y o f t h e E I I I A se g m e n t i n r a t h e p a t i c f i b r o g e n e si s. J C e l l B i o l 1 9 9 4 1 2 7 ( 6 P t 2 ) : p 2 0 3 7 4 8 8 6 W i l so n S E e t a l T h e co r n e a l w o u n d h e a l i n g r e sp o n s e : cyt o ki n e m e d i a t e d i n t e r a ct i o n o f t h e e p i t h e l i u m st r o m a a n d i n f l a m m a t o r y ce l l s. P r o g R e t i n E ye R e s, 2 0 0 1 2 0 ( 5 ) : p 6 2 5 3 7 8 7 F i t zsi m m o n s T D e t a l E n d o g e n o u s h ya l u r o n a n i n co r n e a l d i s e a se I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 1 9 9 4 3 5 ( 6 ) : p 2 7 7 4 8 2 8 8 G u o N e t a l A r a p i d t r a n si e n t i n cr e a se i n h y a l u r o n a n syn t h a se 2 m R N A i n i t i a t e s se cr e t i o n o f h y a l u r o n a n b y c o r n e a l k e r a t o cyt e s i n r e sp o n se t o t r a n sf o r m i n g g r o w t h f a ct o r b e t a J B i o l C h e m 2 0 0 7 2 8 2 ( 1 7 ) : p 1 2 4 7 5 8 3 8 9 F u n d e r b u r g h J. L e t a l D e co r i n a n d b i g l yca n o f n o r m a l a n d p a t h o l o g i c h u m a n co r n e a s. I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 1 9 9 8 3 9 ( 1 0 ) : p 1 9 5 7 6 4 9 0 K a o W W e t a l F o cu s o n m o l e cu l e s : l u m i ca n E xp E ye R e s, 2 0 0 6 8 2 ( 1 ) : p 3 4 9 1 B i r k, D E J. M F i t ch a n d T F L i n se n m a ye r O r g a n i za t i o n o f co l l a g e n t yp e s I a n d V i n t h e e m b r yo n i c ch i cke n co r n e a I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 1 9 8 6 2 7 ( 1 0 ) : p 1 4 7 0 7 9 2 C h a kr a va r t i S F o cu s o n m o l e cu l e s: ke r a t o ca n ( K E R A ) E xp E ye R e s, 2 0 0 6 8 2 ( 2 ) : p 1 8 3 4 9 3 P o o l e C A N H B r o o ke s, a n d G M C l o ve r K e r a t o cyt e n e t w o r ks vi su a l i se d i n t h e l i vi n g co r n e a u si n g vi t a l d ye s. J C e l l S ci 1 9 9 3 1 0 6 ( P t 2 ) : p 6 8 5 9 1 9 4 H a h n e l C e t a l T h e ke r a t o cyt e n e t w o r k o f h u m a n co r n e a : a t h r e e d i m e n si o n a l st u d y u si n g c o n f o ca l l a s e r sca n n i n g f l u o r e sc e n ce m i c r o sco p y. C o r n e a 2 0 0 0 1 9 ( 2 ) : p 1 8 5 9 3 9 5 D e l P e r o R A e t a l A r e f r a ct i ve a n d h i st o p a t h o l o g i c st u d y o f e xci m e r l a se r ke r a t e ct o m y i n p r i m a t e s. A m J O p h t h a l m o l 1 9 9 0 1 0 9 ( 4 ) : p 4 1 9 2 9 9 6 L a n ce S E e t a l D i a m o n d b u r r i n g a n d su r g i ca l ke r a t e ct o m y. M o r p h o l o g i c co m p a r i so n i n t h e r a b b i t A r ch O p h t h a l m o l 1 9 8 8 1 0 6 ( 6 ) : p 8 3 0 4 9 7 L e e R E P F D a vi so n a n d C C i n t r o n T h e h e a l i n g o f l i n e a r n o n p e r f o r a t i n g w o u n d s i n r a b b i t co r n e a s o f d i f f e r e n t a g e s. I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 1 9 8 2 2 3 ( 5 ) : p 6 6 0 5 9 8 D a w so n D G e t a l H i st o l o g i c, u l t r a st r u ct u r a l a n d i m m u n o f l u o r e sce n t e va l u a t i o n o f h u m a n l a se r a ssi st e d i n si t u ke r a t o m i l e u si s co r n e a l w o u n d s. A r ch O p h t h a l m o l 2 0 0 5 1 2 3 ( 6 ) : p 7 4 1 5 6 9 9 M a g u e n E e t a l A l t e r a t i o n s o f co r n e a l e xt r a ce l l u l a r m a t r i x a f t e r m u l t i p l e r e f r a ct i ve p r o ce d u r e s : a cl i n i ca l a n d i m m u n o h i st o ch e m i ca l st u d y. C o r n e a 1 9 9 7 1 6 ( 6 ) : p 6 7 5 8 2 1 0 0 E t h e r e d g e L B P K a n e a n d J. R H a sse l l T h e e f f e ct o f g r o w t h f a ct o r si g n a l i n g o n ke r a t o cyt e s i n vi t r o a n d i t s r e l a t i o n sh i p t o t h e p h a se s o f st r o m a l w o u n d r e p a i r I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 2 0 0 9 5 0 ( 7 ) : p 3 1 2 8 3 6

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8 9 1 0 1 C l a r k, R A e t a l T G F b e t a 1 st i m u l a t e s cu l t u r e d h u m a n f i b r o b l a st s t o p r o l i f e r a t e a n d p r o d u ce t i ssu e l i ke f i b r o p l a si a : a f i b r o n e c t i n m a t r i x d e p e n d e n t e ve n t J C e l l P h ysi o l 1 9 9 7 1 7 0 ( 1 ) : p 6 9 8 0 1 0 2 M cD o n a l d J. A D G K e l l e y, a n d T J. B r o e ke l m a n n R o l e o f f i b r o n e ct i n i n co l l a g e n d e p o si t i o n : F a b t o t h e g e l a t i n b i n d i n g d o m a i n o f f i b r o n e ct i n i n h i b i t s b o t h f i b r o n e c t i n a n d c o l l a g e n o r g a n i z a t i o n i n f i b r o b l a st e xt r a ce l l u l a r m a t r i x. J C e l l B i o l 1 9 8 2 9 2 ( 2 ) : p 4 8 5 9 2 1 0 3 V e l l i n g T e t a l P o l ym e r i za t i o n o f t y p e I a n d I I I co l l a g e n s i s d e p e n d e n t o n f i b r o n e ct i n a n d e n h a n ce d b y i n t e g r i n s a l p h a 1 1 b e t a 1 a n d a l p h a 2 b e t a 1 J B i o l C h e m 2 0 0 2 2 7 7 ( 4 0 ) : p 3 7 3 7 7 8 1 1 0 4 H a sse l l J. R D A N e w so m e a n d V C H a sca l l C h a r a ct e r i za t i o n a n d b i o syn t h e si s o f p r o t e o g l yca n s o f co r n e a l st r o m a f r o m r h e s u s m o n k e y. J B i o l C h e m 1 9 7 9 2 5 4 ( 2 4 ) : p 1 2 3 4 6 5 4 1 0 5 Je st e r J. V e t a l T h e ce l l u l a r b a si s o f co r n e a l t r a n sp a r e n cy: e vi d e n c e f o r co r n e a l cr yst a l l i n s J C e l l S ci 1 9 9 9 1 1 2 ( P t 5 ) : p 6 1 3 2 2 1 0 6 P e i Y R Y R e i n s, a n d A M M cD e r m o t t A l d e h yd e d e h y d r o g e n a se ( A L D H ) 3 A 1 e xp r e ssi o n b y t h e h u m a n ke r a t o c yt e a n d i t s r e p a i r p h e n o t yp e s E xp E ye R e s, 2 0 0 6 8 3 ( 5 ) : p 1 0 6 3 7 3 1 0 7 B e r r yh i l l B L e t a l I n cr e a se d S P A R C a ccu m u l a t i o n d u r i n g co r n e a l r e p a i r E xp E ye R e s 2 0 0 3 7 7 ( 1 ) : p 8 5 9 2 1 0 8 F i n i M E K e r a t o cyt e a n d f i b r o b l a st p h e n o t yp e s i n t h e r e p a i r i n g co r n e a P r o g R e t i n E ye R e s, 1 9 9 9 1 8 ( 4 ) : p 5 2 9 5 1 1 0 9 E sp a n a E M e t a l H u m a n ke r a t o cyt e s c u l t u r e d o n a m n i o t i c m e m b r a n e st r o m a p r e se r ve m o r p h o l o g y a n d e xp r e ss k e r a t o ca n I n v e st O p h t h a l m o l V i s S ci 2 0 0 3 4 4 ( 1 2 ) : p 5 1 3 6 4 1 1 1 0 B e r r yh i l l B L e t a l P a r t i a l r e st o r a t i o n o f t h e ke r a t o cyt e p h e n o t yp e t o b o vi n e ke r a t o cyt e s m a d e f i b r o b l a st i c b y se r u m I n ve st O p h t h a l m o l V i s S ci 2 0 0 2 4 3 ( 1 1 ) : p 3 4 1 6 2 1 1 1 1 D u Y e t a l M u l t i p o t e n t s t e m ce l l s i n h u m a n co r n e a l st r o m a S t e m C e l l s, 2 0 0 5 2 3 ( 9 ) : p 1 2 6 6 7 5

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9 0 A p p e n d i c e s

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9 1 A p p e n d i x A P e p si n r e a d i l y d e g r a d e s g l o b u l a r p r o t e i n s, b u t t h e t r i p l e h e l i ca l d o m a i n s o f co l l a g e n a r e r e si st a n t t o t h i s p r o t e a se A l i q u o t s o f p e p si n d i g e st e d m e d i a a n d ce l l l a ye r s, n o r m a l i ze d f o r D N A h a r ve st e d f r o m t h e d a y 7 1 0 a n d 1 3 t i m e p o i n t s w e r e f r a c t i o n a t e d o n S D S / P A G E a n d t h e co l l a g e n o u s p r o t e i n s vi su a l i ze d b y si m p l y b l u e st a i n i n g ( F i g 2 6 ) S i m i l a r t o t h a t se e n f o r t h e p r o t e o g l yca n s, t h e m e d i a ( M ) f r o m t h e I G F 1 cu l t u r e s co n t a i n e d s u b st a n t i a l l y h i g h e r a m o u n t s o f t h e a 1 ( I ) a 2 ( I ) a n d a 1 ( V ) c h a i n s o f c o l l a g e n t h a n t h e co n t r o l c u l t u r e s a n d m e d i a f r o m t h e d a ys 1 0 a n d 1 3 i n su l i n cu l t u r e s co n t a i n e d sl i g h t l y h i g h e r l e ve l s o f t h e se co l l a g e n s t h a n t h e I G F 1 cu l t u r e s. T h i s d a t a d e m o n st r a t e t h a t i n su l i n a n d I G F I st i m u l a t e ke r a t o cyt e s t o syn t h e si ze si m i l a r l e v e l s o f co l l a g e n F i g u r e 2 6 S D S / P A G E / B l u e st a i n o f p e p si n d i g e st s f r o m ke r a t o cyt e cu l t u r e s. K e r a t o cyt e s w e r e cu l t u r e d i n m e d i a a l o n e ( C ) o r i n m e d i a co n t a i n i n g e i t h e r I G F I ( I G ) o r i n su l i n ( I N ) C u l t u r e s w e r e h a r ve st e d o n d a y 7 1 0 a n d 1 7 T h e m e d i a ( M ) a n d ce l l l a ye r s ( C L ) w e r e d i g e st e d w i t h p e p si n p r i o r t o e l e ct r o p h o r e si s.

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A b o u t t h e A u t h o r L a T i a S h a q u a n E t h e r e d g e w a s b o r n o n S e p t e m b e r 2 1 1 9 8 4 i n W a sh i n g t o n D C S h e w a s r a i se d i n F o r t W a s h i n g t o n M a r yl a n d w h e r e sh e co m p l e t e d g r a d e sch o o l S h e g r a d u a t e d f r o m V i r g i n i a U n i ve r si t y C u m L a u d e w i t h a B a ch e l o r o f S ci e n ce i n C h e m i st r y a n d a m i n o r i n B i o l o g y D u r i n g h e r u n d e r g r a d u a t e st u d i e s sh e co m p l e t e d su m m e r i n t e r n sh i p s a t t h e U n i ve r si t y o f P u e r t o R i co ( R i o P i e d r a s C a m p u s) T e xa s A & M U n i ve r si t y, a n d U n i ve r si t y o f V i r g i n i a H e r u n d e r g r a d u a t e e xp e r i e n ce s f o st e r e d h e r i n t e r e st s i n B i o m e d i ca l S ci e n ce T o t h i s e n d s h e j o i n e d t h e l a b o f D r Jo h n R H a sse l l t o p u r su e h e r P h D i n M e d i ca l S ci e n ce s w i t h a co n ce n t r a t i o n i n P a t h o l o g y a n d C e l l B i o l o g y


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WW 220
b E84e 2009
1 100
Etheredge, LaTia Shaquan.
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The effect of growth factors on the corneal stroma extracellular matrix production by keratocytes /
by LaTia Shaquan Etheredge.
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2009.
300
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ill. (some col.) ;
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Includes vita.
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Also available online.
520
ABSTRACT: The corneal wound healing process is a complex process, which often leads to the development of scar tissue with loss of transparency. When the cornea is wounded, some of the viable keratocytes are activated by growth factors to proliferate, and repair the wound by the production of a new extracellular matrix (ECM) that is either normal or is disorganized (fibrotic). The first part of this dissertation aims to show that the growth factors IGF-I, TGF-, FGF-2, and PDGF stimulate keratocytes to synthesize different levels of collagens and proteoglycans and are therefore responsible for initiating the wound healing repair process. FGF-2 stimulated keratocytes to proliferate but did not stimulate collagen production; IGF-I and PDGF stimulated keratocytes to proliferate and produce a collagenous ECM that could restore transparency; while, TGF- stimulated keratocytes produce a fibrocollagenous ECM that is opaque.The second part of this dissertation aims to evaluate collagen fibril content, distribution, and orientation in the ECM deposited by keratocytes cultured in IGF-I, TGF-, FGF-2, and PDGF under a layer of agarose: a culture modification that enhances the formation of ECM in vitro. FGF-2 agarose cultures had little ECM and the keratocytes were in close cell contact while IGF-I, TGF-, and PDGF agarose cultures had the least cell contact with an extensive fibrillar ECM. This newly developed agarose overlay cell culture system increases ECM formation with the cell layer only when the synthesis of collagen is stimulated and that the ECM morphology is growth factor specific. Cell culture has proven to be a reliable technique to study the keratocytes response to trauma and disease; however, limitations exist. Primary keratocytes that possess quiescent phenotype are unable to be rapidly expanded or subcultured without the addition of a mitogen(s).Most commonly, keratocytes are cultured and passaged in the presence of fetal bovine serum (FBS), which activate the cells to proliferate and differentiate into fibroblasts or myofibroblasts as well as lose expression of their unique transparency enabling gene products. The third part of this dissertation aims to develop a defined culture media that can be used to expand and subculture keratocytes that express keratocyte specific markers. Culture medium supplemented with FGF-2 combined with ITS was used to: expand and subculture primary bovine keratocytes while maintaining their expression of keratocan and to restore keratocan expression to bovine keratocytes expanded and subcultured with media containing 2.5% FBS. This dissertation shows the significance of signaling molecules in vitro to produce keratocyte cultures useful for understanding normal stromal biology and its repair process.
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Advisor: John R. Hassell, Ph.D.
2 650
Cornea
x injuries.
Cornea
cytology.
Corneal Stroma
cytology.
Wound Healing.
Extracellular Matrix.
Cell Proliferation.
653
Cornea
Proteoglycans
Extracellular matrix
Wound healing
Collagen
0 690
Dissertations, Academic
z USF
Pathology and Cell Biology
Doctoral.
773
t USF Electronic Theses and Dissertations.
856
u http://digital.lib.usf.edu/?e14.3238